基因nova1在制备治疗神经细胞缺氧损伤药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学生物化学领域，具体涉及治疗神经细胞缺氧损伤的药物。
【背景技术】
[0002]脑是体内能量代谢最活跃的器官，耗氧量血流量和最大，脑中风疾病已经成为当今世界致死、致残的主要疾病之一，但其发生机制至今尚未完全阐明，以往主要从能量耗竭、氧自由基损伤、脂质过氧化作用、炎症细胞因子和一氧化氮介导的损伤等角度进行研究；在治疗方面采用清除自由基、减轻钙超载、细胞保护剂应用等措施，但总体疗效甚微。脑作为体内最为复杂的器官，其中神经特异性的剪接因子及其调控显然与脑的生理状态和病理状态密切相关。Noval作为神经特异性剪接因子常用来研究其可变剪接调控的网络，而在缺氧中的研究未见报道。
【发明内容】
[0003]本发明通过构建Noval的真核表达载体,模拟神经元细胞缺氧的条件,探索Noval的缺氧损伤保护作用。
[0004]本发明以PC12细胞，即大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤为对象，建立稳定的物理缺氧损伤模型:缺氧小室，氧气浓度0.1% ；
用酶切和PCR方法构建了 Noval的真核表达载体，Pcmv-myc-Noval,并进行了测序验证；
进行细胞转染实验，从细胞形态、RNA和蛋白水平进行检测,为进一步研究Noval的缺氧损伤保护作用奠定了基础。
有益效果:
本发明通过培养的PC12，即大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞为代表建立了神经细胞缺氧损伤的模型，优化培养条件，构建了神经特异性剪接因子Noval的真核表达载体pcmv-myc-NovaI,转染神经细胞,从细胞形态、RNA和蛋白水平进行了检测，并进行了不同时间点的监测，发现在缺氧4h、6h、48h时，Noval对神经细胞有保护作用，这对缺氧损伤的研究有了新的提示。发现神经特异性剪接因子Noval具有缺氧损伤的保护作用，为今后研究缺氧损伤保护机制奠定了基础，同时，可以作为反义寡核苷酸的候选药物来进一步研究脑中风疾病。
【附图说明】
[0005]图1PCR 扩增 noval。
[0006]图2酶切鉴定重组质粒pcmv-myc-Noval。
[0007]图3Realtime-PCR 检测各组 Noval mRNA 表达。
[0008]图4以GAPDH为内参蛋白，WesternBlot法检测转pCMV-Myc-Noval组出现特异性蛋白条带。
[0009]图5WesternBlot检测各组NOVAl蛋白表达。
[0010]图6MTT检测各组缺氧不同时间后细胞存活率。
[0011]图7Realtime-PCR 检测各组缺氧 4h、6h 和 48h 后 Noval mRNA 表达。
[0012]图8Western Blot检测各组缺氧4h、6h和48h后NOVAl蛋白表达。
【具体实施方式】
[0013]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试齐U、方法和设备。
[0014]除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。
[0015]实施例1 Nova-1的真核表达载体的构建
我们购买了湖南长沙赢润生物技术公司的基因Homo sapiens neuro-oncologicalventral antigen I (NOVAl), transcript variant I NM_002515 BC075038,以克隆载体PCR4-T0P0作为模板，进行了 PCR扩增，见图1 PCR扩增noval得到清晰的条带，得到1500bp 的 Noval，(l, 3，DL2000 Marker ；2, 15μ I per 产物；4，7.5 μ I per 产物)。然后进行胶回收，用sal I和xho I双酶切，再次胶回收后与经sal I和xho I双酶切的真核表达载体pemv-myc进行连接，转入DH5a进行筛选。并进行酶切鉴定重组质粒，见图2酶切鉴定重组质粒pcmv-myc-Noval:1 孔是DL2000 Marker, 2 孔是pcmv-myc-Noval digestedby sal I and xho I , 3 孔是 pcmv-myc digested by sal I and xho I。测序后将序列在NCBI上比对，进行了正向和反向测序比对，结果证明成功构建成了 Nova-1的真核表达载体。
[0016]实施例2真核表达载体pCMV-Myc-Noval转染PC12细胞试验。
[0017](一)Lipo-2OOO转染PCl2细胞毒性检测。
[0018]用Lipo-2000转染PC12细胞，形成Lipo-2000转染组，另设PC12细胞未转染组作为参照。
[0019]将未转染组、Lipo-2000转染组，每组5孔，用MTT法检测不同时间细胞存活率，重复3次，检测结果显示，Lipo-2000转染组在转染24h、48h、72h及96h后，细胞存活率较未转染组并无明显下降。
(二)载体 pCMV-Myc-Noval 转染 PC12 细胞。
[0020]用pCMV-Myc-Noval转染PC12细胞形成转pCMV_MyC-NovaI组，另设未转染组，以及转Pcmv-myc载体、不含noval的转空载体组作为参照。
[0021](I)转染最佳时间的筛选。
[0022]将pCMV-Myc-Noval转入PC12细胞后分别培养24h、48h、72h和96h后收集细胞，采用Realtime-PCR和WesternBlot法进行检测:抽提PC12细胞的RNA，用紫外分光光度计测量RNA 0D260/280的值和浓度，RNA 0D260/280的值应在1.8-2.0之间；然后逆转录为cDNA做荧光定量PCR，在整个PCR过程中，溶解曲线只出现一个特异性的峰，这表明无引物二聚体和非特异性产物生成，引物设计合理，且整个过程也没有污染现象，内参基因和目的基因均可稳定表达。
[0023](2) RT-PCR检测Noval基因转染后的表达。
[0024]真核表达载体pCMV-Myc-Noval转染PC12细胞72h后，抽提RNA，进行Realtime-PCR检测，结果显示与未转染组相比,转pCMV-Myc-Noval组Noval mRNA的表达量明显升高，且具有显著差异，见图3，*与未转染组相比，P <0.05。这表明pCMV-Myc-Noval成功转入PC12细胞中，且成功表达Noval mRNA。而未转染组、转空载体组Noval mRNA表达量极低。
[0025](3) WesternBlot检测NOVAl基因转染后的表达。
[0026]细胞转染7此后提取蛋白，用WesternBlot法检测未转染组、转空载体组和转pCMV-Myc-Noval组N0VA1蛋白的表达量，以GAPDH为内参蛋白，检测结果所示，转pCMV-Myc-Noval组出现特异性蛋白条带,见图4,与未转染组相比,表达量明显升高,具有显著差异，见图5，*与未转染组相比，P < 0.05。这进一步表明pCMV-Myc-Noval成功转入PC12细胞中，且成功表达N0VA1蛋白，而未转染组、转空载体组N0VA1蛋白表达量极低。
(4)Noval对PC12细胞缺氧损伤保护的研究。
[0027]MTT检测各组缺氧不同时间:0h 2h 4h 6h 8h 1h 12h 24h 48h 72h后细胞存活率。
[0028]用MTT法对各组细胞进行细胞存活率检测，结果显示:与各自时间点的对照组相t匕，转入PCMV-Myc-Noval后缺氧4h、6h和48h组细胞存活率明显上升，差异显著，见图6，*与各自时间点的对照组比较，P < 0.05，而其他各组差异不显著。
实验结果表明，Noval具有缺氧损伤的保护作用，为今后研究缺氧损伤保护机制奠定了基础。
[0029]用Realtime-PCR法检测未转染组、转空载体组及转pCMV-Myc-Noval组分别缺氧4h、6h、48h后各组细胞Noval mRNA的表达,结果显不:与各自未转染组比较，缺氧4h、6h、48h,转pCMV-Myc-NovaI组Noval mRNA表达量均明显升高，且差异显著，见图7, *与各自时间点的未转染组比较，P < 0.05。
用Western Blot法检测未转染组、转空载体组及转pCMV_My c-Nova I组分别缺氧4h、6h、48h后各组细胞N0VA1蛋白的表达，结果显示:与各自未转染组比较，三个时间点，转pCMV-MyC-NovaI组N0VA1蛋白表达量均明显升高，且差异显著，见图8，*与各自时间点的未转染组比较，P < 0.05。
【主权项】
1.基因NOVAl在制备治疗神经细胞缺氧损伤药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及医学生物化学领域，具体涉及治疗神经细胞缺氧损伤的药物。发明通过构建Nova1的真核表达载体，模拟神经元细胞缺氧的条件，探索Nova1的缺氧损伤保护作用。发明以PC12细胞，即大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤为对象，建立稳定的物理缺氧损伤模型；用酶切和PCR方法构建了Nova1的真核表达载体，Pcmv-myc-Nova1，并进行了测序验证；进行细胞转染实验，从细胞形态、RNA和蛋白水平进行检测，发现神经特异性剪接因子 Nova1具有缺氧损伤的保护作用，为今后研究缺氧损伤保护机制奠定了基础。
【IPC分类】A61P25-00, A61K48-00
【公开号】CN104548138
【申请号】CN201510044038
【发明人】李华玲, 孔玲, 吕贝, 夏靖, 陈欣虹
【申请人】扬州大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月29日