一株葡糖杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）的菌株，其中，该菌株的保藏号为CGMCC NO.8039。另一方面，本发明还提供了一种菌剂，其中，所述菌剂含有如上所述的菌株的活菌体和培养基。另一方面，本发明还提供了如上所述的菌株和/或菌剂在防治果实病虫害中的用途。再一方面，本发明还提供了一种防治果实病虫害的方法，其中，该方法包括：将含有如上所述的菌株的活菌体的菌剂与果实接触。通过上述技术方案，本发明能够有效地实现对果实病虫害的防治，并且不会有有害化学物质的残留。
CGMCC NO8039
20130816
【专利说明】一株葡糖杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业生物【技术领域】，具体地，涉及一种氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans)的菌株、含有该菌株的菌剂、该菌株和菌剂的用途以及一种防治果实病虫害的方 法。
【背景技术】
[0002] 果品贮藏保鲜是农业生产的延续。随着生活水平的提高，大众对健康和环境问题 日益重视，对果实品质的要求也越来越高，绿色食品迅速普及。因此，寻找安全有效的技术 对果实进行采后防腐、杀菌，对果实保鲜十分重要。
[0003] 病虫害是诱发果实腐败的主要因素，因此防治果实病虫害对果实的贮藏至为关 键。目前用于防治果实病虫害的方法大多通过化学药品浸泡法来实现，但是化学药品浸泡 容易残留对人体有害的物质，因此存在不够安全有效的缺陷。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服化学药品浸泡法来防治果实病虫害时存在的不够安全有效 的缺陷，提供一种更加安全有效的微生物生物防治果实病虫害的方法。
[0005] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans)的菌株，其中，该菌株的保藏号为CGMCC NO. 8039。
[0006] 另一方面，本发明还提供了一种菌剂，其中，所述菌剂含有如上所述的菌株的活菌 体和培养基。
[0007] 另一方面，本发明还提供了如上所述的菌株和/或菌剂在防治果实病虫害中的用 途。
[0008] 再一方面，本发明还提供了一种防治果实病虫害的方法，其中，该方法包括：将含 有如上所述的菌株的活菌体的菌剂与果实接触。
[0009] 通过上述技术方案，本发明能够有效地实现对果实病虫害的防治，并且不会有有 害化学物质的残留。
[0010] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0011] 生物保藏
[0012] 本发明的菌株，分类命名为氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans),是本发明的 发明人从北京葡萄园区果实上分离的，于2013年08月16日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO. 8039。该菌株的生物学性状包括：菌体大小为（0. 5-0. 8) X (0. 9-4. 2) μ m，单独或成对 出现，鲜少链状，不形成内胞，属于革兰氏阴性菌；菌落呈白至黃色，有时略呈褐色，为圆形， 凸狀，边缘完整，直径约为3_。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0014] 图1是本发明的氧化葡糖杆菌在PDA培养基上25 °C下72小时后的菌落形态照片。
[0015] 图2是本发明的氧化葡糖杆菌在Yro培养基上25 °C下72小时后的菌落形态照片。
[0016] 图3是本发明的氧化葡糖杆菌在PDA培养基上对苹果灰霉病菌（Botrytis cinerea)的典型的抑制效果图。
[0017] 图4是本发明的氧化葡糖杆菌在PDA培养基上对桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)的典型的抑制效果图。
[0018] 图5是本发明的氧化葡糖杆菌在PDA培养基上对芽孢杆菌（Bacillus sp.)病菌 的典型的抑制效果图。
[0019] 图6是本发明的氧化葡糖杆菌在PDA培养基上对芽孢杆菌（Bacillus sp.)病菌 的典型的抑制效果图。
[0020] 图7是本发明的氧化葡糖杆菌在PDA培养基上对黑根霉菌（Rhizopus nigricans) 的典型的抑制效果图，其中图7 (A)是不加入本发明的氧化葡糖杆菌的对照，图7 (B)是加 入本发明的氧化葡糖杆菌的处理。
【具体实施方式】
[0021] 以下结合附图对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0022] 在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的液体的数值均为20°C下的数值。本 发明中，Yro培养基、LB培养基和PDA培养基是微生物培养中常规使用的培养基，它们的组 成可以为教科书(例如焦瑞身，微生物工程，化学工业出版社，2003)中的说明。
[0023] 本发明提供了一种氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的菌株，其中，该菌株 的保藏号为CGMCC NO. 8039。
[0024] 本发明还提供了一种菌剂，其中，所述菌剂含有如上所述的菌株的活菌体和培养 基。
[0025] 其中，如上所述的菌株的活菌体在所述菌剂中的含量没有特别的要求，只要维持 活菌体的存活状态即可，例如可以为l〇 5-l〇lclCFU/mL。
[0026] 其中，所述培养基可以为能够培养氧化葡糖杆菌的各种培养基，例如YH)培养基、 LB培养基和PDA培养基中的至少一种，例如可以为含有10-20g/L的葡萄糖、50-200g/L的 马铃薯和10-20g/L的酵母提取物的培养基。
[0027] 本发明还提供了如上所述的菌株和/或菌剂在防治果实病虫害中的用途。
[0028] 本发明还提供了一种防治果实病虫害的方法，其中，该方法包括：将含有如上所述 的菌株的活菌体的菌剂与果实接触。
[0029] 其中，如上所述的菌株的活菌体在所述菌剂中的含量可以为105-101(lCFU/mL。
[0030] 其中，接触的方式可以为浸泡；浸泡的时间可以为30-60秒。
[0031] 其中，该方法还可以包括，将接触后的果实置于贮藏条件下，所述贮藏条件可以为 常规的贮藏条件，例如贮藏条件可以包括：温度为1_5°C，相对湿度为90-95%。
[0032] 其中，所述果实可以包括苹果、梨、草莓、桃和葡萄中的至少一种；引起果实病虫害 的真菌可以包括番爺灰霉病菌（Botrytis cinerea)、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea)、 葡萄霜霉病菌（Plasmopara uiticola(Berk, dt Curtis))、葡萄白粉病菌（Uncinula necator)、梨青霉病菌（Penicillium expansum)、苹果灰霉病菌（Botrytis cinerea)、 苹果青霉病菌（Penicillium expansum (Link) Thom)、辣椒炭疽病菌（Gloeosporium piperatum)、番爺枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici Snyder et Hansen)、 桃褐腐病菌（Monilinia fructicola)、桃褐腐病菌（Monilinia laxa)、桃褐腐病菌 (Monilinia fructigena)、搜桃褐腐病菌（Monilinia fructicola)、黑曲霉（Aspergillus niger)、柑橘绿霉病菌（Ρ· digitatum(Fr.) Sail)、柑橘青霉病菌（Penicillium italicum) 和甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum)中的至少一种；引起果实病虫害的线虫包括秀丽隐 杆线虫（Caenorhabditis elegans)和 / 或南方根结线虫（Meloidogyne incognita)。
[0033] 以下将结合实施例进一步说明本发明。
[0034] 实施例1
[0035] 配制培养基，成分为20g/L的葡萄糖、50g/L的马铃薯和10g/L的酵母提取物。
[0036] 将保藏号为CGMCC NO. 8039的氧化葡糖杆菌接种并培养在上述培养基中，直至菌 体浓度为109CFU/mL，得到菌剂。
[0037] 该菌株的典型的菌落图照片如图1和图2所示。
[0038] 实施例2
[0039] 使用保藏号为CGMCC NO. 8039的氧化葡糖杆菌，对番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea)、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea)、葡萄霜霉病菌（Plasmopara uiticola(Berk.dt Curtis))、葡萄白粉病菌（Uncinula necator)、梨青霉病 菌（Penicillium expansum)、苹果灰霉病菌（Botrytis cinerea)、苹果青霉病菌 (Penicillium expansum (Link) Thom)、辣椒炭疽病菌（Gloeosporium piperatum)> # 爺枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici Snyder et Hansen)、桃褐腐病 菌（Monilinia fructicola)、桃褐腐病菌（Monilinia laxa)、桃褐腐病菌（Monilinia fructigena)、搜桃褐腐病菌（Monilinia fructicola)、黑曲霉（Aspergillus niger)、柑橘 绿霉病菌（P. digitatum (Fr.) Sail)、柑橘青霉病菌（Penicillium italicum)和甘蓝枯萎病 菌（Fusarium oxysporum),以及秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)和/或南方根结 线虫（Meloidogyne incognita)进行抑菌效果的检测，得到如表1所示的结果。
[0040] 其中，选择桃米后褐腐病病囷、等果米后灰霉病囷、等果米后青霉病囷等为指不真 菌，采用平板对峙培养法和果实体内人为打孔接种法。
[0041] 平板对峙培养法具体操作如下：保藏号为CGMCC NO. 8039的氧化葡糖杆菌菌株在 PDA培养基上25°C恒温培养48h。植物病原真菌在PDA平板上25°C恒温培养3-4天，自菌 落边缘用直径〇. 7cm无菌不锈钢打孔器打制带菌琼脂片；用无菌接种针挑取病原菌菌片， 菌丝面朝下接种于PDA平板中心处，同时在距病原真菌菌片两侧均约3. OOcm处用无菌接种 环划线保藏号为CGMCC NO. 8039的氧化葡糖杆菌，以仅接病原菌的平板为对照，每个处理三 次重复，25°C恒温培养5-7天，测量病原真菌边缘与保藏号为CGMCC NO. 8039的氧化葡糖杆 菌的菌落带宽中心之间的抑菌带宽度。
[0042] 果实体内人为打孔接种法具体操作（以防治苹果采后灰霉病为例进行说明）如下： 保藏号为CGMCC NO. 8039的氧化葡糖杆菌菌株在液体培养基上28°C恒温培养48h，用蒸 馏水调至菌液浓度为5 X 107CFU/ml，得到抗病菌液。苹果灰霉病菌B. cinerea在PDA平板上 25°C恒温培养5-7天，收集灰霉菌孢子，用蒸馏水制成5 X IO4CFUAiI的孢子悬浮液；成熟的 苹果，先用0. 5%次氯酸钠消毒之后，用灭过菌的移液器枪头，沿着苹果腰部插孔，每个果子 扎孔3个，每个孔为30mmX 30mm。每孔接种30 μ 1抗病菌液，室温晾干，然后再接种30 μ 1 的病原菌孢子悬浮液。最后，处理的果子放置于25°C下，5-7天后，测定果实腐烂斑大小。腐 烂斑小于IOmm被视为不发病。根据腐烂病斑的占总接种孔数的多少，计算发病率，未发病 的病斑数占总接种孔数的多少，计算病斑抑制率。
[0043] 其中，对苹果灰霉病菌（Botrytis cinerea)、桃褐腐病菌（Monilinia fructicola)、芽孢杆菌（Bacillus sp.)和黑根霉菌（Rhizopus nigricans)的典型的抑制 效果图如图3、4、5、6和7所示。
[0044] 表I. CGMCC NO. 8039的氧化葡糖杆菌对不同病原菌的抑制效果
[0045]
【权利要求】
1. 一种氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans)的菌株，其特征在于，该菌株的保藏号 为 CGMCC NO. 8039。
2. -种菌剂，其特征在于，所述菌剂含有权利要求1所述的菌株的活菌体和培养基。
3. 根据权利要求2所述的菌剂，其中，权利要求1所述的菌株的活菌体在所述菌剂中的 含量为 105-101QCFU/mL。
4. 根据权利要求2或3所述的菌剂，其中，所述培养基含有10-20g/L的葡萄糖、 50-200g/L的马铃薯和10-20g/L的酵母提取物。
5. 权利要求1所述的菌株和/或权利要求2-4中任意一项所述的菌剂在防治果实病虫 害中的用途。
6. -种防治果实病虫害的方法，其特征在于，该方法包括：将含有权利要求1所述的菌 株的活菌体的菌剂与果实接触。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述的菌株的活菌体在所述菌剂中的含量为 105-1010CFU/mL。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其中，接触的方式为浸泡；浸泡的时间为30-60秒。
9. 根据权利要求6所述的方法，其中，该方法还包括，将接触后的果实置于贮藏条件 下，所述贮藏条件包括：温度为1_5°C，相对湿度为90-95%。
10. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述果实包括苹果、梨、草莓、桃和葡萄中的 至少一种；引起果实病虫害的真菌包括番爺灰霉病菌（Botrytis cinerea)、葡萄灰霉病 菌（Botrytis cinerea)、葡萄霜霉病菌（Plasmopara uiticola(Berk.dt Curtis))、葡 萄白粉病菌（Uncinula necator)、梨青霉病菌（Penicillium expansum)、苹果灰霉病菌 (Botrytis cinerea)、苹果青霉病菌（Penicillium expansum (Link) Thom)、辣椒炭疽病 菌（Gloeosporium piperatum)、番爺枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici Snyder et Hansen)、桃褐腐病菌（Monilinia fructicola)、桃褐腐病菌（Monilinia laxa)、桃褐腐病菌（Monilinia fructigena)、搜桃褐腐病菌（Monilinia fructicola)、 黑曲霉（Aspergillus niger)、柑橘绿霉病菌（P. digitatum(Fr.) Sail)、柑橘青霉病菌 (Penicillium italicum)和甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum)中的至少一种；弓丨起 果实病虫害的线虫包括秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)和/或南方根结线虫 (Meloidogyne incognita)。
【文档编号】C12R1/01GK104371943SQ201410038325
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】全利红 申请人:北京绿环国际科技有限公司