专利名称：一株葡糖醋杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株葡糖醋杆菌SC-01 (G/wco"acetoto"w sp. SC-01)及其应用，特别 是涉及一株葡糖醋杆菌SC-01 (G/t/co"aceto6acfersp. SC-01)的发酵方法及利用该菌生 产细菌纤维素的方法。
背景技术：
为了区别植物来源的纤维素，把微生物来源的纤维素称为细菌纤维素(bacterial cellulose, BC)。据报道，葡糖醋杆菌属的细菌合成细菌纤维素的能力最强，具有大规 模发酵生产的潜力。
与植物纤维素相比，细菌纤维素是由超微纤维组成的超微纤维网，其超微纤维直径 仅为植物纤维的1/100。其弹性模量高达1.5xl(^Pa ，与铝相当。细菌纤维素是一种可生 物降解的高分子，它有许多独特的性能①结构均一性具有超精细网状结构(纳米 级)，高化学纯度，高结晶度，高聚合度；②较好的分散和乳化性。③高抗张强度和
弹性模量、极佳的抗撕拉能力和形状维持能力。 高持水能力。⑤形状可塑性及物理 性质的可调控性，如合成过程中通过改变培养方式或者添加特定的物质，可以得到所需 特性的纤维素。⑥较高的生物相容性和良好的生物可降解性。
此外，细菌纤维素还具有其他一些优越性能，因此，细菌纤维素在食品、医药、造 纸、纺织等领域具有广泛的应用潜力。例如在外科治疗中作为皮肤代用品，用于治疗烧
伤、溃疡以及皮肤移植手术；用于制造超性能的声音振动膜；制作人造微血管；还可以 作为食品添加剂及纸品添加剂等。
尽管细菌纤维素的理化性质及机械性能优于植物纤维素，并已被证明在工业生产中 具有广泛的商业应用前景，但由于细菌纤维素的产量低，生产成本高，使其应用受到限 制。细菌纤维素的生物合成是一个复杂的过程，为了提高其产量可以从多方面入手，分 离高产菌株和优化菌株生长代谢的营养源及其发酵方式是一条可行的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一株可用于大规模生产细菌纤维素的葡糖醋杆菌sc-oi
3(G/wcowac"o6ac&r SC-01)。
本发明提供的葡糖醋杆菌为葡糖醋杆菌SC-01 (G/wco"aceto6ac欣sp. SC-Ol)，该菌 己于2009年5月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学内)，保 藏编号为CCTCC NO: M 209112。
本发明的葡糖醋杆菌SC-01 (G/wcowaceto6ac^sp. SC-01)分离自天津蓟县产腐烂的 柿子。该菌可以在1 培养基(2%葡萄糖，().5%蛋白胨，0.5%酵母浸粉，0.27%NaH2PO4 ， 0.115%拧檬酸，1%乙醇，pH 6.0)上生长良好。菌落呈圆形，半透明，边缘整齐。其 16SrDNA基因的核苷酸序列长度为1379bp，在GenBank中的登录号为FJ999663。使用 BLAST对SC-01菌株的16S rDNA基因和GenBank中已登录细菌进行同源性比对，发 现该菌株与已报道的G/wcowacetotocto" x_y//m/s strain CGMCC1.1812的16S rDNA基因 序列相似性最高。葡糖醋杆菌SC-01 (G/"co朋c"o6ac^sp. SC-01)的系统进化树见说 明书附图l。
本发明的另一个目的是提供利用上述葡糖醋杆菌SC-01 (G/"co朋c柳to"w sp. SC-01)生产性能优良的细菌纤维素的方法。
为了实现这一 目的，本发明采用以下技术方案葡糖醋杆菌SC-01 (G/wco"aceto6a"w sp. SC-01)生产性能优良的细菌纤维素的方法是采用优化的HS培养基进行发酵。具体 步骤如下首先将菌种接种至种子培养基中，25-35'C摇床振荡培养24h，转速为135rpm, 以10%的接种量接入发酵培养基，接种时充分振荡，使菌体分散均匀，25-35t恒温静 置培养10天或震荡培养5天。取出纤维素膜，提纯处理并干燥之后称重。
利用葡糖醋杆菌SC-01 (G/"co加c她6ac^sp. SC-01)生产细菌纤维素所用发酵培 养基的碳源为葡萄糖或甘露醇或蔗糖或半乳糖或果糖或木塘中的一种或几种；氮源为酵 母粉或蛋白胨或玉米浆干粉中的一种或几种。
为了提高葡糖醋杆菌SC-01 (G/wco"acetoto"wsp. SC-01)的细菌纤维素产量，所 述发酵培养过程中添加发酵液体积百分比为0.5%~2%的95%乙醇作为生长因子促进菌 株生长，以产生更多的细菌纤维素。
本发明中的发酵培养温度为25-35°C;发酵培养初始pH值为3.5-7.0。
本发明以葡糖醋杆菌SC-01 (G/wc0"aceto6arfwsp. SC-01)为生产菌株，发酵制备细 菌纤维素。培养基的碳源为葡萄糖或甘露醇或蔗糖或半乳糖或果糖或木塘中的一种或几种；氮源为酵母粉或蛋白胨或玉米浆干粉中的一种或几种。本发明的菌株培养条件更加 灵活，菌株可以在较宽的温度和pH范围内生长。通过改变培养条件，可以根据需要得 到所需特性的细菌纤维素，使细菌纤维素的合成有更好的可调控性。利用本发明的方法， 可以得到较高的细菌纤维素产量，更适于大规模工业化发酵生产。以前报道的一些菌种 在发酵的后期由于培养基中葡萄糖酸的产生，pH下降，从而抑制了细菌纤维素合成的 相关酶的活性，使细菌纤维素产量下降。本发明的菌株在初始pH为4时仍有较高的细 菌纤维素产量，优于以前报道的菌种。利用本发明的菌株和培养方法得到的细菌纤维素 具有超纯、超细、结晶度高、吸水性好、可降解、机械强度高、合成可调控等特点。因 此利用本发明的菌株和培养方法得到的细菌纤维素具有更广阔的应用前景。
图1是葡糖醋杆菌SC-01 (G/wco"acetoZ>a"ersp. SC-01)的系统进化树。 下面结合具体的实例对本发明做进一步说明。
具体实施例方式
在下面的实施例中，所用的菌种均为葡糖醋杆菌SC-01 (G/wcowaceto&crer sp. SC-Ol)，实施例中所用的不同培养基配方如下
1. 筛选培养基
(1) 固体GYC培养基葡萄糖3 - 5g,酵母粉0.3 - lg， CaC031 -2g， 95%乙醇0.5 - 2ml， 琼脂1.5 -2.5g，蒸馏水100ml， pH 6.8。另外加入100 pi 10mg/ml的制霉菌素抑制 真菌等的生长。
(2) 液体HS培养基:葡萄糖2g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，柠檬酸0.115g，Na2HPO4 0.27g， 95。/o乙醇2ml，蒸馏水100ml， pH 6.0。另外加入100 pl 10mg/ml的制霉菌素抑制真 菌等的生长。
其中，制霉菌素用二甲基亚砜作溶剂配制成10mg/tnl， 0.22nm滤器过滤除菌。
2. 种子培养基葡萄糖2g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，柠檬酸0.115g， Na2HPO40.27g， 950/o乙醇lml， MgS04'7H20 0.05g，蒸馏水100ml， pH6.0。
3. 发酵培养基-
(1)发酵培养基1:葡萄糖2g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，柠檬酸0.115g，Na2HP04 0.27g， MgS04.7H20 0.05g， 95。/。乙醇lml，蒸馏水100ml， pH6.0。(2) 发酵培养基2:甘露醇2g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，柠檬酸0.115g，Na2HPO4 0.27g， MgS04-7H20 0.05g，蒸馏水100ml， 95%乙醇lml， pH6.0。
(3) 发酵培养基3:甘露醇和蔗糖各lg,酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，柠檬酸0.115g， Na2HP04 0.27g， MgS(V7H20 0.05g，蒸馏水100ml， 950/o无菌乙醇2ml， pH6.0。
(4) 发酵培养基4:半乳糖和甘露醇各lg，酵母粉lg，柠檬酸0.115g， Na2HPO40.27g, MgS04'7H20 0.05g，蒸馏水100ml， 95%乙醇lml， pH6.0。
(5) 发酵培养基5:果糖2g，玉米浆干粉lg，柠檬酸0.115g， Na2HP04 0.27g， MgS(V7H20 0.05g，蒸馏水100ml， 95%乙醇lml， pH6.0。
(6) 发酵培养基6:木糖和甘露醇各lg,酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，柠檬酸0.115g， Na2HP04 0.27g， MgS04.7H20 0.05g，蒸馏水100ml， 95%无菌乙醇lml， pH4.0。
实施例l、分离葡糖醋杆菌SC-Ol ( G/"cwwceto6flcte/"sp.SC-01)
实验材料来自于天津蓟县产腐烂的柿子。
具体步骤如下取腐烂的柿子汁液，用100目筛过滤，以无菌生理盐水10倍梯度 稀释，分别稀释为101406，取10M()S涂布到固体GYC培养基平板上，25-35t培养4 天，观察菌落生长情况，挑取带有透明斑的菌落转接至液体HS培养基中培养10天，培 养液表面有膜状物产生，将膜处理后经检测为细菌纤维素膜，初步判断该菌为细菌纤维 素产生菌。经革兰氏染色，生理生化实验及16SrDNA基因序列分析以及BI0L0G鉴定， 确定该菌株为葡糖醋杆菌，并且命名为葡糖醋杆菌SC-01 (G/wco"acetok c^ sp. SC-01 )， 经保藏，编号为CCTCC NO: M 209112。
实施例2、葡糖醋杆菌SC-Ol ( ( /"cwiflceto6<icfe"p.SC-01)的发酵
采用发酵培养基l。具体步骤如下首先将菌种接种到种子培养基中，25-35'C摇床 振荡培养，转速为135rpm，培养24h后，按10%的接种量接入发酵培养基，接种时充 分振荡，使菌体分散均匀，25-35'C恒温静置培养10天。取出纤维素膜，以去离子水多 次冲洗除去膜表面的培养基及杂质，将膜浸在0.1mol/L的NaOH中，IO(TC煮沸lh,去 除膜中菌体和残留培养基，至膜呈乳白色半透明，用去离子水浸泡过夜，然后用去离子 水多次冲洗直至pH为7.2左右，然后250ml离心管中4000rpm离心40min,弃上清，将 膜取出，置于吸水纸上吸取表面的水，称湿重。将湿膜放至平皿中包上保鲜膜，扎孔， 于-20'C冰箱中预冻2h,然后冷冻真空干燥至恒重，称其重量为细菌纤维素的干重。实施例3、采用发酵培养基2。具体步骤如下首先将菌种接种到种子培养基中，25-35°C 摇床振荡培养，转速为135rpm，培养24h后，按10%的接种量接入发酵培养基，接种 时充分振荡，使菌体分散均匀，25-35"C恒温震荡培养5天。以下步骤同实施例2。 实施例4、采用发酵培养基3。具体步骤同实施例2。 实施例5、采用发酵培养基4。具体步骤同实施例3。 实施例6、采用发酵培养基5。具体步骤同实施例2。 实施例7、采用发酵培养基6。具体步骤同实施例3。
实施例8、采用发酵培养基6，发酵培养温度为25'C。具体步骤同实施例2。 实施例9、采用发酵培养基6，发酵培养温度为35t:。具体步骤同实施例3。
权利要求
1.一株葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)。该菌已于2009年5月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学内)，保藏编号为CCTCC NOM 209112。
2. 利用葡糖醋杆菌SC-01 (G/wco"aceto6ac^ sp. SC-01)生产细菌纤维素的方 法，包括以下步骤首先将菌种接种到种子培养基中，25-35'C摇床振荡培养， 转速为135rpm，培养24h后，按10%的接种量接入发酵培养基，接种时充分 振荡，使菌体分散均匀，25-35'C恒温静置培养10天或震荡培养5天。取出 纤维素膜，提纯处理并干燥之后称重。
3. 根据权利要求2所述的生产细菌纤维素的方法，其特征在于所述培养基的 碳源为葡萄糖或甘露醇或蔗糖或半乳糖或果糖或木糖中的一种或几种；氮源 为酵母粉或蛋白胨或玉米浆干粉中的一种或几种。
4. 根据权利要求2所述的生产细菌纤维素的方法，其特征在于所述培养过程 中添加发酵液体积百分比为0.5%~2%的95%乙醇作为生长因子促进菌株生 长，以产生更多的细菌纤维素。
5. 根据权利要求2或3所述的生产细菌纤维素的方法，其特征在于所述发酵 培养温度为25 -35"C。
6. 根据权利要求2或3所述的生产细菌纤维素的方法，其特征在于所述发酵 培养初始pH值为3.5-7.0。
全文摘要
本发明公开了一株葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)及其应用。涉及一株葡糖醋杆菌及利用该菌生产细菌纤维素的方法。菌种接种至种子培养基，25-35℃摇床振荡培养24h，以10％接种量接入发酵培养基，25-35℃恒温静置培养10天或震荡培养5天。分离出纤维素、纯化、干燥。培养基碳源为葡萄糖或甘露醇或蔗糖或半乳糖或果糖或木糖中的一种或几种；氮源为酵母粉或蛋白胨或玉米浆干粉中的一种或几种。该发明的菌株在低pH环境中仍有较高的细菌纤维素产量，适于大规模工业化发酵生产。利用本发明得到的细菌纤维素具有超纯、超细、结晶度高、吸水性强、可降解和机械强度高等特点。
文档编号C12R1/01GK101591626SQ200910069499
公开日2009年12月2日 申请日期2009年6月30日 优先权日2009年6月30日
发明者孔梅梅, 宋存江, 曹名锋, 李保宾, 王淑芳, 苏文萍 申请人:南开大学