既不 实际也不划算。高压灭菌是另一种有效消除孢子的方法，但该过程损害ΒΤ肽，如此使此方法 变得不令人期望。
[0105] 在工业环境中细胞灭活的最实际和划算的方法是BT肽能承受的短暂的中等加热 处理(如巴氏消毒法，例如70°C持续30分钟）和/或脱水。由于德克萨斯侧孢短芽孢杆菌孢子 对热处理相当有抗性（孢子能承受显著的胁迫水平，如于l〇〇°C煮沸60分钟（表1)，和脱水 (表2))，因此德克萨斯侧孢短芽孢杆菌的实际和/或划算的使用(如用于DFM)需要对中等温 度和/或脱水敏感的孢子化缺陷型菌株。本发明提供了可以使用对BT肽安全的技术(如巴氏 消毒法、造粒、冻干和/或干燥)来灭活的孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株，其中 灭活条件能够灭活营养细胞，而一般不灭活非野生型孢子。
[0106] 可用于灭活营养细胞的技术的例子包括但不限于饥饿、温度休克（加热如巴氏消 毒法或低温如冷冻）、脱水/冻干/干燥（例如热干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、晒干、风干和/或 真空干燥）、pH变化(例如酸化或碱化）、醇处理、用去污剂处理、过滤、用金属如银和锌处理、 压力处理(如高压加工）、酶促破坏(例如用溶菌酶处理）、机械力(例如超声处理）、用季铵阳 离子处理、氧化剂(例如氯氧化物、过氧化氢、次氯酸盐和/或臭氧）、盐化、使用射频(RF)能 量的(脉冲）电场处理、微波处理、电子束处理、辐射(例如UV、X射线或γ射线)和/或其组合。 在一个例示性实施方案中，可以使用这些技术中的一种或多种来灭活本发明的孢子化缺陷 型细胞。
[0107] 据发明人所知，没有出版物记载满足被认为是灭活DFM政府管理标准的、胁迫存活 率〈1(^6、〈1〇1、〈1(^ 8或〈1(^9的孢子化缺陷。例如，在学术出版物中，1(^2的芽孢杆菌胁迫存 活率称作孢子化缺陷型（LEE等2001);而已公告的美国专利4，302，544、4，450，235，4，450， 236、4,465,773、6,284,490和7,655,452中的方法仅可以生成具有10- 7级的胁迫存活率的孢 子化缺陷型（"不生孢子的(asporugenous)"或"不产生芽胞的(asporugenic)"）芽孢杆菌菌 株。因此，似乎缺少生成胁迫存活率〈ΚΓ 9的具有孢子化缺陷的芽孢杆菌菌株的技术。考虑到 由于以下两个原因使最有力的基因删除方法不是合适的选项(并且唯一可用的诱变方法是 化学方法，其通常引起沉默或"泄漏"点突变)的事实，很需要创建这类技术。第一，德克萨斯 侧孢短芽孢杆菌是一种非遗传易处理的生物体，而且无法实施基因删除。第二，所得基因敲 除菌株会是经遗传修饰的生物体(GM0)，其在如欧盟等地区中在人用食品中是被禁止的。在 另一个例示性实施方案中，灭活方法足以将依照本发明的孢子化缺陷型菌株的存活率降低 至小于约lx 1CT4、小于约lx 1CT5、小于约lx 1CT6、小于约lx 1CT7、小于约lx 1CT8或小于约 1χ 10-9,但其中灭活方法不足以将有孢子化能力的PTA-5854的存活率降低至低于约3.3X ΠΓ 1或低于约4.3χ ΚΓ1。
[0108] 实施例1
[0109] 如下是进行分离ΡΤΑ-5854孢子化缺陷型突变体的尝试。用EMS诱变了 ΡΤΑ-5854细 胞，然后将其铺板到LB-琼脂上。对约50，000个菌落筛选了对于75°C处理1小时的敏感性，并 分离出42个温度敏感性候选菌株。将这些初始候选菌株进行了菌落纯化并再测试热敏感 性。在液体LB培养基中于37°C将ΡΤΑ-5854菌株和温度敏感性候选菌株培养了 3天。然后，将 细胞以1〇〇μ1等分试样分配到无菌微量离心管中，并于多个温度(75、70、65、60、55、50或37 °C)温育了不同长度的时间（5、15、30或60分钟）。将经处理的细胞铺板到LB-琼脂上，并于37 °C过夜温育以测定铺板效率。以热休克后的铺板效率除以无热休克于37°C的铺板效率计算 了热休克处理后的存活率。
[0110] 在初始的42个分离物中，确认了数个温度敏感性突变体。菌株B7显示最佳的温度 敏感性表型(表1)。于50°C短暂的5分钟处理产生了 8.1χ 10-7(约lxl(T6)的存活率，而更高 的温度和更长的温育并未显著降低存活率。就使用德克萨斯侧孢短芽孢杆菌作为DFM的目 的而言，此细胞灭活水平被认为不够充分。对ΡΤΑ-5854的重复诱变和突变体分离并未生成 具有比Β7更好的温度敏感性表型的菌株。据推断，超过一处突变可能对更坚实的温度敏感 性表型（从而允许更有效的细胞灭活)是必需的。然而，对Β7的诱变未产生具有改善了的温 度敏感性表型的突变体，这可能是由于Β7(相对于亲本ΡΤΑ-5854)的不佳健康状况所致。
[0111] 表1:德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞(作为2天龄LB培养物)的温度敏感性
[0112]
[0113] 从土壤样品分离到了一个新的细菌菌株(MYG11，登录号ΡΤΑ-12310)。对此菌株的 S16 rDNA测序显示，它与ΡΤΑ-5854是同一物种的，但就热处理而言拥有显著不同的表型。 MYG11于37°C在LB培养基中快速生长，并且它显示对高温的初级敏感性或孢子化缺陷。于50 °C处理5分钟产生了 3.5x 10_3的存活率(表1)。于是，对MYG11进行了诱变，并对约50,000个 菌落进行了目标为展现升高了的温度敏感性的突变体的筛选。通过此方法分离出至少3种 突变体 MYG107(登录号 PTA-12309)、MYG110(登录号PTA-12308)和MYG113(登录号PTA-12307)，并发现其显示严重的孢子化缺陷。与PTA-5854和B7形成鲜明对比，于50°C的温度处 理5分钟对于MYG107、MYG110和MYG113产生了低于10_ 9的存活率。如此，本发明提供了在暴露 于至少50°C的温度达至少5分钟时具有低于约10-8或约10- 9的存活率的德克萨斯侧孢短芽 孢杆菌菌株。
[0114] MYG107在对数期LB培养物中具有约45分钟的倍增时间，并对其进行了进一步的表 征。鉴于MYG107、MYG110和MYG113的存活率处于或低于在本实验中使用的培养物的检测限， 据信MYG107、MYG110和MYG113在孢子化中具有根本性缺陷，是高度孢子化缺陷型菌株，这得 到以下事实的进一步支持，即据信来自MYG107的BT产量与ΡΤΑ-5854相比超过3倍。
[0115] 此外，典型的侧生内生孢子在几乎所有阶段的ΡΤΑ-5854培养物中都可被检出。这 类侧生内生孢子没有在任何阶段的MYG107培养物中观察到，这支持MYG107在孢子形成中具 有根本性缺陷的观点。此外，MYG107展现出对其它灭活营养细胞而非孢子的胁迫类型的敏 感性(表2)。
[0116] 表2:德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞（以2天龄LB培养物)的胁迫敏感性
[0117]
[0118] 在冷冻敏感性测试中，在液体LB培养基中于37°C将野生型PTA-5854菌株和MYG107 培养了2天，然后将细胞以100μΙ等分试样分配到无菌微量离心管中，并于_20°C温育了60分 钟(或在形成冰后）。将经冷冻处理的和未处理的细胞铺板到LB-琼脂上，并于37°C温育过夜 以测定铺板效率。计算了冷冻的存活率(经处理的细胞的铺板效率/未处理的细胞的铺板效 率）。与PTA-5854约4.2χ ΠΓ1的存活率相比，冷冻对于MYG107产生了约小于ΚΓ9的存活率。
[0119] 在酸化敏感性测试中，在液体LB培养基中于37°C将野生型PTA-5854菌株和MYG107 培养了2天，然后将细胞以100μΙ等分试样分配到无菌微量离心管中。通过向每份等分试样 添加10μ1 1MHC1将pH调节至约1.0(于室温），然后立即通过添加 ?ομL lMNaOH来中和。将 经酸处理的和未处理的细胞铺板到LB-琼脂上，并于37°C温育过夜以测定铺板效率。与PTA- 5854约4.5χ ΠΓ1的存活率相比，酸化对于MYG107产生了约小于10_9的存活率。
[0120]以类似的方式实施了碱化敏感性测试，只是首先添加 NaOH以将pH调节至13.0,然 后添加 HC1进行中和。与PTA-5854约5.1χ ΠΓ1的存活率相比，碱化对于MYG107产生了约小于 ΠΓ9的存活率。
[0121] 以类似的方式实施了醇敏感性测试，只是添加丁醇至1%(v/v)。与PTA-5854约 5.6χ ΠΓ1的存活率相比，丁醇处理对于MYG107产生了约小于10_9的存活率。
[0122] 以类似的方式实施了去污剂敏感性测试，只是添加 SDS至1%(v/v)。与PTA-5854约 3.3χ ΠΓ1的存活率相比，SDS处理对于MYG107产生了约小于10_9的存活率。
[0123] 以类似的方式实施了氧化敏感性测试，只是添加过氧化氢至1%(v/v)。与PTA-5854约3.3χ ΠΓ1的存活率相比，过氧化氢处理对于MYG107产生了约小于10_9的存活率。
[0124] 在溶菌酶敏感性测试中，在液体LB培养基中于37°C将野生型PTA-5854菌株和 MYG107培养了2天，然后，将细胞以100μΙ等分试样分配到无菌微量离心管中。将溶菌酶添加 至lmg/ml的浓度，并将细胞于37°C温育60分钟。将经溶菌酶处理的和未处理的细胞铺板到 LB-琼脂上，并于37°C温育过夜以测定铺板效率。与PTA-5854约7.2χ ΠΓ1的存活率相比，溶 菌酶处理对于MYG107产生了约小于10_9的存活率。
[0125] 在压力敏感性测试中，在液体LB培养基中于37°C将野生型PTA-5854菌株和MYG107 培养了 2天。将培养物的一部分在弗氏加压器中于室温加压处理（以40,000psi)3次。计算了 弗氏压碎的存活率(经处理的细胞的铺板效率/未处理的细胞的铺板效率）。与PTA-5854约 1.5χ ΠΓ1的存活率相比，弗氏压碎处理对于MYG107产生了约小于10_9的存活率。
[0126] 在饥饿敏感性测试中，在液体LB培养基中于37°C将野生型PTA-5854菌株和MYG107 培养了 7天。计算了对于饥饿的存活率(第7天的铺板效率/第2天的铺板效率）。与PTA-5854 约3.3χ ΠΓ1的存活率相比，饥饿处理对于MYG107产生了约小于10_9的存活率。
[0127] 在脱水敏感性测试中，在液体LB培养基中于37°C将野生型PTA-5854菌株和MYG107 培养了2天，然后，将细胞以100μΙ等分试样分配到无菌微量离心管中，并于室温进行迅速真 空处理60分钟。将经真空干燥的细胞（用100μΙ无菌蒸馏水再水合)和未处理的细胞铺板到 LB-琼脂上，并于37°C温育过夜以测定铺板效率。计算了真空干燥的存活率(经处理的细胞 的铺板效率/未处理的细胞的铺板效率）。与PTA-5854约3.9χ ΠΓ1的存活率相比，真空干燥 对于MYG107产生了约小于10_9的存活率。
[0128] 在另一项脱水敏感性测试中，将野生型PTA-5854菌株和MYG107细胞接种到了分别 含有10%和20%大豆粉的生长培养基中。在含有10%大豆粉的培养基中而非在含有20%大 豆粉的培养基中两种菌株都实现了细胞生长。用无菌蒸馏水稀释（1:1)20%大豆粉培养基 对PTA-5854而非MYG107恢复了生长，这表明孢子化缺陷型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌菌株的 细胞需要环境中至少约80%的含水量水平来维持存活力。
[0129] 1^6107、1^6110和1^6113的特征以及创造这类菌株的方法允许将德克萨斯侧孢短 芽孢杆菌的孢子化缺陷型菌株用作经济上可行的DFM。具体地，本发明的菌株乃为使用与灭 活野生型德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞不相容的多种灭活方法(例如巴氏消毒法和/或脱 水)而准备，其提供可以用作经济上可行的DFM的菌株。
[0130] 灭活的德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞被与纯化肽进行了比较以证明灭活的细胞 与纯化的肽同等发挥功能。BT肽由活跃分裂的德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞生成，表明BT 肽不是响应饥饿而生成的"次级代谢物"。在LB培养物中，106个BT细胞含有约10微克BT肽。 换言之，1011个BT细胞会含有约1克BT肽。
[0131] 测定了灭活的德克萨斯侧孢短芽孢杆菌细胞中的BT肽浓度，并在研究中使用了与 期望的纯化肽浓度相当的灭活细胞量。用具有不同浓度的纯化BT肽或灭活德克萨斯侧孢短 芽孢杆菌细胞的食料对新孵化的鸡喂养了 2