孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞及用于有效且划算灭活和使用它们的方法
【专利说明】孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞及用于有效且划 算灭活和使用它们的方法
[00011 本申请是基于申请日为2012年2月28日，优先权日为2011年3月1日（US61/447， 703)和2012年2月27日（US 13/406，202)，申请号为201280020898.8，发明名称为："孢子化 缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞及用于有效且划算灭活和使用它们的方法"的专利申 请的分案申请。
[0002] 对相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求2011年3月1日提交的美国临时申请No. 61 /447，703的权益，其完整内 容通过提述并入。 发明领域
[0004] 本发明总体上涉及生物技术领域，更具体地，涉及德克萨斯侧孢短芽孢杆菌 (Brevibacillus texasporus)的胁迫敏感性或孢子化缺陷型菌株、用于德克萨斯侧孢短芽 孢杆菌生物体的有效且划算的细胞灭活的方法、及自这类菌株衍生的饲料或水添加剂。
[0005] 发明背景
[0006] 本文中引用的任何文件并非承认该文件是现有技术或本文中任何权利要求的可 专利性的考虑材料，并且关于任何文件的内容或日期的任何陈述均基于提交时该申请可用 的信息，而不构成证实或承认该陈述是正确的。
[0007] 健康动物或未被病原性生物体(如病原性细菌)感染的动物较快生长并且从每千 克饲料取得更多的体重增加。因此，自20世纪40年代以来，抗微生物化合物已被用作家畜中 的生长促进剂。通常，抗微生物化合物被以亚治疗剂量或低剂量在饲料中施用。
[0008] 尽管已长期使用亚治疗剂量的抗微生物化合物来帮助家畜保持健康并更快生长， 但最近的报告显示了抗生素的使用与从这些动物生产的肉类上药物抗性细菌的存在之间 的联系。因此，欧洲委员会、美国农业部(USDA)以及美国食品和药品管理局(FDA)均已制定 了关于将某些抗生素用作生长促进剂的禁令和指南。目前，规则通常聚焦于与用于治疗人 类的抗生素相同或类似的抗生素的使用。然而，对使用所有抗生素药物来增强家畜生长的 总体性抵制日益增长。此外，有机生成肉类的市场正在扩大，并且要得到有机认证，美国肉 类必须来自未经抗生素喂养的动物。因此，目前存在对用于家畜饲料的新型生长增强剂需 求。
[0009] 另外，伴侣动物健康是一个快速增长的市场。经由刺激先天性免疫来保持伴侣动 物(例如老龄伴侣动物)的健康对于伴侣动物的保健是一种有吸引力的办法，并且口服投递 的免疫刺激剂会是高度有价值的。
[0010] 德克萨斯侧孢短芽孢杆菌(BT)(例如ATCC PTA-5854)是一种最近鉴定的土壤细 菌，其生成一组阳离子非核糖体肽(NRPS peptides)(参见W02005/074626和WU等2005)。这 些来自BT的阳离子肽在体外展现出广谱抗细菌活性，其杀死革兰氏阳性和阴性细菌、真菌 和原生动物(W0 2005/074626)。
[0011] 尽管具有体外抗细菌活性，但BT肽似乎缺乏体内抗细菌活性。万古霉素抗性肠球 菌在体外对BT肽是高度敏感的。然而，BT肽在明显超出最小抑制浓度的浓度不能使共生的 VRE自小鼠肠道去定殖化(decolonize)。
[0012] 然而，分离的肽被显示了在被用作饲料添加剂时有效预防鸡的大肠杆菌病和沙门 氏菌病。另外，还显示了此分离后的肽在鸡中有效促进生长并提高饲料转化。
[0013] 可能更重要地，BT肽的体内作用似乎不依赖于其体外抗生素活性，因为它在低于 其体外最小抑制浓度的浓度时有效预防大肠杆菌和沙门氏菌对鸡的感染(JIANG等2005; K0GUT等2007;K0GUT等2010)。还被注意到的是，在饲喂BT肽的鸡中，血液异嗜白细胞 (heterophil)和单核细胞被预备活化(primed for activation)，这指向先天性免疫刺激 为可能的作用机理。这些特征使得BT肽成为家畜生产中理想的饲料添加剂和抗生素化合物 的替代品。
[0014] 另外，由于现在还已知先天性免疫在控制病毒性和真菌性感染以及预防非传染病 (如肥胖/代谢综合征和2型糖尿病）中起着关键作用(VIJAY-KUMAR等2010)，因此BT先天性 免疫调节剂也应在这些治疗领域中具有重要的应用。
[0015] 然而，BT肽作为饲料添加剂的经济价值严重受限于肽分离的需要，其使生产成本 增加至其在经济上不再可行的程度。作为纯化该肽的替代方案，有可能可以将整个生物体 (PTA-5854)(如在国际专利公开文本W0 2005/074626中讨论的)直接用来生产饲料添加剂。
[0016] 通常，直接饲喂微生物(DFM)或益生菌(probiotic)菌株需要以活体形式和充足数 目到达肠道，这需要菌株在饲料加工和消化期间存活(参见美国专利5,480,641和美国专利 公开文本20040247568)。由于饲料颗粒生成通常牵涉足以显著降低存活力的加热，大多数 益生菌菌株都经过目标为其对加热和胃中测出的pH条件的抗性的筛选。目前，最稳定的益 生菌菌株是芽胞杆菌孢子，因为细菌孢子是热抗性的，并且在长期贮存期间保持存活。
[0017] 然而，由于BT生物体不被认为是通常在家畜肠道中找到的共生细菌，期望和/或有 必要的是在使用之前灭活其生物体。然而，在能生成孢子的菌株中，这是有问题的。另外，至 少一个政府管理机构在评估涉及微生物来源的新饲料时考虑以下标准:微生物生产的安全 性;微生物产品对人、动物和环境的安全性;横向基因转移的潜在影响；与胃肠微生物区系 的相互作用;在肠中的持久性；由于活体微生物洒落而对人和环境的潜在影响，尤其是在肉 类污染会被认为有健康影响时（Directive on Guidelines for the Assessment of Novel Feeds:Microbial Sources,Draft-June 2007,The Canadian Food Inspection Agency)。因此，在使用微生物作为食品添加剂时，有两种相互冲突的期望结果。第一种是在 整个加工和消化期间将微生物保持为活体状态，而第二种完全相反的期望是完全或近乎完 全地将微生物灭活而不使活性肽失活。灭活的额外益处是其消除或降低德克萨斯侧孢短芽 孢杆菌与肠中及环境中的微生物之间横向基因转移的机会;消除或限制与胃肠(GI)微生物 区系的潜在相互作用；消除或降低经由活细胞洒落对人和环境的潜在风险;和/或消除或降 低对源自消耗该饲料的动物的肉类的污染。因此，PTA-5854的连续孢子化严重限制将该菌 株用作DFM的能力，因为孢子对用于灭活营养细胞的大多数方法是极具抗性，要求用严苛且 昂贵的方法予以去除。
[0018] 因此，本领域中需要可作为灭活的DFM有效使用的德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株。 [0019] 发明概述
[0020]在一个实施方案中，本发明是饲料或水添加剂，其包含孢子化缺陷型德克萨斯侧 孢短芽孢杆菌细菌菌株的灭活的细胞或灭活的培养物。本发明还涉及可以添加到一种或多 种动物用的饲料或饮用水的本发明的灭活的经干燥的细胞或培养物(例如冻干或喷雾干燥 的细胞或培养物）的用途，所述动物包括但不限于家禽、牲畜、牛、猪、鸡、马、火鸡、绵羊、山 羊、鸭、鹤鹤、康沃尔游戏母鸡(Cornish game hen)、鹤、农场饲养的鱼、蟹、奸、淡水龟、犬和 猫。例如，可以经由巴氏消毒法、饥饿、温度(热、冷或冷冻）、脱水(例如加热干燥、冷冻干燥、 喷雾干燥、晒干、风干或真空干燥）、酸化、碱化、醇、去污剂、溶菌酶、机械力、季铵阳离子、氧 化剂(例如氯氧化物、过氧化氢、次氯酸盐或臭氧)和/或辐射(例如UV、X射线或γ射线)来灭 活孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株培养物的细胞，然后可以将灭活的细胞或培 养物纳入到饮用水或动物饲料中，如基于谷类的饲料，例如含有至少一种选自下组的谷类 的饲料:大麦、大豆、小麦、小黑麦（triticale)、黑麦(rye)、玉米及其组合。实际上，可以将 本发明添加到极其多种饲料中。可以将本发明的灭活的细胞或分离肽与选自下组的家畜用 饮用水或饲料混合：代乳品（milk replacer)、生长饲料（grower feed)、肥育饲料 (finisher feed)、育维前饲料(pre-starter feed)、育维饲料(starter feed)、水及其组 合。
[0021] 本发明还包括用于促进家畜和伴侣动物中的体重增加和饲料转化的方法，其通过 将孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞或细胞培养物灭活(例如热处理或脱水），并 以足以促进生长的量向动物提供灭活的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞或培 养基加细胞进行。另可选择的是，可以将有效量的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌 细胞或含有该细胞的培养基干燥(脱水)和/或通过造粒(一种热处理方式)纳入动物饲料中 或添加到饮用水中。
[0022] 饲料成分的例子还包括谷类、大豆粉、分离的大豆蛋白、分离的大豆油、分离的大 豆脂肪、脱脂乳、鱼粉、肉粉、骨粉、血粉、血浆蛋白质、乳清、稻糠、麦麸，并且还可以包含甜 味剂、矿物、维生素、盐和草。
[0023] 在一个例示性的实施方案中，在含有饲料成分(如玉米粉和大豆粉)悬浮液的培养 基中培养孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞。然后，可以对培养物进行细胞灭活 和/或干燥/脱水以制备饲料添加剂(其中培养物中的微粒发挥BT肽的载体的功能）或增强 型饲料。
[0024] 本发明还包括用于预防和/或治疗动物中微生物感染的方法，其通过以足以治疗 和/或预防动物中微生物感染的有效量提供灭活的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌 细胞或培养物进行。
[0025] 本发明还包括用于促进正在生长的动物中重量增加和饲料转化的方法，其通过以 足以治疗和/或预防动物中微生物感染的有效量提供灭活的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短 芽孢杆菌细胞或培养物进行。
[0026] 本发明还包括孢子化缺陷型细胞作为人食物或水添加剂的用途。
[0027] 在一个例示性实施方案中，本发明提供了德克萨斯侧孢短芽孢杆菌的孢子化缺陷 型菌株，其具有小于约3.5x 1CT3、小于约lx 1CT4、小于约lx 1CT5、小于约lx 1CT6、小于约lx 10-7、小于约lx 10-8或小于约lx 10-9的存活率，存活率可以通过使培养物处于约50°C的温 度约5分钟并测定存活率或菌落形成能力来测量。
[0028] 在一个例示性实施方案中，当对培养物进行灭活处理时，孢子化缺陷型德克萨斯 侧孢短芽孢杆菌菌株还展现出降低的存活，如小于约lx 10-9的存活率，所述灭活处理如饥 饿、冷冻（在缺乏有效量的冷冻保护剂的情况下）、脱水（于23°C用迅速真空（speed vaccum))、pH极端(例如pH 1 · 0或pH 13 · 0)、饱和丁醇、添加去污剂(例如1 % SDS)或裂解剂 (例如溶菌酶）、超声处理、机械力（例如动物饲料造粒机的弗氏压碎(French press))或过 氧化氢(例如大于或等于i%h2〇2)。
[0029] 本发明还涉及增加德克萨斯侧孢短芽孢杆菌制剂中的BT肽产量的方法，其通过使 用自孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株衍生的细胞进行。本发明还涉及增加德克 萨斯侧孢短芽孢杆菌制剂中BT肽的稳定性和经济效用的方法，其通过在不纯化或分离BT肽 的情况下使用自孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株衍生的细胞进行。
[0030] 本发明还涉及德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞的粉末状形式，其中粉末基本上无孢 子。在一个例示性实施方案中，在液体培养基中将孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌 的培养物培养至足够的细胞密度，并将培养物脱水或干燥以生成基本无孢子的粉末。然后， 可以将该粉末与水或饲料成分混合以生成不含显著量的来自德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细 菌的活孢子的增强型动物饮料或食物。
[0031] 本发明还涉及将德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞从用于德克萨斯侧孢短芽孢杆菌 生产的装置和/或设施中除去或去污的方法，其如下进行，处理该装置和/或设施以灭活或 杀死孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株，然后可以简单地将细胞冲洗掉。例如，可 以使用蒸汽或高温水来清洁装置和/或设施，其中水既会除去细胞又会杀死它们（由于温度 所致），由此有效从装置和/或设施除去德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞。