专利名称：一种突变的中性植酸酶及其基因和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于酶的基因工程和酶生化工程领域。本发明涉及活性提高的突变中性植酸酶，本发明还涉及编码该突变中性植酸酶的基因及用途。
背景技术：
磷是动物必需的ー种常量矿物元素，磷的添加对配合饲料生产成本及产品质量有重要影响。植酸酶(phytase)即肌醇六磷酸酶(myo-inositol hexaphosphatephosphohydrotase)是催化植酸及其植酸盐水解产生肌醇和磷酸(或者磷酸盐)这类酶的总称。添加植酸酶能够显著提高植物性饲料中磷的利用率，减少饲料中无机磷的添加量以及动物粪便中无机磷的排出，减轻环境的磷污染，提高畜牧生产和生态效益。目前从微生物中获得植酸酶的报道有以下三种⑴来源于大肠杆菌的双功能酶(appA)，它具有植酸酶和磷酸酶的功能，但只在酸性条件下表现出强的植酸酶活性；(2)来源于黑曲霉的酸性植酸酶(PhyA)具有较高的活性，其酶促反应的pH有效范围在4. 5-6.0之间，适用于胃呈酸性的单胃动物及少数鱼类；(3)来源于芽孢杆菌的中性植酸酶(PhyC)，最适酶促反应PH在7. 0-7. 5之间适用于消化道为中性的鲤科鱼类，可有效弥补酸性植酸酶的不足。国内外科研人员对中性植酸酶的研究主要集中于产酶菌筛选和基因工程菌的构建方面。姚斌等从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis中克隆了中性植酸酶基因，并在大肠杆菌中进行了表达，表达产物具有生物学功能但比活较原始酶下降了 30% (姚斌，袁铁铮，王元火，等.来源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌的表达.生物工程学报，2001，17(1) :11-15)。陈艳等(陈艳，孙健义，赵学新，等.Bacillusamyloliquegaciens中性植酸酶基因的原核表达及蛋白纯化和性质.食品与生物技术学报，2005,24(2) :60-65.)将来源于淀粉液化芽孢杆菌的植酸酶在大肠杆菌中进行了表达，结果发现基因工程菌的植酸酶活性仅为出发菌株的I. 27倍，表达重组酶活性偏低。近年来，Rao %= (Rao DE, Rao KV, Reddy VD. Cloning and expression of Bacillus phytasegene (phy)in Escherichia coli and recovery of active enzyme from the inclusionbodies. Journal of Applied Microbiology. 2008,105 (3) :1128-1137.)在大肠杆菌中对芽孢杆菌中性植酸酶进行了高效表达，结果表明其最适PH为7. O,最适温度55°C，最大活性 16U/mg。Tung 等(Tung ET,Ma HW,Cheng C,et al. Stabilization of beta-propellerphytase by introducing Xaa—>Pro and bly—>Ala substitutions at consensuspositions. Protein Pept. Lett.，2008,15, 297-299.)运用定点突变方法对 BacillusIicheniformis植酸酶的热稳定性进行了改善,取得了较好的效果。定点突变结果表明，突变酶G117A/G266A与野生酶具有类似的米氏常数Km，催化效率keat和最适的Ca2+浓度，但是热稳定性有大幅上升。 定点突变是蛋白质工程广泛采用的技术，它是根据酶的结构、功能和作用机理等信息，在基因水平进行核苷酸突变，以达到改造酶分子中特定氨基酸残基的目的，使酶的性质最佳化。利用生物信息工具进行蛋白质分子设计，并结合定点突变技术提高淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061中性植酸酶的活性，尚未见有关文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种突变的中性植酸酶，该突变的中性植酸酶与野生酶相比，在pH6. O 7. 5下活性增加25-35% ο本发明的另ー个目的是提供编码上述突变中性植酸酶的基因(核苷酸序列)，该突变的中性植酸酶基因可用于构建重组菌。本发明的再ー个目的是提供上述突变中性植酸酶的生产方法。
上述突变中性植酸酶核苷酸序列与野生酶核苷酸序列(GenBank登录号为HM747163)相比，第148位的编码天冬氨酸的密码子突变为编码谷氨酸的密码子。本发明的目的可以通过以下措施达到编码权利要求I所述的突变中性植酸酶的核苷酸序列(即对应野生型中性植酸酶氨基酸序列第148位的天冬氨酸密码子突变为表达谷氨酸的密码子)，如SEQ ID NO. I所述。一种突变的中性植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示。该序列表示原中性植酸酶氨基酸序列(即野生型淀粉液化芽抱杆菌Bacillus amyIoliquefaciens DSM 1061PhyC基因所表达的氨基酸序列)的148位的天冬氨酸残基被谷氨酸残基所取代。含有上述核苷酸序列的表达载体。如质粒等。用上述表达载体转化的大肠杆菌。用IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白，表达产物利用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行亲和纯化。所述的突变中性植酸酶在饲料生产中的应用。本发明的有益效果本发明所提供的中性植酸酶与野生酶相比，活性显著提高。本发明还提供了该突变中性植酸酶的基因序列，这些序列可用于构建表达高活性中性植酸酶的重组菌。本发明还提供了所述的突变中性植酸酶的生产方法。本发明涉及的中性植酸酶可以作为一种饲料添加剂，能有效提高动物对饲料中磷元素的利用率。
图I表达重组质粒构建图。图2突变酶表达及纯化结果SDS-PAGE分析。图3不同温度下野生酶及突变酶活性比较。图4不同pH下野生酶及突变酶活性比较。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明做进ー步的阐述，但不限制本发明。实施例I :淀粉液化芽抱杆菌 Bacillus amyIoliquefaciens DSM 1061 phyC 基因的获得及第148位氨基酸残基的突变
淀粉液化芽抱杆 菌Bacillus amyIoliquefaciens DSM 1061 从德国 DSMZ 购得。培养基的制备蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，121 °C，高压蒸汽灭菌15min。菌体的收集将Bacillus amy Io liquefaciens DSM 1061接种到上述培养基中，置37°C摇床，180r · mirT1培养过夜，8000r · min'fC,离心15min，收集菌体。目的基因的提取采用改良的的酚-氯仿抽提法获取Bacillusamyloliquefaciens DSM 1061的基因组，以该基因组为模版，使用如下PCR引物(由生エ生物工程(上海)公司合成)phyC-F:5，-GCGGATCC ATGAATCATTCAAAAACAC-3，(SEQ ID NO. 3)phyC-R:5，-GTC AAGCTT TTATTTTCCGCTTCTGTC-3’ (SEQ ID NO. 4)运用Bio basic INC公司的PCR试剂盒进行PCR反应扩增目的基因。PCR循环參数94°C,3min ；94°C, Imin ；56°C, Imin ；72°C, Imin ;共进行 36 个循环。Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 phyC基因的也可以通过基因的全序列合成获得，如委托生エ生物工程(上海)有限公司按照Bacillus amyloliquefaciens DSM1061 phyC基因序列(GenBank登录号为HM747163)进行合成，合成的基因同样可用于重组质粒的构建。采用生エ生物工程(上海)有限公司的胶回收试剂盒将目的基因片段进行纯化。将纯化的基因或者全合成的基因与pET22b(+)(美国Novagen公司)进行常规的连接反应，将连接转化大肠杆菌DH5CI进行质粒扩增。运用质粒提取试剂盒(Bio basic INC公司)，提取质粒。运用上述的PCR引物进行扩增鉴定确定插入的phyC基因，得到阳性重组pET-phyC质粒。根据Stratagene公司的Quik-Change多重定点突变试剂盒的要求,设计如下引物5’ -ACAGATCCAGAACATCCGATTGCA-3’，以 pET-phyC 质粒为模板进行 PCR，将 Aspl48 突变为Glul48，用限制性内切酶消化原始质粒模板，将PCR产物转化高效率的感受细胞，培养后提取质粒进行测序，即可得到含有突变基因(SEQ ID NO. I)的质粒pET-phyC-D148E。实施例2 :表达重组质粒的构建、筛选和鉴定为构建植酸酶基因的高效表达质粒，设计引物删除了该酶N端的26位氨基酸残基构成的信号肽部分。引物设计采用Primer Premier 5· O软件，在引物中分别引入限制性内切酶BamHI和HindIII (加粗下划线部分)，由生エ生物工程(上海)有限公司合成。引物如下phyC-F:5，-GC GGATCC' GAAGCATAAGCTGTCAGA-3J (SEQ ID NO. 5)phyC-R:5，-GTC Μ^￡ Γ TTTTCCGCTTCTGTC-3’ (SEQ ID NO. 6)以获得的phyC全长基因为模板PCR的反应參数为94°C，lmin ；56°C,lmin ；72°C,Imin ;共进行36个循环。扩增产物采用O. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物和pET22b (+)载体分别用BamH I和Hind III消化并连接，构建质粒pET22b-phyC-D148E。连接液转化E. coli DH5 α细胞，对阳性克隆进行PCR鉴定，提取质粒并送生エ生物工程(上海)有限公司进行测序。实施例3 :中性植酸酶的诱导表达将经鉴定后的pET22b-phyC_D148E重组质粒转化到表达宿主E. coli BL21 (DE3)中，同时将空载体pET22b(+)转入相同宿主作为对照。各取100 μ L转化液分别涂布于含Amp(100yg/mL)的LB平板，置于37°C培养箱中培养至长成大小合适的菌落。挑取含有重组质粒和空质粒的转化子分别接种至含100 μ g/mL Amp的LB液体培养液，置摇床37°C，180r/min振荡培养过夜。按1%接种量(V/V)转接至新鲜LB培养液中，37°C，180r/min振荡培养至对数生长期(OD6tltlたO. 6-0. 8)分别加入诱导剂IPTG至终浓度I. Ommol/L，置20°C摇床，180r/min诱导表达6h。实施例4 :中性植酸酶的纯化 取适量按实施例3方法进行诱导表达的重组菌培养液,8000r/min离心15min收集菌体，用无菌水洗涤两次后，菌体重悬于O. 5mL(pH 7. 5, 50mmol/L) Tris-HCl缓冲液中，冰浴中超声破碎细胞。将超声破碎后的样品12000r/min，4°C离心IOmin取上清即为粗酶液。由于设计的pET22b-phyC_D148E表达质粒的表达产物中性植酸酶上带有6个连续的组氨酸，可以通过金属离子层析柱(Ni-NTA琼脂糖凝胶)亲和纯化。超声波破碎诱导后的菌体于12000r/min离心,去除细胞碎片。上清液采用康为世纪Ni-Agarose 6x His标签蛋白纯化试剂盒在4°C下进行纯化。将粗酶液负载上柱，流速为lmL/min ;采用15倍柱体积平衡液(pH7. 0，20mmol/L Tris-HCl，10mmol/L 咪唑，O. 5mol/L NaCl)进行洗脱的除去杂蛋白，流速为lmL/min ;然后用8倍柱体积洗脱液(pH7. 0,20mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L咪唑,0. 5mol/NaCl)收集目的蛋白，流速为lmL/min ;最后将目的蛋白置透析袋中除盐,浓缩保存。实施例5 :中性植酸酶酶学性质测定中性植酸酶活性测定方法參考GB/T 18634-2009。取适量酶液，底物植酸钠浓度为5. Ommol/L,反应体系中 CaCl2 浓度为 lmmol/L,缓冲体系为 0. 25mol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)，反应总体积为6mL。将上述混合物置37°C反应30min，加入4mL显色及終止液(体积比2:1: I的43%的硝酸溶液，100g/L钥酸铵，2. 35g/L偏钒酸铵溶液)，置分光光度计波长为415nm处测定无机磷含量。酶活性単位(U)定义为在一定条件下，毎分钟释放出Iumol无机磷所需的酶量为ー个酶活性単位。(I)中性植酸酶最适温度的测定将反应混合物分别置于20で、30で、40で、50で、55°C、60°C、65°C、70°C和80°C下水浴反应30min，加入4mL显色及终止液终止反应，检测酶活。温度对野生植酸酶和突变植酸酶活性影响结果如图3所示。温度升高植酸酶的活性随之增强，到60°C时酶活性最高，说明该中性植酸酶最适反应温度为60°C。相同温度下，突变酶的活性要比野生酶活性高出约25%。(2)中性植酸酶最适pH的测定配制不同pH的含有底物植酸钠的溶液(pH3. O为甘氨酸-HCL 缓冲液，pH4. 0-pH6. 5 分别为 HAc-NaAc 缓冲液，pH7. 0_pH9. O 为 Tris-HCl 缓冲液；pH10. O为甘氨酸-NaOH缓冲液)。将反应混合物置于60°C水浴反应30min，加入4mL显色及終止液終止反应，检测酶活。PH对野生植酸酶和突变植酸酶活力影响结果如图4所示。结果表明酶最适pH为7.0，在此条件下，突变植酸酶比活为21U/mg。在pH6. O 7. 5这ー较宽的范围内，酶活性均在最大活性的70%以上，pH在6. O 7. 5下，突变酶的活性要比野生酶活性高25-35%。
权利要求
1.一种突变的中性植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示。
2.编码权利要求I所示的突变中性植酸酶的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，如SEQID NO. I所示。
4.含有权利要求2所述的核苷酸序列的表达载体。
5.用权利要求4所述表达载体转化的大肠杆菌。
6.权利要求I所述的突变中性植酸酶在饲料生产中的应用。
全文摘要
本发明涉及通过基因工程技术改造得到的一种突变的中性植酸酶及其基因和用途，该突变的中性植酸酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2，是以野生型淀粉液化芽孢杆菌DSM 1061 phyC基因为基础，利用PCR技术对其基因进行点突变获得的。本发明公开了改造的中性植酸酶及其相应的DNA序列，还公开了所述中性植酸酶的生产方法。本发明所述的突变中性植酸酶与野生酶相比，在pH 6.0～7.5下活性高出25-35％。该中性植酸酶可作为一种饲料添加剂，能有效提高动物对饲料中植酸磷的利用率。本发明所提供的突变中性植酸酶基因可用于构建表达该酶的重组菌。
文档编号C12N15/55GK102649950SQ20121010897
公开日2012年8月29日 申请日期2012年4月16日 优先权日2012年4月16日
发明者余晓红, 许伟, 路国伟, 邵荣 申请人:盐城工学院