Vgll4基因治疗肿瘤的用途及其相关药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及VGLL4基因治疗肿瘤的用途及其相关药物。
【背景技术】
[0002] 胃癌是全世界范围内仅次于肺癌的发生率的癌症，其预后较差，死亡率很高。然 而，目前对于胃癌发生的分子机制还不甚清楚，也没有有效的检测手段可以检测早期胃癌， 对于胃癌相关的原癌基因和抑癌基因还有待于进一步株入的研宄。
[0003] 近年来的研宄发现Hippo信号通路中的关键转录共激活因子YAP在肺癌、肝癌、结 肠癌、胰腺癌、乳腺癌中表达明显上调，是一个原癌基因。
[0004] Hippo信号通路参与细胞增殖，细胞分化以及细胞凋亡等生理过程，在器官大小调 控中起着至关重要的作用。Hippo信号通路，从果蝇到人，在进化上都十分保守。Hippo信 号通路的核心激酶MST1/2和Latsl/2被激活后产生激酶级联效应，使该通路下游的转录共 激活因子YAP/TAZ被磷酸化，进而与14-3-3蛋白相互作用而被滞留在胞质中，阻碍其入核 与DNA结合转录因子TEAD/TEF的相互作用，从而抑制TEAD/TEF的转录活性。反之，YAP入 核之后则与TEAD/TEF结合形成活性的转录复合物，启动下游靶基因的转录，从而抑制细胞 凋亡，促使细胞增殖。因此，Hippo信号通路的紊乱会引起抗凋亡作用，使细胞过度增殖，增 加癌症的患病风险。
[0005] VGLL4基因是转录共调节因子，其在果幡中的同源基因 Vestigial 4(Vg)在果幡 翅膀的发育中起到关键的调节作用，在功能上它与YAP密切相关。Vg不具有DNA结合结构 域，它与Sd通过Tondu (TDU)结构域相互作用，形成"杂合型"共转录调控复合物调控基因 转录。哺乳动物中VGLL1-3的N端具有一个保守的TDU结构域，而VGLL4的C端具有两个 保守性相对较低的TDU结构域。VGLL蛋白的TDU结构域，介导其与TEAD蛋白的相互作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于公开VGLL4基因及其同源基因治疗肿瘤的用途及其相关药物， 其中，VGLL4通过抑制YAP介导的TEAD4转录激活，从而抑制在胃癌中高表达的TEAD4靶基 因 CDX2等的转录，最终达到抑制癌细胞增殖的目的。
[0007] 本发明首先公开了分离的VGLL4基因及其同源序列在制备或筛选肿瘤治疗药物， 或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。
[0008] 优选的，所述肿瘤选自胃癌。
[0009] VGLL4基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:59所示（可参考genebank中序列号为 NM_001128219. 1 的序列）。
[0010] 优选的，所述VGLL4的同源序列为与genebank中标号为NM_001128219. 1所示序 列的核苷酸序列在确定的分子长度内，序列显示有至少约50%;优选至少约为75%;更佳至 少约为80-85% ;尤其佳至少约为90% ;最佳至少约为95-98 %序列相似性的DNA序列。
[0011] 更优选的，所述VGLL4的同源序列选自小鼠 VGLL4基因或果蝇Vestigial 4基因。
[0012] 所述VGLL4基因及其同源序列在制备肿瘤诊断药物中的用途，是指将VGLL4基因 表达水平作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。
[0013] 所述VGLL4基因及其同源序列在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途，是指以 VGLL4基因为目的基因，制备或筛选能调控（上调或下调）该基因表达的药物。
[0014] 所述通过分离的VGLL4基因制备或筛选获得的肿瘤治疗药物或者肿瘤诊断药物 包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病 毒。
[0015] 所述肿瘤治疗药物的施用量为足够改变人VGLL4基因的转录或翻译，或者足够改 变人VGLL4蛋白的表达或活性的剂量。
[0016] 采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过过表达人VGLL4基因，通过 有效阻断YAP与TEAD的相互作用，从而抑制TEAD的转录激活，最终达到抑制肿瘤细胞增殖 的目的。具体的，治疗时，将能过表达VGLL4基因的物质给药于患者。
[0017] 本发明第二方面公开了一种治疗肿瘤的多肽或蛋白药物，所述多肽或蛋白含有 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0018] 优选的，所述多肽的序列如SEQ ID NO :1所示，为VGLL4的串联TDU结构域；所述 蛋白的序列如SEQ ID NO: 58所示，为VGLL4蛋白。
[0019] 本发明证实VGLL4蛋白的TDU串联结构域与单独的TDU结构域都能在MGC-803细 胞系中抑制YAP介导的细胞增殖，抑制YAP介导的TEAD转录激活以及下调TEAD下游靶基 因 CDX2的表达。因而TDU结构域本身是VGLL4转录抑制关键结构域，第二个TDU结构域的 转录抑制作用最为明显。并且，本发明还通过生化分析发现，VGLL4和YAP竞争结合TEAD， 其与TEAD的结合具有剂量依赖效应。
[0020] 本发明第三方面公开了一种治疗癌症的Super-TDU多肽，所述Super-TDU多肽的 氨基酸序列含有SEQ ID NO :66和SEQ ID NO :67所示的氨基酸序列。
[0021] 优选的，所述Super-TDU多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0022] 更优选的，所述Super-TDU多肽还包括在SEQ ID NO :1所示序列的氨基酸侧链 基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基 化等修饰，得到的具有癌症治疗活性的多狀衍生物；基于SEQ ID NO :1所不的氣基酸序列 经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加等突变形成的具有癌症治疗活性的衍生多 肽；或者，为基于SEQ ID NO :1所示Super-TDU核心序列（HF，组氨酸-苯丙氨酸）的蛋白 质工程改造获得的衍生多肽。
[0023] YAP-TEAD复合物通过3个关键的相互作用界面形成异源二聚体。而VGLL4的TDU 结构域与YAP的TEAD-bingding结构域（TBD)类似，通过TDU结构域与TEAD蛋白形成复合 物，2个关键的相互作用界面，其复合物构象与YAP-TEAD类似。通过三维结构比较和突变 与生化实验发现VGLL4和YAP在TEAD上的结合位点有重合，但各自结合TEAD的最关键位 点并不重合。具体而言，YAP的第三个相互作用界面（氨基酸序列如SEQ ID NO :67所示） 对其结合TEAD最重要，而VGLL4的第二个相互作用界面（氨基酸序列如SEQ ID NO :66所 示）对其结合TEAD最重要。
[0024] 因此本发明设计了 Super-TDU多肽，该多肽包含YAP-TEAD第三个相互作用界面 以及VGLL4-TEAD第二个相互作用界面的氨基酸序列，可以占据TEAD与YAP以及VGLL4 相互作用的界面。该多肽具有核定位信号，可以正常入核发挥功能。在体外和体内检测 了 Super-TDU多肽对胃癌的治疗作用。结果发现，Super-TDU多肽显著抑制了胃癌细胞 MGD-803的细胞增殖（>50% )，同时在MGC-803的细胞克隆形成实验中，相较于TDU结构域， Super-TDU多肽表现出更强的抑制细胞克隆形成的作用。同时在诱导成瘤的小鼠模型中，被 给予Super-TDU多肽的小鼠体内的肿瘤在体积和重量上都明显减少，且与Super-TDU用量 有计量依赖效应。Super-TDU多肽能有效地阻断YAP-TEAD的相互作用，抑制YAP介导的转 录激活，在肿瘤治疗中有潜在的临床应用价值。
[0025] 优选的，所述癌症选自胃癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、骨肉瘤、宫颈癌或者结 肠癌。本发明的Super-TDU多肽可应用于制备肿瘤治疗药物。
[0026] 本发明第四方面公开了一种治疗癌症的药物组合物，其含有前述多肽药物、前述 蛋白药物，和/或前述Super-TDU多肽。
[0027] 本发明第五方面公开了一种肿瘤诊断试剂盒，其含有针对VGLL4基因的RT-PCR引 物。
[0028] 优选的，所述针对VGLL4基因的RT-PCR引物序列如SEQ ID NO :3-4所示。
[0029] 优选的，所述试剂盒还含有针对YAP基因的RT-PCR引物。
[0030] 更优选的，所述针对YAP基因的RT-PCR引物序列如SEQ ID NO :5-6所示。
[0031] 本发明最后一方面公开了一种治疗肿瘤的方法，包括对患者施用前述述多肽或蛋 白药物，和/或前述Super-TDU多肽。
[0032] 本发明还公开了一种肿瘤诊断方法，包括对患者的VGLL4基因表达水平进行检 测。
[0033] 优选的，所述肿瘤诊断方法还包括对患者的YAP基因表达水平进行检测。
[0034] 较优的，所述肿瘤选自胃癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、骨肉瘤、宫颈癌或者结 肠癌。
[0035] 本发明发现，在84例胃癌样本中，60%的样本中YAP表达明显上调。而同样在这 些样本中，61%的样本转录因子VGLL4表达明显下调，而且胃癌TMN病理分期和临床分期越 晚，VGLL4表达下调的比例越高，临床I期的胃癌样本中35. 7% VGLL4表达下调，而在临床 IV期的胃癌样本中80% VGLL4表达下调，说明VGLL4很可能是胃癌发生过程中一个重要的 抑癌基因。通过TEAD4报告基因实验发现，VGLL4抑制YAP介导的TEAD4转录激活、抑制在 胃癌中高表达的TEAD4靶基因⑶X2的转录并且抑制胃癌细胞系MGC-803的细胞增殖。
[0036] 本发明公开了 VGLL4基因及其同源基因，或者VGLL4基因或其同源基因编码的氨 基酸序列在制备用于抑制胃癌肿瘤细胞生长的药物、开发抗癌药物，制备胃癌早期诊断和 治疗手术预后药物中的用途。并且利用VGLL4通过抑制YAP介导的TEAD4转录激活，从而 抑制在胃癌中高表达的TEAD4靶基因 CDX2等的转录，最终抑制癌细胞