辅助包装质粒10微克以及脂质体50微升混合均匀，在常温放置15分钟，然后加入到细胞培养皿中，摇晃均匀，六个小时之后换液;继续在细胞培养箱(37 °C, 5% CO2浓度)中培养72-80小时后，收集上清液到50 ml离心管中，然后用0.44微米的滤器过滤病毒液;之后采用超速离心(lOOOOOr/分钟，4°C，离心3小时)；最后将离心管的上清废液去除，沉淀溶于磷酸铵缓冲液或者生理盐水中，然后将表达MMP-2的AAV病毒以及表达MMP-2活性域的AAV病毒分装并做好标记后放-80 V冰箱保存。
[0037]
实施例2
制备表达MMP-3或MMP-3活性结构域的重组AAV病毒
首先合成MMP-3的CDS编码核苷酸序列Seq-MMP-3及MMP-3的活性结构域的编码核苷酸序列Seq-MMP-3-Act，具体分别示于序列表中序列3和序列4，所述合成序列两端还包含EcoRI和BamH I酶切位点，将上述合成序列构建到AAV载体中。构建步骤为:采用EcoR I和BamH I对AAV载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的AAV载体与合成的MMP-3序列或者MMP-3活性域序列按照摩尔比例为1:10混合(20微升体系)，再加入T4 DNA连接酶buffer溶液，之后在45 °C水浴热激5分钟，热激之后放置到4 °C冰箱5分钟，最后加入2微升T4 DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
[0038]重组质粒连接之后，第二天做细菌转化，其过程为:从-80°C冰箱取出DH5a细菌(每管50微升)，然后将细菌放置在冰上解冻，同时将连接的质粒也放置在冰上;之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟;然后将混合物在42°C水浴90秒钟；其后，迅速将混合物再放置在冰上2-3分钟；然后向管中加入灭过菌的无抗生素的LB细菌培养基500微升，放置在37°C振荡培养I小时;培养完成之后涂平板，然后放置在37 °C培养过夜;第二天挑取克隆测序。
[0039]对测序正确的质粒(S卩测序序列通过序列比对与MMP-3序列或者MMP-3活性域序列一致)进行进一步扩增并提取质粒，然后进行AAV病毒的包装。包装过程为:首先复苏293T细胞，培养到一定数量;待细胞长满后，按照I: 2传代至10 cm的培养皿中；当细胞长到60%-80%汇合度时，每个10 cm的培养皿在病毒包装前2-5小时，换成10 ml新鲜的不含双抗的包含10%FBS的DMEM高糖完全培养基;换完新鲜培养基2_5小时后，我们开始做质粒转染，质粒转染采用脂质体转染方法，其主要过程为:将测序鉴定好的装载MMP-3表达序列或者MMP-3活性域序列的AAV载体质粒20微克、辅助包装质粒10微克以及脂质体50微升混合均匀，在常温放置15分钟，然后加入到细胞培养皿中，摇晃均匀，六个小时之后换液;继续在细胞培养箱(37 °C, 5% CO2浓度)中培养72-80小时后，收集上清液到50 ml离心管中，然后用0.44微米的滤器过滤病毒液;之后采用超速离心(lOOOOOr/分钟，4°C，离心3小时)；最后将离心管的上清废液去除，沉淀溶于磷酸铵缓冲液或者生理盐水中，然后将表达MMP-3的AAV病毒以及表达MMP-3活性域的AAV病毒分装并做好标记后放-80 V冰箱保存。
[0040]
实施例3
制备表达MMP-9或MMP-9活性结构域的重组AAV病毒
首先合成MMP-9的CDS编码核苷酸序列Seq-MMP-9及MMP-9的活性结构域的编码核苷酸序列Seq-MMP-9-Act，具体分别示于序列表中序列5和序列6，所述合成序列两端还包含EcoRI和BamH I酶切位点，将上述合成序列构建到AAV载体中。构建步骤为:采用EcoR I和BamH I对AAV载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的AAV载体与合成的MMP-9序列或者MMP-9活性域序列按照摩尔比例为1:10混合(20微升体系)，再加入T4 DNA连接酶buffer溶液，之后在45 °C水浴热激5分钟，热激之后放置到4 °C冰箱5分钟，最后加入2微升T4 DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
[0041 ]重组质粒连接之后，第二天做细菌转化，其过程为:从-80 °C冰箱取出DH5a细菌(每管50微升)，然后将细菌放置在冰上解冻，同时将连接的质粒也放置在冰上;之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟;然后将混合物在42°C水浴90秒钟；其后，迅速将混合物再放置在冰上2-3分钟；然后向管中加入灭过菌的无抗生素的LB细菌培养基500微升，放置在37°C振荡培养I小时;培养完成之后涂平板，然后放置在37 °C培养过夜;第二天挑取克隆测序。
[0042]对测序正确的质粒(S卩测序序列通过序列比对与MMP-9序列或者MMP-9活性域序列一致)进行进一步扩增并提取质粒，然后进行AAV病毒的包装。包装过程为:首先复苏293T细胞，培养到一定数量;待细胞长满后，按照I: 2传代至10 cm的培养皿中；当细胞长到60%-80%汇合度时，每个10 cm的培养皿在病毒包装前2-5小时，换成10 ml新鲜的不含双抗的包含10%FBS的DMEM高糖完全培养基;换完新鲜培养基2_5小时后，我们开始做质粒转染，质粒转染采用脂质体转染方法，其主要过程为:将测序鉴定好的装载MMP-9表达序列或者MMP-9活性域序列的AAV载体质粒20微克、辅助包装质粒10微克以及脂质体50微升混合均匀，在常温放置15分钟，然后加入到细胞培养皿中，摇晃均匀，六个小时之后换液;继续在细胞培养箱(37 °C, 5% CO2浓度)中培养72-80小时后，收集上清液到50 ml离心管中，然后用0.44微米的滤器过滤病毒液;之后采用超速离心(lOOOOOr/分钟，4°C，离心3小时)；最后将离心管的上清废液去除，沉淀溶于磷酸铵缓冲液或者生理盐水中，然后将表达MMP-9的AAV病毒以及表达MMP-9活性域的AAV病毒分装并做好标记后放-80 V冰箱保存。
[0043]
实施例4
制备表达MMP-13或MMP-13活性结构域的重组AAV病毒
首先合成MMP-13的CDS编码核苷酸序列Seq-MMP-13及MMP-13的活性结构域的编码核苷酸序列Seq-MMP-13-Act，具体分别示于序列表中序列7和序列8，所述合成序列两端还包含EcoR I和BamH I酶切位点，将上述合成序列构建到AAV载体中。构建步骤为:采用EcoR I和BamH I对AAV载体进行双酶切，然后用胶回收试剂盒进行胶回收。将胶回收的AAV载体与合成的MMP-13序列或者MMP-13活性域序列按照摩尔比例为1:10混合(20微升体系)，再加入下4DNA连接酶buffer溶液，之后在45 °C水浴热激5分钟，热激之后放置到4 °C冰箱5分钟，最后加入2微升T4 DNA连接酶，在16摄氏度连接过夜。
[0044]重组质粒连接之后，第二天做细菌转化，其过程为:从-80°C冰箱取出DH5a细菌(每管50微升)，然后将细菌放置在冰上解冻，同时将连接的质粒也放置在冰上;之后用微量移液器吸取3-5微升质粒，加入细菌中，混合均匀，然后将混合物继续放置冰上5-10分钟;然后将混合物在42°C水浴90秒钟；其后，迅速将混合物再放置在冰上2-3分钟；然后向管中加入灭过菌的无抗生素的LB细菌培养基500微升，放置在37°C振荡培养I小时;培养完成之后涂平板，然后放置在37 °C培养过夜;第二天挑取克隆测序。
[0045]对测序正确的质粒(即测序序列通过序列比对与MMP-13序列或者MMP-13活性域序列一致)进行进一步扩增并提取质粒，然后进行AAV病毒的包装。包装过程为:首先复苏293T细胞，培养到一定数量;待细胞长满后，按照1: 2传代至10 cm的培养皿中；当细胞长到60%-80%汇合度时，每个10 cm的培养皿在病毒包装前2-5小时，换成10 ml新鲜的不含双抗的包含10%FBS的DMEM高糖完全培养基;换完新鲜培养基2_5小时后，我们开始做质粒转染，质粒转染采用脂质体转染方法，其主要过程为:将测序鉴定好的装载MMP-13表达序列或者MMP-13 活性域序列的 AA V 载体质粒 20 微克、辅助包装质粒 10 微克以及脂质体 50 微升混合均匀 ，在常温放置15分钟，然后加入到细胞培养皿中，摇晃均匀，六个小时之后换液;继续在细胞培养箱(37°C，5% CO2浓度)中培养72-