一株高产细菌纤维素的耐高温中间葡糖醋杆菌的制作方法
【专利摘要】本发明属生物【技术领域】，涉及一株高产细菌纤维素的耐高温菌株中间葡糖醋杆菌（Gluconacetobacterintermedius）1-17及利用该菌高产细菌纤维的方法。该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.8318。该菌的生物学特性是形状短杆状，革兰氏阴性，不产芽孢，VP实验阳性，耐3%乙酸和5%乙醇，耐40℃高温，能够利用乙醇、葡萄糖产乙酸。中间葡糖醋杆菌1-17（Gluconacetobacterintermedius1-17）是一株耐高温的菌株，能够在25～40℃的温度下生产细菌纤维素，最适温度为35～37℃。该菌株能够利用甘油，葡萄糖，甘露醇，蔗糖，果糖等多种碳源生产细菌纤维素，在改良的HS培养基中培养细菌纤维素的产量可达到8.7g/L。由该菌产生的细菌纤维素能够广泛的应用于食品，医药，造纸和电子等行业，该菌株的发现可为细菌纤维素的获得可提供微生物资源基础。
【专利说明】一株高产细菌纤维素的耐高温中间葡糖醋杆菌
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一株高产细菌纤维素的耐高温菌株中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter intermedius ) 1-17及利用该菌高产细菌纤维素的方法。
【背景技术】
[0002]细菌纤维素(Bacteria cellulose，BC)是一种由细菌发酵产生的天然纤维素的统称。细菌纤维素与植物纤维素具有相同的化学组成，但细菌纤维素的形态结构和超分子结构与植物纤维素有很大的不同，属于典型的生物纳米纤维材料。细菌纤维素是一种新型的纳米级生物材料，其优点有:(I)高化学纯度，细菌纤维素与植物纤维素相比不含果胶质等杂质，用发酵法生产细菌纤维素，提取过程很简单，只需通过稀碱液处理就可以除去培养基和细胞，最终产品质地纯，纤维素含量高，而一般的植物纤维，必须在高温下用浓碱进行强烈消化，才能溶解除去紧贴纤维素的木质素、半纤维素等成分；(2)纤维超细(纳米级)，由细菌细胞壁侧的小孔分泌出的相邻几根微纤丝间由氢键相互联接形成的微纤丝束直径为3-4nm，而由微纤维束联接成的纤维丝带宽度为30_100nm ;(3)高结晶度，细菌纤维素的结晶度高于普通高等植物纤维，而低于藻类和动物纤维；(4)很好的可修饰性，用不同的培养方法，如静态培养和动态培养可以得到不同高级结构的纤维素，并且通过调节培养条件也可以得到化学性质有差异的细菌纤维素；(5)很好的生物亲和性和降解性。细菌纤维素具有较高的生物适应性，在自然界中可以直接降解，不污染环境，是环境友好产品；(6)高的保水性，由于细菌纤维素的超细纳米结构及分子内存在着大量的亲水性基团，使其具有极强吸水和持水保湿能力，一般情况下，持水率高达97%以上；(7)很好的透气性；(8)极佳的形状维持能力和抗撕力，由于细菌纤维素中存在大量羟基，容易形成很强的分子内和分子间氢键，氢键的存在对纤维的杨氏模量和抗拉强度有很重要的影响。细菌纤维素具有的这些优点使其广泛应用于食品行业，医用材料(人造皮肤、血管，组织等)，造纸工业，电子行业，高级音响设备振动膜，纳米级复合材料，燃料电池等领域。
·[0003]目前产细菌纤维素的微生物有葡糖醋杆菌属如cier),假单孢杆菌属 QPseudomonas), 土壤杆菌属(Agrobacteriurn),无色杆菌属(Achromobacter ),气杆菌属iAerobac ter )，产喊杆菌属iAlcaligcncs ),固氣菌属(Azo tobac ter ),八叠球菌{Sarcina )和根瘤菌属等,其中葡糖醋杆菌属是应用最广泛的属。目前葡萄醋杆菌属中已有报道的产细菌纤维素的微生物有7个种，他们分别是G xylinus, G.medellensis, G.hansenii, G.sacchari, G.1n termed!us, G.kombuchae 取 G.swings!i,其中采用G生产细菌纤维素的应用最广泛。
[0004]细菌纤维素的生产周期长，通常为10-15d，成本高，产量低，消耗大量的人力物力。已报道产细菌纤维素的菌株其最适温度一般在25-30°C之间，通常为28°C和30°C，温度稍高其生产细菌纤维素的速率和产量均会下降。提高细菌纤维素的产量通常有两种方法，一是通过改善培养基成分和培养条件使得细菌纤维素的产量能够有一定程度的提高，二是对已有菌株进行改造或筛选新的菌株。用于筛选产细菌纤维素菌株的原材料有蔬菜，水果，食醋，发酵产品，土壤等。因此筛选生产效率高和产量高的菌株具有较好的应用价值。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一株高产细菌纤维素的耐高温菌株中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter intermedius ) 1-17,以及利用该菌株高产细菌纤维素的方法。该菌株在25~40°C的条件下能够快速合成细菌纤维素，最适温度为35~37°C。在培养基中添加
0.4%的乳酸钙能够显著提高细菌纤维素的产量，产量达8.7 g/L。
[0006]本发明的发明人从传统发酵食醋醋醅中分离获得的一株中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter intermedius )1_17，该菌于2013年10月10日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国科学研究院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8318。
[0007]本发明中间葡糖醋杆菌1-17 (Gluconace tobac ter Υ/--6?/--(9￡//?5.1-17)的菌体形状为短杆状，革兰氏阴性，不产芽孢，VP实验阳性，耐3%乙酸和5%乙醇，耐40°C高温，能够利用甘油，葡萄糖，甘露醇，蔗糖，果糖等多种碳源生产细菌纤维素。
[0008]本发明中间葡糖醋杆菌1-17 (Gluconace tobac ter Υ/--6?/--(9￡//?5.1-17)通过 16SrDNA序列比对分析,序列长1455bp,与中间葡糖醋杆菌{Gluconacetobacter intermediusNR_026435.1)的16S rDNA序列同源性最高，相似性为99%，通过结合菌体形态特征，生理生化特征确定间葡糖醋杆菌1-17属于葡糖醋杆菌属为中间葡糖醋杆|if {Gluconacetobacter in termed! us )菌株。
[0009]应用上述微生物生产细菌纤维素的方法，其步骤如下:
(1)采用保藏号为CGMCCN0.8318的中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterintermedius )1_17为生产菌种，按照常规方法进行活化培养得到种子液，将该种子液划线于HS培养基上培养2-3天；`
(2)制备中间葡糖醋杆菌1-17菌株的种子液:挑取步骤(1)的HS固体培养基上的单菌落一环，接种于已灭菌的装有IOmL种子培养基的50 mL锥形瓶中，培养温度为25~40°C，置摇床上以150~190 r/min的转速培养24~48h，得到一级种子。将一级种子接种于装有50ml种子培养基的250ml锥形瓶中，培养温度为25~40°C，置摇床上以15(Tl90 r/min的转速培养24~48h，之后用力震荡，打碎纤维素凝胶团，使微生物悬浮于液体培养基中，得到菌悬液，用于接种发酵培养基；
(3)细菌纤维素合成:将步骤(2)中制备好的菌悬液以5~10%(v/v)的接种量接入改良后的HS培养基中，装液量为250 mL锥形瓶中装50 mL发酵培养基，培养温度为25~40°C，静置培养6~8 d，得到细菌纤维素菌膜。
[0010](4)细菌纤维菌膜的处理方法。将细菌纤维素菌膜从液体培养基中取出，用去离子水冲洗，将细菌纤维素菌膜浸泡于0.1M的NaOH溶液中煮沸15min，以除去膜中的菌体及残留培养基，之后用去离子水冲洗浸泡过夜，直至PH小于7，即得到纯净的细菌纤维素膜。
[0011]其中步骤(1)中所述的HS培养基的成分及配比为:葡萄糖20g/L，蛋白胨5 g/L,酵母粉 10 g/L，一水合柠檬酸 1.15 g/L，Na2HPO4.12H20 4 g/L, pH 6.0~6.8，121°C 高压蒸汽下灭菌20 min。冷却后加2%乙醇。
[0012]步骤(3)中所述的改良后的HS培养基成分及配比为:葡萄糖20g/L，甘油10 g/L,蛋白胨5 g/L，酵母粉10 g/L，一水合柠檬酸1.15 g/L, Na2HPO4.12H20 4 g/L，七水硫酸镁
0.1 g/L,抗坏血酸0.02 g/L。pH 6.0~6.8,121 °C高压蒸汽下灭菌20 min,冷却后加2%乙醇。
[0013]本发明所述的中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter intermedius ) 1-17菌株发现可利用葡萄糖，甘油等碳源高产细菌纤维素，并且耐高温，在35~37°C下细菌纤维素生产速率快，是一株极具开发研究价值的生产菌株。
[0014]
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter intermedius ) 1-17革兰氏染色显微拍照。
[0016]图2为中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter intermedius )1-17所产细菌纤维素膜生成及处理后。
[0017]图3为细菌纤维素菌膜傅里叶红外光谱图。
[0018]图4为细菌纤维素扫描电镜图。
[0019]
【具体实施方式】
[0020]实施例1菌种的分·离及鉴定
取IOg醋醅样品装入混有玻璃珠和90mL无菌生理盐水的500mL三角瓶中，200rpm震荡30min后取菌悬液用无菌生理盐水10倍梯度稀释(10_卜10_5)。取200ul合适梯度的稀释液，涂布平板，30 °C培养3-5d，挑取单菌落进行液态培养。根据伯杰式菌种鉴定手册和16SrDNA基因序列分析对其进行鉴定。
[0021]分离培养基:酵母粉5g/L,蛋白胨3g/L,甘露醇25g/L,轻质碳酸|丐10g/L,琼脂
1.5g/L, pH6.8,121°C灭菌 20min,冷却后加乙醇 5ml/L。
[0022]实施例2 中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter intermedius ) 1-17产细菌纤维素
(1)接种菌种的HS平板培养基置于35~37°C的恒温培养箱中，培养2-3天，用接种环挑取一单菌落接种于装有50mL种子培养基的250 mL摇瓶中，在35~37°C，150~190 rpm摇床上培养24-48 h,震荡使菌体悬浮于液体培养基中得到适于接种的种子培养液；
(2)将种子培养液以5~10%的接种量接入装有50mL发酵培养基的250 mL的摇瓶中，35~37°C静置培养6-8d，得到厚厚的细菌纤维素菌膜；
实施例3:细菌纤维素菌膜的处理:
将细菌纤维素菌膜从液体培养基中取出，用去离子水冲洗，将细菌纤维素菌膜浸泡于
0.1M的NaOH中煮沸15 min,以除去膜中的菌体及残留培养基，之后用去离子水冲洗浸泡过夜，直至pH小于7，即得到纯净的细菌纤维素膜。
[0023]实施例4:培养条件优化:
(I)温度对其产细菌纤维素的影响。中间葡糖醋杆菌1-17在不同温度下(25°C，28°C，30°C，33°C，35°C，37°C，40°C )培养生成细菌纤维素。选取最适温度做为以后的培养温度。[0024](2)碳源对其产细菌纤维素的影响。中间葡糖醋杆菌1-17利用葡萄糖，甘油，甘露醇，蔗糖，果糖及其复合碳源生产纤维素。将最适碳源做为以后研究的基础碳源。
[0025](3)不同起始pH对其产细菌纤维素的影响。中间葡糖醋杆菌1-17在不同pH(6.5，6.0，5.5,5.0,4.5,4.0,3.5,3.0)培养生成细菌纤维素。 将最适pH做为以后研究的起始pH。
【权利要求】
1.一株高产细菌纤维素的耐高温菌株，该菌株经鉴定为中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter intermedius)l_17,保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学研究院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.8318，保藏日期为2013年10月10日。
2.利用权利要求1的中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterintermedius) 1-17产细菌纤维素的方法，其特征为: (1)将中间葡糖醋杆菌1-17从平板上挑取单菌落接入到种子培养基中，25lO°C，170-200 r/min培养48 h，得到种子液；种子培养基组成是葡萄糖30 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨 5 g/L，一水合柠檬酸 1.15 g/L, Na2HPO4 4 g/L ；MgS047 H2O 0.01g/L，灭菌前调培养基的pH至6.0-6.8，在121 °C高压蒸汽下灭菌20 min，灭菌后加2%乙醇； (2)将种子培养基中产生的纤维素团用力打散，使得菌体细胞进入液体培养基中，制成菌悬液，种子以59TlO%的接种量接种于发酵培养基，装液量为250 mL锥形瓶中装50 mL发酵培养基，静置培养，培养温度为25~4(TC，培养时间为5~8 d，得到细菌纤维素膜；发酵培养基组成为:葡萄糖20 g/L,甘油10g/L,酵母粉10g/L,蛋白胨5g/L,—水合柠檬酸1.15g/L，Na2HPO4 4 g/L, MgS047 H2O 0.01g/L，乳酸钙 0.4% ;灭菌前调培养基的 pH 至 6.0~6.8，在121°C高压蒸汽下灭菌20min，灭菌后加2%乙醇。
【文档编号】C12R1/01GK103667148SQ201310678608
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月14日 优先权日:2013年12月14日
【发明者】许正宏, 史劲松, 陆震鸣, 苏俊霞, 王宗敏, 李国权, 余永建 申请人:江南大学