专利名称：一种用环介导等温扩增技术检测海水淋巴囊肿病毒的方法
技术领域：
本发明属于水体病原体污染检测领域，主要内容是利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification LAMP)技术,以主要衣壳蛋白基因(major capsid protein gene， MCP)为靶基因，快速检测海水中淋巴囊肿病毒(Lymphocystisdisease virus, LCDV)。用该 方法能方便地评价环境中淋巴囊肿病毒的污染情况，为海水养殖业提供预警信息。
背景技术：
淋巴囊肿病毒隶属虹彩病毒科(/n'AWWcfae)、淋巴囊肿病毒属((ymp/wc"riv/nO，广泛分 布于世界各地的淡水、半咸水和海水中，可感染多种鱼类。欧洲、美洲、日本和我国均有相当 数量的淋巴囊肿病毒感染鱼类的病例，给养殖业造成重大经济损失。
监测养殖环境的海水中淋巴囊肿病毒的污染状况，能够给养殖场及时提供疾病防治预警 信息，大大方便该病的预防，使得及时采取措施成为可能。目前检测淋巴囊肿病毒的方法主 要依靠病毒粒子培养，检测费时费力，并且可靠性差。目前使用的检测方法需要用病鱼作为 样本，无法检测养殖环境中的病毒分布。本方法以养殖海水作为样本，目的不在于获得单条 鱼个体的感染状况，而是提供养殖环境的病原体污染状况信息，包括新的养殖投放环境的监 测。本技术采用环介导等温扩增方法，反应时间短，操作简单，灵敏度高，适于推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种用环介导等温扩增技术检测海水中淋巴囊肿病毒的方法。本发 明主要针对衣壳蛋白基因设计七种特异引物，具有极高的特异性和灵敏度。检测时间只需2 个小时左右。用该方法能提高检测效率和检测的准确度，而且所需设备简单，可用于野外实 地检测。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的
一种用环介导等温扩增技术检测海水中淋巴囊肿病毒的方法，该方法的检测步骤如下
(1) 设计用于LAMP扩增的特异性寡核苷酸引物
lvFIPl: 5' GTATCCGCACCATATAGATGTTTTTAGCGCTATTATACATATACC3' lvFIP2: 5' GATTCCGCACCATATAGATGTTTTATCACTTGTGTAGCCGGTTC 3' 固P: 5' TCTACGTGCTTCAGTATATTACCTTTTATTCTTGTTCATAATTAGGTG 3' lvF3: 5' TATCACTTGTGAAGCGCGTTC 3' 1vB3: 5， ATTCGCTCCGTCAACGAAGC 3' lvIF: 5' GCCCTATTATACATTTAGG 3' MB: 5' CGAACATAATAAGGTACACC 3'
(2) DNA抽提1) 取10L养殖海水，用0.45nm孔径滤膜过滤，去除细菌细胞。
2) 用截留分子量为100kD的小型超滤装置，将10L除菌海水浓縮到200raL。
3) 用Centriconplus-70超滤离心管离心(5000r/min， 5min)处理，将上述200mL 含有病毒的水进一步浓縮到0. 5mL。
4) 将上述O. 5mL浓缩海水在沸水中煮5min，然后冰浴2min,置-20'C保存备用。
(3)环介导等温扩增(LAMP)
1) LAMP反应体系
在PCR试剂管内加入下列试剂，使总体积为25pL:
成分 体系中各组分终浓度和体积 IOX反应缓冲液 2.5pL
BstDNA聚合酶 8U (lpL)
lvFIPl (LAMP1) /lvFIP2 (LAMP2) 40 pmol (叫)
lvBIP 40 pmol (化L)
lvF3 5 pmol (0.5pL)
lvB3 5 pmol (0.5|xL)
lvIF 5 pmol (0.5|aL;
1vIB 5 pmol (0.5nL)
dNTPs lOmmol/L (0.5(xL)
DNA样品 50ng
双蒸水 lOpL
10 X反应缓冲液200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)， lOOimnol/L KCl， 100 mmol/L
(NH4)2S04, 20mmol/L MgS04, 1 % Triton X-100)
2) LAMP扩增程序
① 将模板DNA 95'C变性5分钟，立即插到冰上；
② 62。C保持60分钟；
③ 8(TC保持2分钟。 (4) L細P扩增产物检测
1) 电泳检査
LAMP产物用2.0X琼脂糖凝胶进行电泳，用溴化乙啶染色，在紫外分析仪下观察， 阳性结果条带呈梯状分布，间距50bp左右。
2) 荧光染料SYBR Green I染色后观察判定
在LAMP扩增产物中加入O. 5pL的10XSYBR Green I荧光染料浓縮液，通过肉眼观察。 阳性样本显绿色，阴性样本显橙黄色。 本发明还可以用于检测其它水体中的淋巴囊肿病毒。
与现有技术相比，本发明的有益效果是基于DNA的鉴定方法适用于从含病毒的养殖海水中直接运用环介导等温扩增方法扩增特异性靶基因，从而检测淋巴囊肿病毒。LAMP方法 具有检测准确、特异性强，操作方便，设备简单的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目标 病原体。它用环介导等温扩增方法扩增病毒特异性靶基因，避免了冗长的一系列生化反应， 节约时间、劳动力和成本。L認P鉴定方法不受病毒生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更 为准确。
图1:养殖海水样本1用LAMP反应检测结果。
图2:养殖海水样本2用LAMP反应检测结果。
图3 :养殖海水样本1的LAMP1扩增产物SYBR Green I染色结果。
图4 :养殖海水样本2的L認P1扩增产物SY服Green I染色结果。
具体实施例方式
下面结合附图与具体实施方式
对本发明作进一步详细描述。
实施例l:养殖海水样本l
1病毒颗粒收集和模板DNA制备
(1) 取10L养殖海水(牙鲆)先用0.45um孔径滤膜过滤，去除细菌细胞。
(2) 由100kDa过滤膜超滤浓縮到200mL。
(3) 通过Centricon plus-70级离心管重复离心(5000r/min' 5min)'将这200mL水 (含有LCDV病毒颗粒)进一步浓缩成0. 5mL。
(4) 0. 5mL液体在沸水中煮5min，然后冰浴2min。置-20。C保存备用。 2环介导等温扩增(LAMP)
(1) LAMP反应体系
在扩增管内加入下列试剂，使总体积为25pL:
成分 体系中各组分终浓度和体积
IOX反应缓冲液 (2.5pL)
BstDNA聚合酶 8U (lnL)
lvFIPl (LAMPI) /1vFIP2 (LAMP2) 40pmol(4pL)
lvBIP 40 pmol (4pL)
lvF3 5 pmol (0早)
lvB3 5 pmol (0早)
lvIF 5 pmol (0.5(iL)
函 5 pmol C0.5pL)
dNTPs 10mmol/L(0.5)aL)
DNA样品 50ng
双蒸水 10pL 10 X反应缓冲液200 mmol/L Tris- HC1 (pH 8.8), 100mmolZL KC1, 100 mmol/L(NH4)2S04, 20mmol/L MgS04, 1% Triton X-100 (2) LAMP扩增程序
① 将模板DNA 95'C变性5分钟，立即插到冰上；
② 62t:保持60分钟；
③ 8(TC保持2分钟。
3 LAMP扩增产物检测
1) 电泳检査
LAMP产物用2.0W琼脂糖凝胶进行电泳，用溴化乙啶染色，在紫外分析仪下观察，阳性结 果条带呈梯状分布，间距50bp左右。见附图l。
附图1:养殖海水样本1用LAMP反应检测结果
图中泳道1、 2:养殖海水样本1 LAMP 1扩增结果
泳道3、 4:养殖海水样本1 LAMP2扩增结果
泳道5:阴性对照LAMP1扩增结果
泳道6:阴性对照LAMP2扩增结果
1、 2、 5泳道所用引物为序列一、序列三、序列四、序列五、序列六和序列七
3、 4、 6泳道所用引物为序列二、序列三、序列四、序列五、序列六和序列七
2) 荧光染料SYBR Green T染色后观察判定
在LAMP扩增产物中加入O. 5pL的10XSYBR Green I荧光染料浓縮液，通过肉眼观察。
阳性样本显绿色，阴性样本显橙黄色。见附图3。 附图3 :养殖海水样本1的L細P1扩增产物SYBR Green I染色结果。 图中1、 2、 3、 4、 5为养殖海水样本1检测结果；6、 7为阴性对照检测结果。 实施例2:养殖海水样本2
1病毒颗粒收集和模板DNA制备
(1) 取10L养殖海水(牙鲆)先用0.45nm孔径滤膜过滤，去除细菌细胞。
(2) 由100kDa过滤膜超滤浓缩到200mL。
(3) 通过Centricon plus-70级离心管重复离心(5000r/min， 5min)，将这200mL水 (含有LCDV病毒颗粒)进一步浓縮成0. 5mL。
(4) 0.5mL液体在沸水中煮5min，然后冰浴2min。置-2(TC保存备用。
2.环介导等温扩增(LAMP) (1) LAMP反应体系 在PCR试剂管内加入下列试剂，使总体积为25pL:
成分 IOX反应缓冲液
体系中各组分终浓度和体积 (2. 5pL)BstDNA聚合酶 8U (lpL)
lvFIP 1 (LAMP 1) / lvFIP2 (LAMP2) 40 pmol (化L)
固P 40 pmol (4nL)
lvF3 5 pmol (0单)
lvB3 5 pmol (0单)
lvIF 5 pmol (0单)
lvIB 5 pmol (0.5pL)
dNTPs 10mmol/L(0.5|aL)
DNA样品 50ng
双蒸水 10pL
10X反应缓冲液200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8), 100mmoI/L KC1, 100 mmol/L (NH4)2S04, 20mmol/L MgS04, 1% Triton X-100
(2) LAMP扩增程序
① 将模板DNA 95。C变性5分钟，立即插到冰上；
② 62'C保持60分钟；
③ 8(TC保持2分钟。
3 LAMP扩增产物检测
1) 电泳检查
LAMP产物用2.0W琼脂糖凝胶进行电泳，用溴化乙啶染色，在紫外分析仪下观察，阳性结 果条带呈梯状分布，间距50bp左右。见附图2。 附图2:养殖海水样本2用LAMP反应检测结果 附图中泳道l:阴性对照LAMP1扩增结果
泳道2:阴性对照LAMP2扩增结果
泳道3、 4、 5:养殖海水样本2LAMP1扩增结果
泳道6、 7、 8:养殖海水样本2LAMP2扩增结果
1、 3、 4、 5泳道所用引物为序列一、序列三、序列四、序列五、序列六和序列七
2、 6、 7、 8泳道所用引物为序列二、序列三、序列四、序列五、序列六和序列七
2) 荧光染料SYBR Green I染色后观察判定
在LAMP扩增产物中加入O. 5pL的10XSYBR Green I荧光染料浓縮液，通过肉眼观察。阳性 样本显绿色，阴性样本显橙黄色。见附图4。
附图4 :养殖海水样本2的LAMP1扩增产物SYBR Green I染色结果。 图中l、 2、 3、 4、 5为养殖海水样本2检测结果；6、 7为阴性对照检测结果。序列列表
SEQUENCE LISTING
<110>南开大学
<120> —种用环介导等温扩增技术检测海水淋巴囊肿病毒的方法
<130> 20090606
<160> 7
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<2II> 45
<212> DNA <213>人工合成 <220>
<221 > primer_bind
<222> (1)..(45)
<400> 1
gtatccgcaccatatagatgtttttagcgctattatacatatacc
<210> 2
<211> 46
<212> DNA <213>人工合成 <220>
<221〉 primer—bind
<222> (1)..(44)
<400> 2
gattccgcaccatatagatgttttatcacttgtgtagccggttc
<210> 3
<211> 21
<212> DNA <213>人工合成 <220>
<221 〉 primer—bind
<222> (1)..(48)
<400> 3
totaegtgcttcagtatattaecttttattcttgttcataattaggtg
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
9
45
44<213〉 人工合成 <220>
<221 > primer—bind
<222> (1)..(21)
<400> 4
tatcacttgtgaagcgcgttc
<210> 5
<211> 20
<212> DNA <213>人工合成 <220>
<221 > primer—bind
<222> (1)..(20)
<400〉 5
attcgctccgtcaacgaagc
<210> 6
<211> 19
<212〉 DNA
<213> 人工合成 <220>
<221> primer—bind
<222> (1)"(19)
<400> 6 gccctattatacatttagg
<210> 7
<211〉 20
<212> DNA
<213> 人工合成 <220>
<221> primer一bind
<222> (1),.(20)
<400> 7
cg犯c3taatoaggtecacc
权利要求
1.一种用环介导等温扩增技术检测海水中淋巴囊肿病毒的方法，其特征在于，该方法的检测步骤如下(1)设计用于LAMP扩增的特异性寡核苷酸引物lvFIP15’GTATCCGCACCATATAGATGTTTTTAGCGCTATTATACATATACC 3’lvFIP25’GATTCCGCACCATATAGATGTTTTATCACTTGTGTAGCCGGTTC 3’lvBIP5’TCTACGTGCTTCAGTATATTACCTTTTATTCTTGTTCATAATTAGGTG 3’lvF35’TATCACTTGTGAAGCGCGTTC 3’lvB35’ATTCGCTCCGTCAACGAAGC 3’lvIF5’GCCCTATTATACATTTAGG 3’lvIB5’CGAACATAATAAGGTACACC 3’(2)DNA抽提1)取10L养殖海水，用0.45μm孔径滤膜过滤，去除细菌细胞。2)用截留分子量为100kD的小型超滤装置，将10L除菌海水浓缩到200mL。3)用Centricon plus-70超滤离心管离心(5000r/min，5min)处理，将上述200mL含有病毒的水进一步浓缩到0.5mL。4)将上述0.5mL浓缩海水在沸水中煮5min，然后冰浴2min，置-20℃保存备用。(3)环介导等温扩增(LAMP)1)LAMP反应体系在PCR试剂管内加入下列试剂，使总体积为25μL成分体系中各组分终浓度和体积10×反应缓冲液 2.5μLBst DNA聚合酶 8U(1μL)lvFIP1(LAMP1)/lvFIP2(LAMP2) 40pmol(4μL)lvBIP 40pmol(4μL)lvF35pmol(0.5μL)lvB35pmol(0.5μL)lvIF5pmol(0.5μL)lvIB5pmol(0.5μL)dNTPs 10mmol/L(0.5μL)DNA样品 50ng双蒸水 10μL10×反应缓冲液200mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/L MgSO4，1％Triton X-100)2)LAMP扩增程序①将模板DNA 95℃变性5分钟，立即插到冰上；②62℃保持60分钟；③80℃保持2分钟。(4)LAMP扩增产物检测1)电泳检查LAMP产物用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳，用溴化乙啶染色，在紫外分析仪下观察，阳性结果条带呈梯状分布，间距50bp左右。2)荧光染料SYBR Green I染色后观察判定在LAMP扩增产物中加入0.5μL的10×SYBR Green I荧光染料浓缩液，通过肉眼观察。阳性样本显绿色，阴性样本显橙黄色。
2.权利要求1所述的一种用环介导等温扩增技术检测海水中淋巴囊肿病毒的方法在检 测其它水体中淋巴囊肿病毒方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用环介导等温扩增技术检测海水淋巴囊肿病毒的方法，属于水体病原体污染检测领域。主要技术方案是利用LAMP技术，针对淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白基因，设计七条高特异性引物，并通过过滤浓缩水样富集病毒，达到高效特异性检测水样中淋巴囊肿病毒的目的。与传统方法相比，该方法所需设备和操作步骤简单，特异性强，操作方便，设备简单，可以快速、准确地鉴定特异的目标病原体。它用环介导等温扩增方法扩增病毒特异性靶基因，避免了冗长的一系列生化反应，节约时间、劳动力和成本。LAMP鉴定方法不受病毒生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。
文档编号C12Q1/68GK101608243SQ20091006925
公开日2009年12月23日 申请日期2009年6月15日 优先权日2009年6月15日
发明者李永君, 许晶晶, 郑泽军, 黄熙泰 申请人:南开大学