专利名称：检测维生素c生产菌株传代培养过程中营养环境变化的方法
技术领域：
本发明 属于工业微生物领域，涉及一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法。
背景技术：
目前，我国生产维生素C的方法为“二步发酵法”，第一步发酵使用黑醋杆菌将山梨醇转化为L-山梨糖，第二步发酵为巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌混合发酵，将山梨糖转化为维生素C的前体2-酮基-L-古龙酸。其中，第二步发酵中前者为伴生菌，后者为产酸菌。两菌在混合发酵的过程中，通过相互作用促进产酸菌的生长和产酸。通过混菌传代培养，混菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸的能力得到提高，但其作用机理尚不明确。随着高通量的现代仪器分析技术和化学计量学方法的发展，过程分析技术(PAT)可以有效地应用于生物发酵过程中营养环境变化的研究。在两菌长期的混合培养中，它们之间的交流使得培养液的营养环境不断的发生变化，进而传递到胞内，产生一系列不同的生长及发酵行为。如果采用PAT技术研究两菌传代培养，特别是在不断强化相互作用的过程中，检测出培养基中营养环境的变化情况，将为揭示传代培养强化两菌相互作用促进产酸的作用机制提供有利信息，并为进一步优化生产工艺等提供支持。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法。本发明的技术方案概述如下—种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法，包括如下步骤(I)混菌传代培养①固体培养取存于液氮的10-500 μ L保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和10-500 μ L保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上,28_35°C,培养24-48h ；②种子培养将经步骤(I)①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35°C，200-280r/min摇床振荡培养24-48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到一个新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2X107-2X101(lCFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为2X 108_2X 10nCFU/mL，在28-35°C，200-280r/min摇床振荡混菌培养，以24_48h为传代周期，以体积比为1% -10%为传代比接入新的种子培养基中，传代100-150天得到混菌细胞，在传代0-100天或0-150天中选定3-4个时间取样,取3-4个样；
③分纯将步骤(I)②获得的3-4个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，28-35°C培养24-48h ;再分别转入新的种子培养基，在28-35 °C，200-280rpm摇床振荡培养24-48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中；④发酵将步骤(I)③获得的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2X 107-2X 101(lCFU/mL，氧化葡糖杆菌的密度为2X 108-2X 10nCFU/mL，在28-35 °C，200_280r/min摇床振荡培养10-15h ；(2)营养环境中物质的测定①培养液的收集分别取步骤(I)④获得的巨大芽孢杆菌培养液、氧化葡糖杆菌培养液和混菌体系培养液l_2mL，以5000-10000rpm的转速离心，收集上清，并用O. 22 μ m纤维素微孔滤膜过滤，得滤液；②样品制备取步骤⑵①获得的滤液10-50 μ L置于离心管中，加入50-200 μ L的O. 04-0. 14mg/ml氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，冷冻干燥；加入40-100 μ L浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30°C _40°C水浴中肟化反应60_120min ;再加入50-100 μ LN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35°C _40°C水浴进行硅烷化反应30_60min ；③GC-TOFMS 检测将IyL步骤⑵②获得的样品进到气相色谱仪中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30mX0. 25mm i.d.，进样口温度为250 °C _280°C，载气为高纯氦气，流速O. 6-0. 8ml/min，分流比3 1-20 1，柱温箱升温程序为初始50°C _80°C，保持2min_5min,以 4°C /min_8°C /min 的速度升到 260°C -300°C,保持 3min_8min,使用 EI 电离源，源温 230°C -260°C，检测器电压 2300V-2700V，电离电压 60eV_80eV，电流 30 μ Α-50 μ A ；质谱检测范围50-800m/z ;营养环境物质的鉴定使用NIST 2005数据库，质谱数据的处理和营养环境物质相对含量的测定使用Masslynx 4. I软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到营养环境物质的相对含量；(3)主成分分析①将步骤⑵获得的营养环境物质的相对含量的数据进行Pareto预处理；②用Metlab 7. O (Mathworks. Inc.)软件对步骤(3)①预处理后的数据进行主成分分析，得到差异营养环境标志物；(4)过程分析将差异营养环境标志物的相对含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析这些物质变化的规律，检测出维生素C生产菌株传代过程中营养环境的变化。利用本发明的方法可以从揭示混菌传代培养对巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌以及混菌体系产生的影响，找到影响传代培养营养环境中的重要物质，这些物质含量的变化规律为了解传代培养促进氧化葡糖杆菌生长及2-酮基-L-古龙酸生产的作用机理提供依据，从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量提供理论基础。
图I为不同传代时间的氧化葡糖杆菌营养环境的主成分分析得分图(图1-1)和载荷图(图1-2)；图2为不同传代时间的氧化葡糖杆菌传代培养过程中营养环境标志物的变化图；图3为不同传代时间的巨大芽孢杆菌营养环境物质的主成分分析得分图(图3-1)和载荷图(图3-2)；图4为不同传代时间的巨大芽孢杆菌传代培养过程中营养环境标志物的变化图；图5为不同传代时间的混菌营养环境物质的主成分分析得分图(图5-1)和载荷图(图5-2)；图6为不同传代时间的混菌传代培养过程中营养环境中差异物质的变化具体实施例方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明实施例I一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法，包括如下步骤(I)混菌传代培养①固体培养取存于液氮的500 μ L保藏于体积浓度为15 %的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和500 μ L保藏于体积浓度为15 %的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)分别接种于固体培养基上,28°C,培养24h ;②种子培养将经步骤(I)①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28°C,200r/min摇床振荡培养24h，得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2 X 107CFU/mL,使氧化葡糖杆菌的密度为2 X 108CFU/mL,在28°C，200r/min摇床振荡培养，以24h为传代周期，以体积比为1%为传代比接入新的种子培养基中，传代150天得到混菌细胞，在传代0-150天中选定4个取样时间分别为O天、50天、100天、150天取4个样；③分纯将步骤(I)②获得的4个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，28°C培养24h ;再分别转入新的种子培养基，在28°C，200rpm摇床振荡培养24h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15%的甘油水溶液中；
④发酵将步骤(I)③获得的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2X107CFU/mL，氧化葡糖杆菌的密度为2X 108CFU/mL，在28°C，200r/min摇床振荡培养IOh ；(2)营养环境中物质的测定①培养液的收集分别取步骤(I)④⑤获得的巨大芽孢杆菌培养液、氧化葡糖杆菌培养液和混菌体系培养液ImL,以5000rpm的转速离心,收集 上清,并用O. 22 μ m纤维素微孔滤膜过滤；②样品制备取步骤(2)①获得的滤液10 μ L置于离心管中，加入50 μ L的O. 04mg/ml氣标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，冷冻干燥；加入40 μ L浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30°C水浴中肟化反应60min ;再加入50 μ LN-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺于35 °C水浴进行硅烷化反应30min ；③GC-TOFMS 检测将IyL步骤(2)③获得样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30mX0. 25mm i. d.，进样口温度250°C，载气为高纯氦气，流速O. 6ml/min，分流比3 1，柱温箱升温程序为初始50°C，保持2min，以4°C /min的速度升到260°C，保持3min，使用EI电离源，源温230°C，检测器电压2300V，电离电压60eV，电流30 μ A ;质谱检测范围50-800m/z ;营养环境物质的鉴定使用NIST 2005数据库，质谱数据的处理和营养环境物质相对含量的测定使用Masslynx 4. I软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到营养环境物质的相对含量；(3)主成分分析①将步骤⑵获得的营养环境物质的相对含量的数据进行Pareto预处理；②用Metlab 7. O (Mathworks. Inc.)软件对步骤(3)①预处理后的数据进行主成分分析，得到差异营养环境标志物；得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，用来比较不同代数巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌和混菌体系传代培养过程中营养环境的相似和差异；在载荷图中，每个点表示各营养成分，距离中心点距离越远的物质，其在传代培养的过程中的差异就越大，便可作为传代培养营养环境变化的标志物；见图I、图3和图5。(4)过程分析将差异营养环境标志物的相对含量按照不同传代时间制成图表图2、图4和图6,观察并分析这些物质变化的规律，检测出维生素C生产菌株传代过程中营养环境的变化，进而发现在混菌传代培养过程中起关键作用的营养环境成分，从而为揭示混菌传代培养过程中两菌的相互作用机制和培养条件优化提供了方向。表I氧化葡糖杆菌传代培养过程中营养环境物质鉴定表
权利要求
1.一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法，包括如下步骤 (1)混菌传代培养 ①固体培养 取保藏于体积浓度为15-30 %的甘油水溶液中的氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)和保藏于体积浓度为15-30 %的甘油水溶液中的巨大芽孢杆菌(BaciIIusmegaterium)分别接种于固体培养基上，28_35°C，培养24_48h ； ②种子培养 将经步骤(I)①培养的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌分别转入种子培养基，在28-35°C，200-280r/min摇床振荡培养24_48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液； 将巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌接种到ー个新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为 2X 107-2X 101QCFU/mL，使氧化葡糖杆菌的密度为 2 X 108_2 X 10nCFU/mL，在 28_35°C，200-280r/min摇床振荡混菌培养，以24_48h为传代周期，以体积比为1% -10%为传代比接入新的种子培养基中，传代100-150天得到混菌细胞，在传代0-100天或0-150天中选定3-4个时间取样,取3-4个样； ③分纯 将步骤(I)②获得的3-4个样的混菌细胞划线分纯后再分别接种于固体培养基上，28-35 V培养24-48h ;再分别转入新的种子培养基，在28-35 V，200-280rpm摇床振荡培养24-48h，分别得到巨大芽孢杆菌种子液和氧化葡糖杆菌种子液；保藏于体积浓度为15-30%的甘油水溶液中； ④发酵 将步骤(I)③获得的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌以及将两种菌混合在一起的混合菌，分别接种到新的种子培养基中，使巨大芽孢杆菌的密度为2X107-2X101(lCFU/mL，氧化葡糖杆菌的密度为2X 108-2X 10nCFU/mL，在28-35 °C，200_280r/min摇床振荡培养10-15h ； (2)营养环境中物质的测定 ①培养液的收集 分别取步骤(I)④获得的巨大芽孢杆菌培养液、氧化葡糖杆菌培养液和混菌体系培养液l_2mL，以5000-10000rpm的转速离心，收集上清，并用O. 22 μ m纤维素微孔滤膜过滤，得滤液； ②样品制备 取步骤(2)①获得的滤液10-50yL置于离心管中，加入50-200yL的O. 04-0. 14mg/ml氘标记的琥珀酸甲醇溶液为内标物，冷冻干燥；加入40-100 μ L浓度为20mg/mL的甲氧基胺盐酸盐的吡啶溶液于30°C -40°C水浴中肟化反应60-120min ;再加入50-100 μ LN-甲基-N-三甲基硅烷三氟こ酰胺于35°C _40°C水浴进行硅烷化反应30-60min ； ③GC-TOFMS检测 将IyL步骤(2)②获得的样品进到气相色谱仪中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m X O. 25mm i. d.，进样ロ温度为250°C _280°C，载气为高纯氦气，流速O. 6-0. 8ml/min，分流比3 1-20 1，柱温箱升温程序为初始50°C _80°C，保持2min_5min，以.4 V /min-8 V /min的速度升到260 V -300 V，保持3min_8min，使用EI电离源，源温.230°C-260°C，检测器电压2300V-2700V，电离电压60eV_80eV，电流30 μ Α-50 μ A ;质谱检测范围50-800m/z ;营养环境物质的鉴定使用NIST 2005数据库，质谱数据的处理和营养环境物质相对含量的测定使用Masslynx 4. I软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到营养环境物质的相对含量； (3)主成分分析 ①将步骤(2)获得的营养环境物质的相对含量的数据进行Pareto预处理； ②用Metlab7. O (Mathworks. Inc.)软件对步骤(3)①预处理后的数据进行主成分分 析，得到差异营养环境标志物； (4)过程分析 将差异营养环境标志物的相对含量按照不同传代时间制成图表，观察并分析这些物质变化的规律，检测出维生素C生产菌株传代过程中营养环境的变化。
全文摘要
本发明公开了一种检测维生素C生产菌株传代过程中营养环境变化的方法，包括如下步骤(1)混菌传代培养；(2)营养环境中物质的测定；(3)主成分分析；(4)过程分析。利用本发明的方法可以从揭示混菌传代培养对巨大芽孢杆菌、氧化葡糖杆菌以及混菌体系产生的影响，找到影响传代培养营养环境中的重要物质，这些物质含量的变化规律为了解传代培养促进氧化葡糖杆菌生长及2-酮基-L-古龙酸生产的作用机理提供依据，从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量提供理论基础。
文档编号C12R1/11GK102634562SQ201210109628
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者任恒千, 元英进, 胡梦龙, 邹旸, 高赟 申请人:天津大学