专利名称：快速检测鹿源性鹿产品真伪的pcr试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明公开一种快速检测鹿源性鹿产品真伪的PCR试剂盒，用于快速准确识别鹿产品，属于生物检测试剂盒技术领域。
背景技术：
鹿产品是鹿的一些组织或者器官，主要包 括有鹿茸，鹿心，鹿肾，鹿胎，鹿筋，鹿鞭，鹿尾，鹿肉和鹿血等。由于鹿产品大多为名贵中药材，价格昂贵，所以市场上屡见用伪劣产品来冒充名贵的鹿产品。目前，鹿产品的鉴定大多采用传统方法，主要包括性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。虽然传统鉴定方法简单、快捷、成本低，但影响传统鉴定方法的因素很多(如人为因素、环境因素、营养因素)，因而不能准确地判断鹿产品的伪劣情况。比如在鹿产品的加工过程中，其性状、显微结构、理化性质等常常发生改变，利用传统鉴定方法来鉴定鹿产品可能会出现误判。然而，分子鉴定方法(基于DNA的方法)不受这些因素的影响，且具有准确性大、灵敏度高、稳定性好、通用性强等特点。
发明内容
本发明提供一种检测鹿源性鹿产品真伪的快速检测方法，解决了鹿产品中是否含有梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿、驯鹿的成分问题。本发明还提供了上述快速检测鹿产品的PCR试剂盒的制备方法，通过一个PCR方法反应体系采用一步反应来鉴别鹿产品中的鹿源性成分。本发明提供的快速检测鹿源性产品的PCR试剂盒，其特征在于
包括DNA提取液、PCR反应液和阴性标准品
所述的DNA提取液
(1)低盐缓冲液(pH7. 6-7. 8) : 12-13份Tris碱(三羟甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA (乙二胺四乙酸二钠)，7-8份MgC12，4-5份NaCl,余份为水；
(2)细胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸钠，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇对异辛基苯基醚)，1000份低盐缓冲液；
所述的PCR反应液
ddH20、10 X PCR Buffer、dNTPs、上游引物、下游引物、酶；
具体引物序列为
上游引物5 ’ - CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3，
下游引物5’ - CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
阴性标准品为无菌双蒸水。本发明所述快速检测鹿源性鹿产品的PCR试剂盒的制备方法，包括以下步骤
I)DNA提取液
(1)低盐缓冲液(pH7. 6-7. 8 ): 12-13份Tri s碱(三羟甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份为水；
(2)细胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸钠，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇对异辛基苯基醚)，1000份低盐缓冲液；
2)PCR反应液
(1)引物设计
在梅花鹿，赤鹿，马鹿，塔里木马鹿和驯鹿线粒体D-Ioop区设计引物，包括一个上游引物和一个下游引物。序列如下
上游引物5’ - CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’
下游引物5’ - CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
(2)PCR反应液
ddH20 9. 3ul, 10 X PCR Buffer I. 5ul, dNTPs (100 uM) 2. Oul，上游引物(20 uM)
0.5ul，下游引物(20 uM) 0. 5ul，酶(5U/ul) 0.2ul。(3)阴性标准品为无菌双蒸水。本发明的鹿源性鹿产品PCR检测的使用方法
(1)从待检样品中提取基因组DNA；
(2)制备PCR反应体系
取步骤(I)中的DNA Iul和阴性对照加入到PCR反应液中，用PCR仪进行扩增；
(3)设定反应程序进行PCR扩增，反应程序均如下
940C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 70°C 30s, 70°C 5min，扩增 30 个循环。(4)反应结束后取5 Ul PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，紫外灯下观察结果。结果判定扩增出长度为307bp的为梅花鹿、或马鹿的产品，即为正品；若扩增出长度为230bp则为塔里木马鹿、赤鹿或驯鹿的产品。本发明的积极效果在于采用PCR技术扩增梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿以及驯鹿的各线粒体DNA的特异分子片段制成试剂盒，用于检测被检样品中是否含有上述各动物成分，并能检测混合样品；具有操作简单、灵敏度高，速度快特点。
图I为引物的种间特异性；
图2为梅花鹿引物的种内通用性；
图3为塔里木马鹿、赤鹿、驯鹿引物的种内通用性；
图4为马鹿引物的种内通用性。
具体实施例方式下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明
实施例I :试剂盒的组成与配制
I) DNA提取液的配制
(I)低盐缓冲液(pH 7. 6)800ml蒸馏水溶解I. 21gTris碱(三羟甲基氨基甲烷)、3. 38gNa2EDTA (乙二胺四乙酸二钠)、0. 76g MgCl2、0. 47gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。(2)细胞裂解液200ml低盐缓冲液中加入Ig SDS(十二烷基硫酸钠)，Iml Tritonx-100 (聚乙二醇对异辛基苯基醚)。提取方法200ul 抗凝血和400ul低盐缓冲液加入到I. 5ml离心管中，充分混匀后1000RPM离心lOmin，弃上清；加入500ul低盐缓冲液，混匀后于室温下1000RPM离心5min，重复一次；小心吸出上清，加入300ul细胞裂解液，混匀后于65°C水浴IOminJPA 75ul饱和NaCl，充分混匀后12000RPM离心5min，将上清转移到新的I. 5ml离心管中，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀后于10000RPM离心2min，弃上清，加入500ul冰浴70%乙醇，颠倒混匀数次后于10000RPM离心lmin，弃上清；65°C烘箱中干燥5min，加入IOOul ddH20后于65°C水浴溶解15min。2) PCR 反应液
(1)引物设计
根据GenBank数据库中已公布的线粒体D-Ioop区序列采用Bioedit 7. 0. 9. O软件进行序列比对。然后再梅花鹿(AB378372)的D-Ioop区上，利用Oligo 6. O软件设计梅花鹿，赤鹿，马鹿，塔里木马鹿和驯鹿的特异性引物。其中包括一个下游引物，一个上游引物。引物对要具有种内通用性和种间特异性。序列如下
上游引物5 ’ - CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3，
下游引物5’ - CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
(2)PCR反应液
ddH20 9. 3ul, 10 X PCR Buffer I. 5ul, dNTPs (100 uM) 2. Oul，上游引物(20 uM)
0.5ul，下游引物(20 uM) 0. 5ul，酶(5U/ul) 0.2ul。(3)阴性标准品为无囷双蒸水。实施例2 =PCR最佳反应条件的建立。对于一个PCR反应来说，最重要的反应条件就是退火温度和延伸温度，因此从这两个方面来设定PCR反应的最佳条件。最佳反应条件的设定首先应遵循种间特异性和种内通用性原则，然后在此基础上选择扩增效果最理想时的温度设定为引物的最佳反应温度。I) DNA 的提取
按照实施例I的方法从血液中提取了梅花鹿的基因组DNA。2 ) PCR反应体系的制备
将步骤I)中提取的DNA Iul加入到实施例I中的PCR反应液中，构成15ul的反应体系。3) PCR反应最佳退火温度的设定。退火温度的梯度范围为54-68°C，每隔2°C设一个梯度，反应在Eppendorf AG仪器上进行扩增。程序如下
940C 5min ；94°C 30s, 54-68°C 30s, 72°C 30s, 72°C 5min，扩增 30 个循环。反应结束后取5 Ul PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，凝胶成像系统中记录实验结果，根据凝胶中条带的亮度确定每对引物的最佳退火温度。4) PCR反应最佳延伸温度的设定。仅确定最佳退火温度还不足以达到最佳反应条件的设定原则，因此需要对该引物的延伸温度进行最优化。延伸温度的梯度范围为65-72 °C，每隔I °C设一个梯度，反应在Eppendorf AG仪器上进行扩增,程序如下
940C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s,65-72°C 30s,65-72°C 5min，扩增 30 个循环。反应结束后取5 Ul PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，凝胶成像系统中记录实验结果，根据凝胶中条带的亮度确定该引物对的最佳延伸温度。5)最佳PCR反应条件的确立。
综合分析3、4结果，确立PCR反应条件为
940C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 70°C 30s, 70°C 5min，扩增 30 个循环。实施例3 :试剂盒的特异性试验
I)证明引物具有种间特异性。(I)为证明本发明的引物具有种间特异性，按照实施例I的方法提取了梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿、驯鹿、水鹿、坡鹿、白唇鹿、麋鹿、點鹿、猪、牛、羊、鸡的血液基因组DNA,提取的DNA用于制备PCR反应体系，无菌水作为阴性对照。(2)PCR反应体系的制备取步骤(I)提取的DNA Iul加入到实施例I中的PCR反应液中，构成15ul体系。(3)按照反应程序94°C 5min ；94°C 30s，56°C 30s, 70°C 30s, 70°C 5min,扩增30个循环。进行PCR扩增。(4)结果如图I :N :梅花鹿；C :马鹿；Y :塔里木马鹿；E :赤鹿；R :驯鹿；1 :水鹿；
2:坡鹿；3 :白唇鹿；4 :糜鹿；5 :點鹿；6 :猪；7 :牛；8 :羊；9 :鸡；10 阴性对照；M Marker I(600，500，400，300，200，100 bp)；
在梅花鹿和马鹿基因组DNA的反应中，引物扩增出307 bp特异性片段，而在塔里木马鹿、赤鹿和驯鹿基因组DNA的反应中扩增出230 bp特异性片段，而水鹿、坡鹿、白唇鹿、麋鹿、點鹿、猪、牛、羊、鸡的基因组DNA均为阴性。2 )证明引物的种内通用性。引物除了在种间具有特异性之外，还必须同时具有种内通用性，因此对引物的种内通用性也进行了评估。(I)按照实施例I的方法提取了 9个梅花鹿(3个左家梅花鹿、3个东丰梅花鹿、3个兴凯湖梅花鹿)血液基因组DNA、3个塔里木马鹿血液基因组DNA、3个赤鹿血液基因组DNA、3个驯鹿血液基因组DNA、15个马鹿(3个东北马鹿、3个青海马鹿、3个甘肃马鹿、3个阿尔泰马鹿、3个天山马鹿)血液基因组DNA。提取的DNA用于制备PCR反应体系，无菌水作为阴性对照。(2)PCR反应体系的制备取步骤(I)提取的DNA Iul加入到实施例I中的PCR反应液中，构成15ul反应体系。(3)按照反应程序94°C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 70°C 30s, 70°C 5min,扩增30个循环。进行PCR扩增。(4)结果如图2 :梅花鹿(1-3 :左家梅花鹿；4_6 :东丰梅花鹿；7_9 :兴凯湖梅花鹿)，10 :阴性对照；图3 :塔里木马鹿(1-3)，赤鹿(4-6)，驯鹿(7-9)，10 :阴性对照；图4 :马鹿(1-3 :东北马鹿；4-6 :青海马鹿；7-9 :甘肃马鹿；10-12 :阿尔泰马鹿；13-15 :天山马鹿)，16 :阴性对照；M :Marker I (600，500，400，300，200，100 bp)；
左家梅花鹿、东丰梅花鹿、兴凯湖梅花均扩增出307 bp特异性片段；东北马鹿、青海马鹿、甘肃马鹿、阿尔泰马鹿、天山马鹿均扩增出307 bp特异性片段；塔里木马鹿、赤鹿、驯鹿均扩增出230 bp特异性片段；重复性强，说明本发明的引物具有种内通用性
权利要求
1.一种快速检测鹿源性鹿产品真伪的PCR试剂盒，其特征在于包括以下引物 上游引物5 ’ - CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3， 下游引物5’ - CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’。
2.权利要求I所述的快速检测鹿源性鹿产品真伪的PCR试剂盒，其特征在于包括DNA提取液、PCR反应液和阴性标准品 所述的DNA提取液 (1)低盐缓冲液(pH7. 6-7. 8 ): 12-13份Tri s碱(三羟甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份为水； (2)细胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸钠，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇对异辛基苯基醚)，1000份低盐缓冲液； 所述的PCR反应液 ddH20、10 X PCR Buffer、dNTPs、上游引物、下游引物、酶； 具体引物序列为 上游引物5 ’ - CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3， 下游引物5’ - CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’ 阴性标准品为无菌双蒸水。
3.权利要求I所述的快速检测鹿源性鹿产品真伪的PCR试剂盒的制备方法，包括以下步骤 1)DNA提取液 (1)低盐缓冲液(pH7. 6-7. 8 ): 12-13份Tri s碱(三羟甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA(乙二胺四乙酸二钠)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份为水； (2)细胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸钠，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇对异辛基苯基醚)，1000份低盐缓冲液； 2)PCR反应液 (1)引物设计 引物设计在梅花鹿，赤鹿，马鹿，塔里木马鹿和驯鹿线粒体D-Ioop区设计引物，包括一个上游引物和一个下游引物；序列如下 上游引物5’ - CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’ 下游引物5’ - CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’ (2)PCR反应液ddH20 9. 3ul, 10 X PCR Buffer I. 5ul, dNTPs (100 uM) 2. Oul，上游引物(20 uM)。0.5ul，下游引物(20 uM) 0. 5ul，酶(5U/ul) 0. 2ul ； (3)阴性标准品为无菌双蒸水。
全文摘要
本发明公开一种快速检测鹿源性鹿产品真伪的PCR试剂盒，用于快速准确识别鹿产品，采用PCR技术扩增梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿以及驯鹿的各线粒体DNA的特异分子片段制成试剂盒，用于检测被检样品中是否含有上述各动物成分，并能检测混合样品；具有操作简单、灵敏度高，速度快特点。
文档编号C12Q1/68GK102618653SQ20121010856
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月15日 优先权日2012年4月15日
发明者吴琼, 杨福合, 査代明, 苏伟林, 荣敏, 邢秀梅 申请人:邢秀梅