一株葡糖醋杆菌及其作为植物促生菌的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及促生菌生物技术领域，具体涉及一株葡糖醋杆菌及其作为植物促生菌 应用的技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着我国工业化和现代化的发展，耕地面积逐年锐减。肥料在保障我国粮食安全 和国家安全方面发挥着重大的作用。自20世纪60年代以来，化肥的使用对我国农业的增 产、增收起到了巨大作用，但随着化肥的大量使用，不仅利用率和增产作用急剧下降，而且 还带来了严重的环境污染（如土壤酸化、板结，水体污染）、食品安全（硝酸盐含量超标、重 金属残留）、资源消耗等问题，亟需研发环境友好的新型肥料，以实现农业的可持续发展。
[0003]植物促生菌（Plant growth-promoting microorganisms，简称 PGPM)是指能促进 植物生长的微生物。以植物促生菌为核心的微生物肥料，是一种绿色、环保的新型肥料，具 有提高土壤肥力、促进作物生长、抑制土传病害、增加作物产量、提升作物品质、改良土壤结 构、减少化肥用量、提高化肥利用率、净化环境、维持生态平衡等作用。
[0004] 在我国面临能源危机、资源紧缺、环境污染等压力的当下，为了实现农业的可持续 发展，研究和应用以植物促生菌为核心的微生物肥料是一条必由之路。我国自2008年起， 已将微生物肥料列为新兴产业和生物产业给予全方位的支持，为我国微生物肥料进一步发 展提供了良好的机遇。近年来，我国微生物肥料行业发展迅猛，已逐渐成为肥料家族中的重 要成员，并逐步成为中国国家生态示范区、绿色和有机农产品基地等肥料的主力军，正在农 业生产中发挥着越来越明显的经济效益、社会效益和生态效益。
[0005] 但是在微生物肥料产业中，多年来使用的菌种均为芽孢杆菌、假单胞菌等，存在着 菌种单一、应用效果不稳定等问题，制约着微生物肥料行业的健康发展。亟需筛选新的、活 性高、功能稳定的菌种，以促进微生物行业的蓬勃发展。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种葡糖醋杆菌及其应用，该菌具有固氮、解磷、解钾、分泌 吲哚乙酸、拮抗病原菌等能力，且在土壤中具有定殖能力和磷转换能力，可应用于植物促生 菌剂或微生物肥料的制备，从而弥补现有微生物肥料菌种单一、应用效果不稳定等不足。
[0007] 本发明首先提供一种葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter sp) qzrl4,其于2015年6 月16日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0. 10983。
[0008] 上述的葡糖醋杆菌qzrl4在制备肥料中的应用，包括有如下的应用：
[0009] 所述的菌株具有较好的溶磷作用。
[0010] 所述的菌株具有固氮作用。
[0011] 所述的菌株具有解钾作用。
[0012] 所述的菌株还可以用于合成吲哚乙酸。
[0013] 所述的菌株在制备抑制尖孢镰刀菌制剂中的应用。
[0014] 所述的菌株在制备促植物生长的制剂的应用。
[0015] 所述的制剂为促进氮元素吸收的制剂、促进磷元素吸收的制剂、促进钾吸收的制 剂、促吲哚乙酸合成的制剂、抑制尖孢镰刀菌生长的制剂中的任一种或几种。
[0016] 所述的制剂为微生物菌剂或微生物肥料。
[0017] 本发明还提供一种微生物菌制剂，使用上述的菌株发酵制备的。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0019] 本发明提供的葡糖醋杆菌qzrl4,是以磷酸钙作为唯一 P源的培养基对从茄子的 根际土中的微生物进行筛选分离，得到的能够以磷酸钙作为唯一 P源生长的微生物，检测 结果表明该菌是一种能够降解无机磷的新的葡糖醋杆菌，分类命名为Gluconacetobacter SP〇
[0020] 本发明提供的葡糖醋杆菌qzrl4,由于其能将土壤中不溶性磷转换为可被植物直 接吸收、利用的有效磷，因而可促进作物生长。
[0021] 本发明提供的葡糖醋杆菌qzrl4,还具有固氮作用、解钾作用，还能够合成吲哚乙 酸、拮抗尖孢镰刀菌，且能够在土壤中有效定殖，并可在土壤中发挥磷转换能力，能够促进 植物对氮和钾的吸收，为植物提供吲哚乙酸，从而起到促植物生长的作用，还可抑制枯萎病 病原菌尖孢镰刀菌的生长，因而具有防治植物病害的作用。因此，虽然该菌是从茄子根际土 中所筛选分离到的，由于上述作用所具有的促植物生长的共性，所以该菌还能够作为一种 广泛的促生菌应用于其他植物当中。
[0022] 本发明提供的葡糖醋杆菌qzrl4,对黄瓜苗的鲜重、干重和株高具有显著的促进作 用。经葡糖醋杆菌qzr 14处理的黄瓜苗，在20天时，与对照相比，鲜重增加57. 01 %，干重增 加98. 46 %，株高增加27. 56 %。
【附图说明】
[0023] 图1 :葡糖醋杆菌qzrl4在解无机磷平板、牛肉膏蛋白胨平板和孔雀绿平板上的生 长形态。
[0024] 图2:葡糖醋杆菌qzrl4的解磷能力。
[0025] 图3:葡糖醋杆菌qzrl4的解磷机制。
[0026] 图4:葡糖醋杆菌qzrl4在固氮平板、解钾平板、CAS平板上的生长形态。
[0027] 图5:葡糖醋杆菌qzrl4分泌吲哚乙酸的能力。
[0028] 图6 :葡糖醋杆菌qzrl4对尖孢镰刀菌的拮抗作用。
[0029] 图7:葡糖醋杆菌qzrl4对对黄瓜苗干重、鲜重和株高的影响。
[0030] 图8:葡糖醋杆菌qzrl4在土壤中的定殖能力。
[0031]图9 :葡糖醋杆菌在土壤中的解磷能力。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0033] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，本领域的普通技 术人员在本发明公开内容的基础上可以选择本领域其它常用的方法来替代说明书具体实 施例中采用的方法。
[0034] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035] 实施例1、葡糖醋杆菌qzr 14的分离和鉴定
[0036] 1、葡糖醋杆菌qzr 14的分离
[0037] 葡糖醋杆菌qzrl4的分离包括取样，筛选和纯化两个步骤，具体方法如下：
[0038] 1. 1、取样
[0039] 从茄子的根际土中进行筛选，具体的供试茄子及土壤取于辽宁省鞍山市千山区唐 家房镇（土壤理化性质如下：pH 8. 15,全盐含量1. 83%，碱解氮36mg/kg，有效磷8mg/kg， 速效132mg/kg，有机质2. 69% )。将前子根际土壤装入事先准备好的干净保鲜袋中，带回实 验室种植待测。
[0040] 1.2、筛选和纯化
[0041] 称取lg根际土壤样品，置于9ml无菌水中高速震荡制成土壤菌悬液，将梯度稀释 的土壤悬液涂布在无机磷固体培养基（氯化钠0. 3g，七水硫酸镁0. 3g，氯化钾0. 3g，硫酸 铵0. 5g，七水硫酸亚铁0. 003g，四水硫酸锰0. 003g，磷酸三钙5. 0g，葡萄糖10g，琼脂18g， 蒸馏水1L，pH 7. 0-7. 5)上，倒置于生化培养箱中30°C培养3天。挑取平板上透明圈较明 显的菌落在无机磷固体培养基上进行重复划线分离纯化，得到单一菌落。
[0042] 2、葡糖醋杆菌qzrl4的鉴定
[0043] 对上述分离纯化得到的纯培养菌株进行一系列生理生化鉴定，同时在0. 01%孔雀 绿琼脂培养基上进行了培养，并进行DNA提取，16S rDNA的扩增和测序。
[0044] 0.01%孔雀绿琼脂培养基成分：牛肉膏0.58，蛋白胨18，氯化钠0.58，琼脂2 8， 0.01%孔雀绿，水1001111，？11 = 7.4。30°(：摇床培养3~7(1。
[0045] 2. 1该菌株在牛肉膏培养基上为微小菌落，表面光滑，颜色透明，菌落边缘整齐。革 兰氏染色为阴性，细胞呈短杆状。在解无机磷培养基上形成圆形、乳白色、不透明、边缘整齐 的菌落。该菌株可在0.01%孔雀绿琼脂培养基上生长，形成圆形、透明的微小菌落。结果如 图1所示。
[0046] 2. 2 利用引物 27F (5, -AGAGTITGATCCTGGCTCAG-3')和 1492R (5, -TACGGCTACCTTG TTACGACTT-3')对葡糖醋杆菌qzrl4的16S rDNA进行扩增：
[0047] PCR反应体系为25 y L，具体成分如下：
[0048] 2 x Master Mix (TaKaRa) 12.5 uL 前引物（2.5pmol/jiL) 1 jiL /l)J 引物（2_5pmol/pL) 1 {.iL DNA模板 1叫 dH2G 9.5 jiiL
[0049] ?0?扩增条件为：94￡€31^11;94 1€3〇8,551€3〇8,721€9〇8,30个循环；72°(：1〇111111。
[0050] 对PCR扩增产物进行测序，测序结果已提交至NCBI，Accession number KP715459。
[0051] 将上述获得的纯培养菌株中的一株命名为葡糖醋杆菌qzrl4,并将其保藏。保藏时 间：2015年6月16日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究 所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC);保藏号为CGMCC NO. 10983。
[0052] 实施例2、葡糖醋杆菌qzrl4的解磷活性测定
[0053] 溶磷圈：用葡糖醋杆菌qzrl4菌液浸湿滤纸片，并放置在无机磷固体培养基平板 上，30°C培养4天，测量溶磷圈直径（D)和菌落直径（d)。
[0054] 溶磷量：将葡糖醋杆菌qzrl4在牛肉膏蛋白胨液体培养基中30°C，180rpm过夜培 养。用牛肉膏蛋白胨液体培养基将菌浓度稀释至IX 10s个/ml，以10%接种量接入无机磷 液体培养基中。以接入10%牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，每个处理设三个重复。30°C， 180rpm在摇床上培养4天后，将发酵液lOOOOrpm离心10min，取上清，在波长690nm下，采 用钼锑抗比色法测定可溶性磷含量，具体步骤如下：
[0055] (a)取上清5-10ml (视上清中磷含量而定），置于50ml量瓶中，加入7. 5N硫酸钼 铺抗混合显色剂5ml，加去离