一株产游离葡萄糖醛酸的木糖葡糖醋杆菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株产游离葡萄糖醛酸的木糖葡糖醋杆菌，属于生物工程领域。本发明筛选的菌株木糖葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)Q1，已于2014年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2014353。从红茶菌中筛选分离到，能够以葡萄糖为底物发酵生产葡萄糖醛酸的菌株，简单发酵条件下游离葡萄糖醛酸含量约为12.96mg/L。
CCTCC NO：M2014353
2014.07.23
【专利说明】一株产游离葡萄糖醛酸的木糖葡糖醋杆菌
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株产游离葡萄糖醛酸的木糖葡糖醋杆菌，属于发酵【技术领域】。
【背景技术】
[0002]葡萄糖醒酸,英文名为Glucuronic acid,是葡萄糖C-6位的轻基被氧化成羧基所形成的糖醛酸，葡萄糖醛酸是传统的肝脏解毒剂和免疫功能调节剂，其分子中同时存在高反应活性的醛基和羧基，可与人体内源性及外源性有毒物质中的基团如羟基、羧基、巯基、氨基等作用，从而增加毒性物质的水溶性使其易于随尿与胆汁排出体外。
[0003]葡萄糖醛酸可作为中间体合成许多重要医药如D-葡糖二酸钙和L-抗坏血酸等。此外，葡萄糖醛酸也常用作功能性饮料、减肥药、化妆品等的添加剂，其在医药和保健品等领域也都有着广泛的应用。
[0004]目前葡萄糖醛酸主要通过硝酸氧化法来生产，即淀粉在酸性条件下经硝酸氧化后加压水解来生成，但该工艺存在一些问题如能耗高、选择性差、产品收率低、环境污染严重等。而发酵法生产葡萄糖醛酸成本较低，对环境污染也较小，并且以葡萄糖为底物发酵生产葡萄糖醛酸可减轻原料来源的限制。
[0005]目前，国内外研究者在世界不同地区的红茶菌饮料中均检测到葡萄糖醛酸的存在，但均为混合菌群发酵，利用单一微生物菌种发酵产葡萄糖醛酸还大都处在研究阶段。本发明筛选到以葡萄糖为底物生产葡萄糖醛酸的微生物菌株，对该菌进行了鉴定，确定其为木糖葡糖醋杆菌，对其发酵条件进行了初步研究，为微生物发酵法生产葡萄糖醛酸奠定了基础。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一株产游离葡萄糖醒酸的木糖葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterxylinus)Ql，已于2014年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为:CCTCC No:M2014353。
[0007]所述木糖葡糖醋杆菌Q1，用GY培养基培养时，菌落呈圆形，表面干燥光滑，边缘规贝U，菌落直径大小0.2-0.5_。革兰氏阴性，100X显微镜下观察细胞呈短杆状。
[0008]所述木糖葡糖醋杆菌Ql能够发酵生产葡萄糖醛酸，所得葡萄糖醛酸游离于发酵上清液中，而不在胞外多糖中。
[0009]所述木糖葡糖醋杆菌Ql的筛选是在GY培养基中，以从红茶菌中筛选分离的菌株为生产菌株，在装液量为25mL的250mL三角瓶中30°C、200rmp/min的条件下培养72h，通过液质联用(LC-MC)定性检测发酵液中物质成分再通过离子色谱定量检测发酵液中物质的含量，筛选出能以葡萄糖为底物发酵产葡萄糖醛酸的菌株。
[0010]本发明要解决的第二个技术问题是提供一种应用所述木糖葡糖醋杆菌Ql发酵生产葡萄糖醛酸的方法，是将菌株活化后，接种于GY培养基，28-3(TC，200-220r/min摇床培养4-5天。发酵上清液中含有葡萄糖醛酸。
[0011]所述GY培养基含有葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L，纤维素酶15000-20000U/L。
[0012]本发明利用木糖葡糖醋杆菌Ql将廉价底物葡萄糖转化成具有附加价值较高的葡萄糖醛酸，其是重要的化工原料和医药中间体；同时用微生物法生产葡萄糖醛酸，与化学法相比具有反应条件温和、原料利用率高、产品纯度高等优点，同时有利于环境保护，易于推广应用。
[0013]生物材料保藏
[0014]木糖葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterxylinus)Ql,已于 2014 年 7 月 23 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为:CCTCC No:M2014353。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1葡萄糖醛酸LC-MC图谱，A:葡萄糖醛酸标样一级质谱图；B:Gluconacetobacter xylinus Ql 发酵液质谱图。
[0016]图2葡萄糖醛酸标准品离子色谱图谱，出峰时间10.117min。
[0017]图3G.xylinus Ql以葡萄糖为底物72h发酵液离子色谱图谱，出峰时间10.150mino
【具体实施方式】
[0018]胞外多糖中葡萄糖醛酸的检测方法:
[0019]将菌体在GY培养基中30°C、200r/min条件下培养72h，以8000rpm离心15min，取清液。将4倍上清液体积的乙醇加入到上清液中，并将混合物保持在4°C下过夜。以8000r/min离心15分钟收集沉淀。将沉淀干燥，加入5倍上清液体积的0.5mol/L的H2SO4溶液，在70°C反应3h。将水解液通过0.45 μ m滤膜过滤，LCMS检测产物。
[0020]葡萄糖醛酸分析方法的确定:
[0021]葡萄糖醒酸的标样在Shimadzu Shim-Pack VP-0DS (150mmX 2.0mm, 5 μ m)柱上通过离子阱-飞行时间液质联用仪(LCMS-1T-T0F)进行分析，保留时间为1.85-2.48min。所用的液质联用仪为日本岛津(Shimaduz)公司制造，确定的色谱条件为:流动相:含0.01%甲酸和ImM甲酸铵的75%甲醇-水；流速:0.75mL/min ;平衡温度:40°C ;进样量:5 μ L ;质谱条件:
[0022]葡萄糖醛酸的定性检测:
[0023]采用LCMS-1T-T0F液质联用鉴定产物中是否有葡萄糖醛酸，将发酵液于1000g离心5min，取上清液，用超纯水将上清稀释10倍，用0.22 μ m孔径的微滤膜过滤后进样检测。液相色谱条件:流动相为75%甲醇-水(0.01 %甲酸，ImM甲酸铵)，流速0.75mL/min,柱温400C，进样量5 μ L。质谱条件:干燥气流速10L/min，喷雾器1.5L/min,气体温度200°C，电离方式为ESI负极模式，单反应监测离子150-300m/z，累积时间30ms，ESI电压170kV，碎裂能量60%。
[0024]葡萄糖醛酸的定量检测:
[0025]用离子色谱法(IC)检测发酵液中产葡萄糖醛酸的生成量，将发酵液于1000g离心5min，取上清液，用超纯水稀释10倍，用0.22 μ m孔径的微滤膜过滤后进行检测。离子色谱条件:采用戴安ICS-5000离子色谱仪，脉冲安培检测器，CarboPac PA200分析柱(3mmX 250mm),流动相为 250mmol/L 氢氧化钠-水；流速:0.5mL/min。
[0026]GY培养基:葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L纤维素酶15000-20000U/L。
[0027]GYC固体培养基:葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L，碳酸钙20g/L，琼脂20g/L。
[0028]实施例1菌株的筛选
[0029](I)菌株筛选
[0030]取少量红茶菌菌膜在GY培养基中富集，30°C下，200r/min摇床培养48h，依次稀释成ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—7 5个梯度，分别取稀释后的样品各200 μ L涂布于含100mg/mL纳他霉素的GYC固体培养基，每个稀释梯度重复2次。挑取单菌落于30°C培养72h。挑选有透明圈的单菌落接种于GY培养基，30°C，200r/min摇床培养至对数期取样保藏，收集培养72h发酵液，离心，取上清液以备检测。从筛选得到的诸多菌中筛选得到一株产量较高的Ql进行下一步的菌株鉴定。
[0031](2)菌种鉴定菌
[0032]提取出发菌株Ql的基因组DNA，以出发菌株的基因组DNA为模板，使用通用引物20F、1500R 扩增 16S rDNA 片段。
[0033]PCR方法如下:50μ L反应体系中加入:10mol/L的引物20F和1500R各1.5μ L，2 X Super Pfu Mixture25 μ L，模板I μ L，加双蒸水补齐至50 μ L ;PCR条件为:94°C预变性3min，l 个循环，94°C变性 30s，48。。退火 30s，72。。延伸 lmin, 30 个循环，68°C 8min，I 个循环。
[0034]用胶回收试剂盒纯化PCR产物，核酸电泳验证；连接到PMD19-T载体，转化E.coliJM109o经氨苄青霉素抗性筛选，获得阳性克隆。16S rDNA测序由上海生工生物科技有限公司完成，将测序结果在NCBI中与已有序列进行Blast比对分析。鉴定为木糖葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)Ql0
[0035]木糖葡糖醋杆菌Ql用GY培养基培养时，菌落呈圆形，表面干燥光滑，边缘规则，菌落大小0.2-0.5_。革兰氏阴性，100X显微镜下观察细胞呈短杆状。
[0036]实施例2葡萄糖醛酸定性检测
[0037]将木糖葡糖醋杆菌Ql固体GY培养基上活化后接种于装有25mLGY培养基的250mL的三角瓶中，30°C、200rmp/min的条件下培养72h后，收集发酵液，离心，取上清液以备检测；用离子色谱法检测发酵液中葡萄糖醛酸含量。
[0038]测定葡萄糖醛酸标样LC-MS图谱，并G.xylinus Ql的发酵液上清稀释10倍后用于LC-MS检测，将两者对比进行图谱分析，如图1所示，在2min处质谱扫描图中葡萄糖醛酸标样的分子量大小为193.0369,样品在同一时间处检测到相同分子量(193.0370)的物质，
确定发酵液中含有葡萄糖醛酸。
[0039]实施例3胞外多糖中葡萄糖醛酸检测方法的确定:
[0040]将菌体在GY培养基中30°C、200r/min条件下培养72h，以8000rpm离心15min，取上清液。用4倍上清液体积的乙醇加入到上清液中，并将混合物保持在4°C下过夜。以8000r/min离心15分钟收集沉淀。将沉淀干燥，加入5倍上清液体积的0.5mol/L的H2SO4溶液，在70V反应3h。将水解液通过0.45 μ m滤膜过滤，LCMS检测产物，检测结果显示胞外多糖中不含有葡萄糖醛酸。
[0041]实施例4用离子色谱法(IC)检测发酵液中产葡萄糖醛酸的生成量。
[0042]将实施例1所得G.xylinus Ql发酵上清液在1000g离心5min后，取上清液，用超纯水稀释10倍，0.22 μ m孔径的微滤膜过滤。离子色谱条件:采用戴安ICS-5000离子色谱仪，脉冲安培检测器，CarboPac PA200分析柱(3mmX 250mm),流动相为250mmol/L氢氧化钠-水；流速:0.5mL/min。如图2、3所示，葡萄糖醛酸在离子色谱上保留时间为1.85-2.48min。检测显示发酵液中葡萄糖醛酸含量为12.96mg/L。
[0043]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一株产葡萄糖醒酸的木糖葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)Ql,已于2014年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为:CCTCC No:M2014353。
2.权利要求1所述的木糖葡糖醋杆菌Ql在葡萄糖醛酸生产中的应用方法。
3.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，是将菌株活化后，接种于GY培养基，28-30 0C，200-220r/min 摇床培养 4-5 天。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述GY培养基含有葡萄糖100g/L，酵母提取物10g/L，纤维素酶15000-20000U/L。
5.权利要求1所述的木糖葡糖醋杆菌Ql的应用。
【文档编号】C12R1/01GK104328073SQ201410605220
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】方芳, 刘晓慧, 仇钰莹, 陈坚 申请人:江南大学