一种治疗肝硬化的基因药物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因药物领域，尤其涉及一种治疗肝硬化的基因药物及其制备方法。
【背景技术】
[0002]肝硬化是临床常见的慢性、疑难性疾病，在我国是一种发生较为广泛的疾病。肝硬化在病理组织学上的表现为残存干细胞结节性再生、广泛的干细胞坏死、结缔组织增生与纤维隔形成，最终导致肝小叶结构破坏和假小叶形成，肝脏逐渐变形、变硬而发展为肝硬化。在肝硬化早期，由于肝脏的代偿功能较强，因此患者感觉不到明显的症状。肝硬化在后期则以肝功能损害和门脉高压为主要表现，并有多系统受累。肝硬化在晚期时，长出现继发感染、脾功能亢进、上消化道出血、肝性病脑腹水、甚至导致癌变等并发症。
[0003]肝硬化按照病因可以分为多种类型，比如包括病毒性肝炎肝硬化、酒精性肝硬化、寄生虫肝硬化、代理性肝硬化、肝静脉回流受阻性肝硬化、自身免疫性肝硬化、胆汁淤积性肝硬化、营养不良性肝硬化、毒物和药物性肝硬化、隐源性肝硬化等。在我国，大部分肝硬化为病毒性肝炎肝硬化，其次为酒精性肝硬化和寄生虫肝硬化等。
[0004]其中，病毒性肝炎肝硬化是指病毒性肝炎发展至后期形成的肝硬化。现已知肝炎病毒有甲乙丙丁戊等类型。而研究表明，乙型肝炎和丙型肝炎容易转成慢性肝炎，继而进一步转变为肝硬化。而甲型肝炎及戊型肝炎不易形成肝硬化。酒精性肝硬化主要是由于长期大量酗酒引起的。寄生虫肝硬化如血吸虫或肝吸虫等虫体在门脉系统寄居，虫卵随门脉血流沉积于肝脏内，引起门静脉小分支栓塞而形成。
[0005]然而，肝硬化是因为组织结构紊乱而致肝功能障碍，目前肝硬化的治疗手段非常有限，无法根治，主要的治疗方法在于早期发现和阻止病程进展。根据肝硬化病情的逐渐发展，其治疗方法有早期筛查、控制饮食、支持治疗、病因特异性治疗、服用降低门静脉压力药物、腹腔积液治疗、肝移植等治疗方式。
[0006]对肝硬化治疗而言，早期的筛查尤为重要，可以通过早期越早的诊断，越早采用相应的治疗措施。在诊断为肝硬化之后，可以通过控制饮食来进一步延缓肝硬化的发展。支持治疗主要是指静脉输入高渗葡萄糖液以补充热量，以及胰岛素、氯化钾、维生素C电解质等缓解肝硬化的进一步发展。病因特异性治疗主要是指根据引起肝硬化的原因的不同而采取不同的辅助治疗方法，比如主要由肝炎病毒引起的肝硬化，就需要利用抗病毒药物治疗，以便减轻或者减缓肝硬化。对于肝硬化的药物治疗而言，目前并没有有效的药物可以用来直接治疗肝硬化，多数药物是用来降低肝门静脉压力的，比如心得安、钙离子通道阻滞剂等。肝硬化晚期患者会有大量的腹腔积液，因此，还会根据患者病情采用利尿剂治疗、提高血浆渗透压等方法减少腹腔积液。肝硬化到了晚期发展为肝癌、肝衰竭等，通过肝脏移植的方法可以取得较好的治疗效果，然而肝脏捐献数量极其稀少、费用及其昂贵，无法满足需求。
[0007]目前的治疗肝硬化的方法基本上都是间接延缓肝衰竭的发展，而不能够根治。因此，目前对于广泛发病的肝硬化而言，缺少有效的直接治疗手段，亟待开发新的治疗肝硬化的药物。
[0008]因此，现有的治疗肝硬化的技术还有待改进和开发。
【发明内容】
[0009]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种治疗肝硬化的基因药物及其制备方法，旨在解决现有技术无法直接治疗肝硬化的问题。。
[0010]本发明的技术方案如下:
一种治疗肝硬化的基因药物，其中，其活性成分是以腺相关病毒为出发载体构建的携带有表达基质金属蛋白酶的重组腺相关病毒载体。
[0011]所述的一种治疗肝硬化的基因药物，其中，所述腺相关病毒为2型腺相关病毒，包括AAV2/1、AAV2/2、AAV2/3、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8和AAV2/9。
[0012]所述的一种治疗肝硬化的基因药物，其中，所述基质金属蛋白酶包括丽P-1、MMP-
2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14和MMP-150
[0013]所述的一种治疗肝硬化的基因药物，其中，所述基质金属蛋白酶为其活性结构域部分。
[0014]所述的治疗肝硬化的基因药物的制备方法，其中，包括步骤:
A、构建重组质粒:采用EcoRI和BamH I对AAV载体进行双酶切，将酶切后的AAV载体与合成的编码基质金属蛋白酶的核苷酸序列按照摩尔比例1:10混合，再加入T4 DNA连接酶buff er溶液，制得重组质粒；
B、重组质粒的转化:将重组质粒向感受态DH5a细菌中转化，阳性克隆质粒即为携带有表达基质金属蛋白酶的重组质粒；
C、重组腺相关病毒的包装:将携带有表达基质金属蛋白酶的重组质粒、脂质体、和辅助包装质粒混合均匀后，加入到293T细胞培养皿中培养，制得表达基质金属蛋白酶的重组腺相关病毒。
[0015]所述的治疗肝硬化的基因药物的制备方法，其中，所述步骤A中:
与AAV载体进行重组的核苷酸序列为MMP序列，MMP活性结构域序列，不同型号的MMP串联序列或者不同型号的MMP活性结构域串联序列。
[0016]所述的治疗肝硬化的基因药物的制备方法，其中，当AAV载体与不同型号的丽P串联序列或者不同型号的MMP活性结构域串联序列进行重组时，所述不同型号的MMP串联序列之间或者不同型号的MMP活性结构域串联序列之间用IRES序列隔开。
[0017]所述的治疗肝硬化的基因药物的制备方法，其中，所述步骤C具体包括:
Cl、复苏293T细胞进行培养，待细胞长满后按照1:2传代至培养皿中，在病毒包装前2?5小时，将培养皿中的培养液换成新的不含双抗的包含10%FBS的DMEM高糖完全培养基，待用；C2、将携带有表达基质金属蛋白酶的重组质粒20yg、脂质体50μ1、和辅助包装质粒1yg混合均匀，常温放置15分钟后，加入到上述待用细胞培养皿中培养，六小时后换液；
C3、继续在细胞培养箱中培养72?80小时，收集上清液，过滤、离心，最后制得表达基质金属蛋白酶的重组腺相关病毒。
[0018]所述的治疗肝硬化的基因药物的制备方法，其中，所述步骤C3中，细胞培养箱的温度设置为37 °C，⑶2浓度为5%。
[0019]所述的治疗肝硬化的基因药物的制备方法，其中，所述步骤C3中，采用0.44μπι的滤器过滤病毒液。
[0020]有益效果:本发明提供的治疗肝硬化的基因药物，以腺相关病毒为出发载体构建了一种携带有表达基质金属蛋白酶的重组腺相关病毒载体，其结合了腺相关病毒的优良特点和基质金属蛋白酶可以溶解细胞外基质的特点。腺相关病毒，尤其是2型腺相关病毒，其几乎不整合进入细胞基因组，从而避免了像慢病毒等其他病毒介导基因表达整合进入细胞基因组诱发肿瘤的风险，又具有高效感染细胞的能力。2型腺相关病毒能够较为特异地感染肝脏细胞，从而较高靶向性地聚集在肝脏表达目的基因，而不会大量地在其他细胞组织中表达，肝脏靶向性极强。而结合基质金属蛋白酶可以在细胞外降解细胞外基质的特点，可以有效减少肝硬化的肝脏细胞外的细胞基质，从而有效缓解肝硬化，甚至完全治疗肝硬化。
【附图说明】
[0021]图1为本发明一种治疗肝硬化的基因药物的制备方法较佳实施例的流程图。
[0022]图2为图1所示方法中重组腺相关病毒的包装的具体流程图。
【具体实施方式】
[0023]本发明提供一种治疗肝硬化的基因药物及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0024]在本发明中，治疗肝硬化的基因药物，其活性成分是以腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)为出发载体构建的携带有能够表达基质金属蛋白酶(MatrisMetalloproteinase, MMP)的重组腺相关病毒载体。所述腺相关病毒载体具有安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，以及在体内表达外源基因时间长多种优良特点，被视为最有前途的基因转移载体之一。
[0025]本发明采用的腺相关病毒，尤其是2型腺相关病毒，其几乎不整合进入细胞基因组，从而避免了像慢病毒等其他病毒介导基因表达整合进入细胞基因组诱发肿瘤的防线，同时他又具有高效感染细胞的能力。本发明所述2型腺相关病毒包括有AAV2/l、AA