专利名称：苯乙烯降解菌mj001及其分离方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其一种苯乙烯降解菌MJ001及其分离方法。
背景技术：
苯乙烯是用来制造塑料、树脂、橡胶等由单分子体构成的大分子物质的原料，同时 也可用于制造聚脂和乳胶漆，具有易燃性、刺激性以及可疑致癌物。在苯乙烯的生产、使 用、运输以及贮藏过程中会发生较大量苯乙烯进入大气及水体的问题，且苯乙烯自身具有 较强挥发性，在大气中很容易被光解，能被空气中的氧所氧化成苯甲醚、苯乙醛及少量苯 乙醇。因此，苯乙烯可污染地表水、土壤、大气和饮用水，对环境乃至人体健康危害严重。 土壤中的苯乙烯可以被微生物尤其是特异菌丛降解破坏，也可被其他化学试剂降解，而采 用微生物降解苯乙烯是最为环保、安全的一种方式。
通过专利检索，尚未发现对苯乙烯有很强的降解能力的菌株
发明内容
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本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以苯乙烯作为唯一碳源生长，对 苯乙烯有很强地降解能力的苯乙烯降解菌MJ001及其分离方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的
一种苯乙烯降解菌MJ001，其特征在于革兰氏染色阴性、兼性需氧、最适生长温度 37°C、最适pH6.4-7.4、三糖铁实验阴性、氧化酶反应阳性，16S rDNA序列与绿脓杆菌 P. aeruginosa有100%同源性，该菌种保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏编号为3042，保藏日期为2009年4月28日。
一种苯乙烯降解菌MJ001的分离方法，分离的步骤是-
① 将活性污泥放入无菌水中，振荡，然后放于25-35'C培养箱中活化25-35min;
② 将从污泥上洗脱下来的菌液接种到苯乙烯唯一碳源液体培养基中，25-35。C振荡培 养1.5-2.5d，得到液体培养液；
③ 将液体培养液在苯乙烯唯一碳源固体培养基上涂布，25-35。C培养1.5-2.5d，挑 取较大的单菌落进行镜检；
④ 将上步骤挑取的单菌落重复2-4轮步骤②、③的培养过程，最后分离得到以苯乙 烯为唯一碳源生长的菌株，命名为MJ001。
而且，所述活性污泥来自天津塘沽聚苯乙烯生产厂家处理污水的活性污泥，由塘沽 区环境保护监测站采样。
而且，所述苯乙烯唯一碳源液体培养基的组成及制备方法是
硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钠1. 3g/L、硫酸镁0. 2g/L、 PH7. 0、 121°C灭菌20min,接种前加入配制好的苯乙烯琼脂小块。 而且，所述苯乙烯琼脂块的制备方法是
琼脂20 g/L、 pH自然、12rC灭菌20min，待冷却到50-6(TC时加入1%体积的苯乙 烯，混匀后倒平皿，用刀切成苯乙烯琼脂小块备用，放置时间少于l小时。
而且，所述苯乙烯唯一碳源固体培养基的组成及制备方法是
硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钠1. 3g/L、硫酸镁0. 2g/L、琼脂粉20g/L、 PH7.0、 121。C灭菌20min，倒平皿前加入1%体积的苯乙烯。
本发明的优点和积极效果是
1、 本发明的苯乙烯降解菌MJ001以苯乙烯作为唯一碳源生长，在苯乙烯浓度较低时， 随着苯乙烯浓度的增加，菌的生物量也在增加，菌株生长加快；当苯乙烯浓度达到40mg/mL 时生长最快，当苯乙烯浓度超过40mg/mL时生长变缓，直到苯乙烯浓度达到55mg/mL以后 菌株几乎不生长，由此可表明该菌株对苯乙烯有很强的降解能力。
2、 本发明通过研究分离得到的一株苯乙烯降解菌MJOOl的特性，认知该菌的降解机 理，有利于改进微生物的净化能力，有效解决苯乙烯的环境污染问题，对净化含苯乙烯的 工业废水有重要意义。
图1为本发明中苯乙烯降解菌MJOOl菌落形态；
图2为本发明中苯乙烯降解菌MJ001个体形态；
图3为本发明中苯乙烯浓度对苯乙烯降解菌MJOOl生长的影响；
图4为本发明中苯乙烯降解菌MJ001代谢曲线。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
一种苯乙烯降解菌MJOOl，革兰氏染色阴性，兼性需氧，最适生长温度37'C，最适 pH6.4-7.4，三糖铁实验阴性，氧化酶反应阳性，16S rDNA序列与绿脓杆菌P. aeruginosa 有100%同源性，该菌种保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏 编号为3042，保藏日期为2009年4月28日。该菌种的生物学分类命名为 /^ei/ab历o"as朋r柳'"osa/^绿假单胞菌。
一种苯乙烯降解菌MJ001的分离方法，步骤是
(l)苯乙烯降解菌MJOOl的分离
① 将一定量的活性污泥放入100mL无菌水中，轻微振荡，然后放于3(TC培养箱中活 化30min，使菌体尽可能多的从污泥上洗脱下来；
本步骤中活性污泥来自天津塘沽聚苯乙烯生产厂家处理污水的活性污泥，由塘沽区 环境保护监测站采样。
② 将一定量的从污泥上洗脱下来的菌液接种到苯乙唯一碳源烯液体培养基中，30'C 振荡培养2d，得到液体培养液；苯乙烯液体培养基硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钠1.3g/L、硫酸镁 0.2g/L、 PH7.0、 12rC灭菌20min。接种前加入配制好的一定量的苯乙烯琼脂块。
苯乙烯琼脂块琼脂20g/L、 pH自然、12rC灭菌20min，待冷却到50-6(TC时加入 1%体积的苯乙烯，混匀后倒平皿(稍厚)，用刀切成小块备用，放置时间不要超过一小时。
③ 将液体培养液在苯乙烯唯一碳源固体培养基上涂布，3CTC培养2d，挑取较大的单 菌落进行镜检；
苯乙烯固体培养基硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钠1.3g/L、硫酸镁 0.2g/L、琼脂粉20g/L、 PH7.0、 121。C灭菌20min，倒平皿前加入1%体积的苯乙烯。
④ 将上步骤挑取的单菌落重复步骤②、③的培养过程，经2-4轮筛选，最后分离出 一株以苯乙烯为唯一碳源生长且具有高效降解能力的菌株，命名为MJOOl，保存在唯一碳 源固体培养基中。
(2)菌株MJ001的鉴定
① Biolog自动微生物鉴定系统的快速鉴定
对菌株MJOOl进行革兰氏阴阳性鉴别、氧化酶实验和三糖铁高层琼脂斜面培养实验 初步确定菌株的微生物类型，然后在BUG+B培养基上进行扩大培养，接着接种到Biolog 专用接种液中制备成均一的菌悬液，转接到微孔板上进行培养，把培养结果与Biolog系 统的数据库进行比较，找到最接近的结果。
其结果为苯乙烯降解菌MJ001在固体培养基上，菌落形态及个体形态分别见图1、 图2，其生理特性为革兰氏染色阴性、兼性需氧、最适生长温度37。C、最适pH6.4-7.4、 三糖铁实验阴性、氧化酶反应阳性。Biolog鉴定结果与绿脓杆菌P. aeruginosa最接近， 有99%的相似性。
② 菌株MJ001的16S rDNA序列分析
菌株的DNA提取把分离得到的菌株接种到灭菌的2mLLB液体培养基中，培养16小 时，10000转离心10min弃上清，无菌水洗三遍，沸水浴中煮沸裂解7min，冰浴冷却，12000 转离心5min取上清作为PCR模板备用。
16S rDNA序列扩增16S rDNA序列扩增用的是一对引物如下
正向引物Fl: 5' —AGAGTTTGATCC TGGCTCAG—3 ，
反向引物Rl: 5 ， —AAGGAGGTGATC CAGCCGCA—3 ，
PCR反应体系:模板lixL，正向引物(25pmol/L)luL，反向引物(25pmol/L) 1 y L， 2 XPCRmix25nL ，用水补足到50nL。 PCR扩增条件95。C5min， 94。C3min， 55。C30s， 72。C90s， 30cycles， 72。C5min， 4。C保存。
PCR产物切胶后用回收试剂盒回收，连接到pUCT载体，转化到大肠杆菌感受态细胞 中。测序工作由北京华大基因完成。测序结果在NCBI的Blast上进行序列相似性比对。
序列测定及同源性比较以菌株的总DNA为模板，利用细菌16SrDNA通用引物进行 扩增，得到长度约1. 5kb的DNA，测定其基因序列，将测序结果输入GenBank，用Blast软件与已知的16S rDNA序列进行比对，结果发现，该序列与绿脓杆菌(P. aeruginosa)有100%同源性。
(3)菌株MJ001的性能研究
① 菌株MJ001的耐受性研究
把菌株MJ001接种在含有不同浓度苯乙烯的唯一碳源培养基中，培养24小时后取样，用0D600检测菌悬液的吸光度值，比较不同苯乙烯浓度对菌株生长的影响。
从图3可以看出菌株MJ001在苯乙烯浓度较低时，随着苯乙烯浓度的增加生物量增加，证明菌株生长加快，当苯乙烯浓度达到40mg/raL时生长最快，而苯乙烯浓度超过40mg/mL时生长变缓，直到苯乙烯浓度达到55mg/mL以后菌株几乎不生长。
② 菌株MJ001的代谢性能研究
把菌株MJ001接种到苯乙烯浓度40mg/mL的唯一碳源培养基中进行发酵培养，考察菌株对苯乙烯的代谢情况。
由图4可以看出菌株MJ001在培养时间10h内代谢较缓慢，处于延滞期，苯乙烯消耗速率缓慢，这是由于菌株需要一段时间来适应新环境。而在10-20h之间菌体快速生长，以最大的速率来降解苯乙烯，代谢旺盛。20h以后代谢变缓，苯乙烯浓度很低不足以维持菌体的正常代谢活动，菌体逐步由稳定生长走向衰亡。<110〉天津市天人合环保技术研发中心〈120〉苯乙烯降解菌MJ001及其分离方法
〈130〉 20090618
〈160> 3
〈170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 20
〈212> DNA
〈213〉 正向引物F1
<400〉 1
agagtttgat cctggctcag 20
〈210〉 2
〈211〉 20
〈212〉 腿
〈213〉反向引物R1
〈400〉 2
aaggaggtga tccagccgca 20
<210〉 3
〈211〉 1475
<212〉 ■
〈213> 菌株MJ001的16S rDNA序列
<400> 3
tggtctcgttgttacgacttcaccccagtc atgaatcaca ccgtggtaac cgtcctcccg60
aaggttagactagctacttctggtgcaacc cactcccatg gtgtgacggg cggtgtgtac120
aaggcccggg^Cgt3ttC8ccgcgacatt ctgattcgcg attactagcg attccgactt180
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gtcggt雄gtca犯3C3gcaaggtattaacttactgcccttcctcccaa cttaaagtgc1080
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gtcc犯tattccccactgctgcctcccgtaggagtctgga ccgtgtctca gttccagtgt1200
gactgatcatcctctcagaccagttacggatcgtcgccttggtgagccattaccccacca1260
actagctaatccgeiccteLggctcatctgatagcgcaaggcccgaaggtcccctgctttct1320
cccgtaggscgtatgcggtattagcgttcctttcg犯acgttgtccccca ctaccaggca1380
gattcctaggcattactcacccgtccgccgctgaMcaag gagc犯gctcccgtcatccg1440
ctcgacttgcatgtgttaggccttccgcattggct147权利要求
1、一种苯乙烯降解菌MJ001，其特征在于革兰氏染色阴性、兼性需氧、最适生长温度37℃、最适pH6.4-7.4、三糖铁实验阴性、氧化酶反应阳性，16S rDNA序列与绿脓杆菌P.aeruginosa有100％同源性，该菌种保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为3042，保藏日期为2009年4月28日。
2、 一种如权利要求l所述苯乙烯降解菌MJOOl的分离方法，其特征在于分离的步骤是① 将活性污泥放入无菌水中，振荡，然后放于25-35'C培养箱中活化25-35min;② 将从污泥上洗脱下来的菌液接种到苯乙烯唯一碳源液体培养基中，25-35'C振荡培 养1.5-2.5d，得到液体培养液；③ 将液体培养液在苯乙烯唯一碳源固体培养基上涂布，25-35'C培养1.5-2.5d，挑 取较大的单菌落进行镜检；④ 将上步骤挑取的单菌落重复2-4轮步骤②、③的培养过程，最后分离得到以苯乙 烯为唯一碳源生长的菌株，命名为MJOOl。
3、 根据权利要求2所述的苯乙烯降解菌MJ001的分离方法，其特征在于所述活性 污泥来自天津塘沽聚苯乙烯生产厂家处理污水的活性污泥，由塘沽区环保局环境保护监测 站采样。
4、 根据权利要求2所述的苯乙烯降解菌MJ001的分离方法，其特征在于所述苯乙 烯唯一碳源液体培养基的组成及制备方法是硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钠1. 3g/L、硫酸镁0. 2g/L、 PH7. 0、 121°C 灭菌20min，接种前加入配制好的苯乙烯琼脂小块。
5、 根据权利要求4所述的苯乙烯降解菌MJ001的分离方法，其特征在于所述苯乙 烯琼脂块的制备方法是琼脂20 g/L、 pH自然、12rC灭菌20min，待冷却到50-6(TC时加入1%体积的苯乙 烯，混匀后倒平皿，用刀切成苯乙烯琼脂小块备用，放置时间少于l小时。
6、 根据权利要求2所述的苯乙烯降解菌MJ001的分离方法，其特征在于所述苯乙 烯唯一碳源固体培养基的组成及制备方法是硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钠1. 3g/L、硫酸镁0. 2g/L、琼脂粉20g/L、 PH7.0、 12rC灭菌20min，倒平皿前加入1%体积的苯乙烯。
全文摘要
本发明涉及一种苯乙烯降解菌MJ001及其分离方法，苯乙烯降解菌MJ001特征为革兰氏染色阴性、兼性需氧、最适生长温度37℃、最适pH6.4-7.4、三糖铁实验阴性、氧化酶反应阳性，16S rDNA序列与绿脓杆菌(P.aeruginosa)有100％同源性，其分离的方法是①活化活性污泥；②菌液接种到苯乙烯唯一碳源液体培养基中；③培养液在苯乙烯唯一碳源固体培养基上涂布，挑取较大的单菌落进行镜检，并保存；④重复2-4轮步骤②、③的培养过程，最后分离得到以苯乙烯为唯一碳源生长的菌株。本发明通过研究得到苯乙烯降解菌MJ001的特性，认知该菌的降解机理，有利于改进微生物的净化能力，有效解决苯乙烯的环境污染问题，对净化含苯乙烯的工业废水有重要意义。
文档编号C12N1/20GK101638630SQ20091006929
公开日2010年2月3日 申请日期2009年6月17日 优先权日2009年6月17日
发明者孔大为, 舫 李, 娟 门 申请人:天津市天人合环保技术研发中心