专利名称：瓜类果斑病菌交叉引物恒温扩增检测用引物及方法
技术领域：
本发明“瓜类果斑病菌交叉弓I物恒温扩增检测用弓I物及方法”，专用于检测瓜类果斑病菌,属于植物检疫技术领域,涉及生物检测技术。
背景技术：
瓜类果斑病自1989年在美国的西瓜种植区被发现后，已经在世界范围内广泛发生，给农业生产造成了严重经济损失。瓜类果斑病病原为Acidovorax citrulli,是我国进境植物检疫性有害生物，可通过种子进行远距离传播。其主要寄主包括西瓜、甜瓜、哈密瓜、西葫芦等葫芦科作物，染菌种子是疫情爆发的主要原因。控制病害发生的最佳途径是种植健康的种子。该病菌的检测方法主要有种植观察、分离培养、酶联免疫吸附法、实时荧光PCR等。但以上检测手段存在着操作过程耗时长、仪器配置昂贵等不利于在基层单位推广的制 约因素。根据瓜类果斑病菌16S rDNA序列设计了 5条引物，建立了瓜类果斑病菌交叉引物恒温扩增检测技术，反应结束后利用封闭式的胶体金标记DNA检测装置进行结果判定。
发明内容
技术问题本发明的目的在于提供用于瓜类果斑病菌交叉引物恒温扩增检测用引物序列及方法，以达到快速、准确检测瓜类果斑病菌的目的。本发明是这样实现的本发明通过分析已报道的瓜类果斑病菌16S rDNA序列(GenBankAY702093. I)分别设计了 5条引物。经过一步恒温扩增后,扩增产物通过商品化一次性全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置进行结果判读，即可判断检测样品中是否含有瓜类果斑病菌。技术方案本发明涉的瓜类果斑病菌交叉引物恒温扩增检测方法包括如下步骤I)用于检测瓜类果斑病菌的样品制备利用商业化植物DNA提取试剂盒提取样品总DNA或通过分离得到细菌菌液为模板。2)用于检测瓜类果斑病菌的一套交叉扩增引物本发明通过分析已报道瓜类果斑病菌16S rDNA序列，分别设计了 5条引物，其核苷酸序列如下ACLF3 :5’ -GGCTAACTACGTGCCAGC-3’ACLB3 :5， -ACGCATTTCACTGCTACA-3’ACLBIP :5’ -CAGATGTGAAATCCCCGGGCTCTGCCGTACTCCAGCGAT-3’ACDF5bl :5’ -GCAAGCGTTAATCGGAATTACT-3’ACDF5f2 5，-CAACCTGGGAACTGCATTTGT-3，
其中引物ACDF5bI的5端生物素标记，引物ACDF5f2的5端FITC标记。3)恒温扩增的反应体系20 u I的反应体系中包含0. 8iimol/L交叉引物ACLBIP ；0. lymol/L正向检测弓I物ACDF5bl (5端生物素标记),0. 3 u mol/L反向检测弓I物ACDF5f2 (5端FITC标记)，各
0.liimol/L 的两条置换引物 ACLF3 和 ACLB3，0.4mmol/L dNTP,2u I IOX 反应缓冲液；8 个单位的Bst DNA聚合酶，2mmol/L MgSO4,以及4 yl的目标DNA。4)恒温扩增程序扩增反应为63 °C，60min。5)扩增产物结果判读扩增产物通过商品化一次性全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置进行结果判读。通过观察试纸条的检测条带和质控条带的显色与否进行结果判读。
图I运用交叉引物恒温扩增检测瓜类果斑病菌灵敏度的测试实验结果。(I :3. 7X105cfu/ml,2 :3. 7X 104cfu/ml, 3 :3. 7X 103cfu/ml,4 :空白对照)。图2运用交叉引物恒温扩增技术对西瓜种子中瓜类果斑病菌检测的代表性实验结果(1-6为带菌西瓜种子检测结果，7为空白对照)。
具体实施例方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例I引物的设计和合成根据瓜类果斑病病菌16S rDNA序列设计了 5条引物，引物序列为ACLF3 :5’ -GGCTAACTACGTGCCAGC-3’ACLB3 :5’ -ACGCATTTCACTGCTACA-3’ACLBIP :5，-CAGATGTGAAATCCCCGGGCTCTGCCGTACTCCAGCGAT-3，ACDF5bl :5’ -GCAAGCGTTAATCGGAATTACT-3’ACDF5f2 :5， -CAACCTGGGAACTGCATTTGT-3，其中ACLF3和ACLB3为置换引物，ACLBIP为交叉引物，ACDF5bl为正向检测引物，5端生物素标记，A⑶F5f2为反向检测引物，5端FITC标记。实施例2交叉引物扩增方法的建立以商业化植物DNA提取试剂盒提取的样品总DNA或分离得到细菌菌液为模板，20iil的反应体系中包含0. 8 ii mol/L交叉引物ACLBIP ；0. I U mol/L正向检测引物ACDF5bl，0. 3iimol/L反向检测引物ACDF5f2，各0. I u mol/L的两条置换引物ACLF3和ACLB3,0. 4mmol/L dNTP,2u I 10 X 反应缓冲液；8 个单位的 Bst DNA 聚合酶，2mmol/LMgSO4,以及4iil的目标DNA。扩增反应为63V，60min,随后对扩增产物进行检测。扩增产物通过商品化一次性全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置进行结果判读。通过观察试纸条的检测条带和质控条带的显色与否进行结果判读。如果检测条带和质控条带均显色，结果为阳性；只有质控条带没有检测条带，结果为阴性。当质控条带没有显色时，判断检测过程有误。
实施例3交叉引物扩增方法灵敏度确定经平板培养计数定量的瓜类果斑病菌菌悬液进行十倍梯度稀释，取2 Ul各梯度的细菌纯培养物作为反应模板，对该方法的检测灵敏度进行测试，经测试，所测试的3. 7X 102cfu/ml浓度以上菌液可以观察到检测条带及质控条带,而3. 7X 102cfu/ml浓度以下只有质控条，故判定该方法的灵敏度为3. 7 X 102CfU/ml，因每个反应中加入2 yl，经换算最低灵敏度为7. 4个细菌。 实施例4特异性检测对18株瓜类果斑病菌进行检测，所有菌株均为阳性结果，以下列10株其他种属的植物病原菌为对照菌，测试该方法的特异性。包括魔芋细菌性叶斑病菌(Acidovoraxkonjaci)、番石槽欧文氏菌(Erwinia psidii)、亚洲梨火疫病菌(Erwinia pyrifoliae)、杨树枯萎病菌(Bnterobacter cancerogenus)、洋葱腐烂病菌(Burkholderia gladiolipv. alliicola)、核果树细菌性溃瘍病菌(Pseudomonas syringae pv. morsprunorum)、辣 椒斑点病菌(Xanthomonas vesicatoria)、放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp. stewartii)、番爺溃瘍病菌(Clavibactermichiganense subsp. michiganense),所有上述对照细菌检测结果均为阴性。说明该方法对瓜类果斑病菌具有较好的特异性。实施例5西瓜种子带菌检测利用该方法对西瓜种子进行检测,取西瓜种子经无菌水浸泡30mim, 12000g离心，取沉淀。以商业化植物DNA提取试剂盒提取的样品总DNA为模板进行恒温扩增检测。对12份阳性及5份健康种子检测，结果表明阳性样品均为阳性，健康样品均为阴性。
权利要求
1.一组用于交叉引物恒温扩增检测瓜类果斑病菌的引物，其核苷酸序列为ACLF3 :5’ -GGCTAACTACGTGCCAGC-3’ACLB3 :5’ -ACGCATTTCACTGCTACA-3’ ACLBIP :5’ -CAGATGTGAAATCCCCGGGCTCTGCCGTACTCCAGCGAT-3’ACDF5bl :5’ -GCAAGCGTTAATCGGAATTACT-3’ACDF5f2 :5’ -CAACCTGGGAACTGCATTTGT-3’ 其中引物A⑶F5bl5端生物素标记，引物A⑶F5f25端FITC标记。
2.一种用于检测瓜类果斑病菌的交叉引物恒温扩增方法，该方法以样品总DNA或菌液为模板，利用权利要求I所述的引物进行恒温扩增。
3.根据权利要求2所述的方法，其中的恒温扩增条件为63°C恒温扩增60min。
全文摘要
本发明提供了一种运用交叉引物恒温扩增检测瓜类果斑病菌的引物及其检测方法，其核苷酸序列为ACLF35’-GGCTAACTACGTGCCAGC-3’ACLB35’-ACGCATTTCACTGCTACA-3’ACLBIP5’-CAGATGTGAAATCCCCGGGCTCTGCCGTACTCCAGCGAT-3’ACDF5b15’-GCAAGCGTTAATCGGAATTACT-3’ACDF5f25’-CAACCTGGGAACTGCATTTGT-3’其中引物ACDF5b15端生物素标记，引物ACDF5f2的5端FITC标记。本发明还进一步提供了检测瓜类果斑病菌的交叉引物恒温扩增技术，以样品总DNA或菌液为模板，利用上述引物进行恒温扩增，反应结束后利用封闭式的胶体金标记DNA检测装置即可直接进行结果判定。本发明特异性好，准确性高，灵敏度高，操作简便快速，为进出口安全提供了保证。
文档编号C12Q1/04GK102758005SQ201210109529
公开日2012年10月31日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者商明清, 尤其敏, 张靓, 朱水芳, 田茜, 赵文军 申请人:中国检验检疫科学研究院, 杭州优思达生物技术有限公司