专利名称：：应用流式细胞术检测病毒载体类基因治疗药物感染滴度的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因治疗药物分析检测领域，特别提供了应用流式细胞术检测病毒载体类基因治疗药物感染滴度的方法。
背景技术：
：基因治疗是当今医学与生物领域研究的热点，对于某些重大疾病的防治，如肿瘤，艾滋病，心血管疾病等，基因治疗显示出广阔的前景。现有的基因治疗临床实验方案中，以病毒为载体的基因治疗方案居多，在病毒载体类基因治疗产品的质量控制和临床应用中，比活是一项重要指标，即有活性病毒粒子数总病毒粒子数。总病毒粒子数的测定方法主要有电镜法，光吸收法，离子交换HPLC，PicoGreen法等。而有活性病毒粒子数的测定是基于病毒所能产生的可以定量的生物效应，传统的噬斑法一直以来被视为标准方法，其依赖于病毒复制和若干轮的细胞分裂而产生肉眼可见的病毒噬斑，该方法周期长(14天)，肉眼判定，客观性差。而免疫荧光法是通过将病毒样品稀释到一定比例后感染细胞，培养一段时间后用荧光标记的抗体染色，在荧光显微镜下记数阳性细胞，结合稀释倍数做结果判定，由于该方法为单点法，无法避免若干次稀释带来的累积误差，而且通过肉眼观察，根据细胞荧光强度判定阳性细胞，客观性差。还有一种方法是基于观察细胞病变的TCID50法，即半数组织细胞感染量法，该方法也存在周期长，肉眼判定的缺点。流式细胞术是一种新兴的细胞分析技术，国外曾有利用流式细胞术检测腺病毒感染滴度的报道，但其理论和数学依据是在病毒量较小的情况下，细胞的感染率与病毒量近似成正比，不能完全模拟病毒量和细胞感染率之间的数量关系。因此，我们寄希望建立一个更科学的模型，在此模型的基础上建立相应的技术方案，以便能够使用流式细胞术更加快速，准确的检测病毒载体类基因治疗药物的感染滴度。
发明内容1、发明目的目前，病毒载体类基因治疗方案不断出现，但现有的用于检测病毒感染滴度的技术方法都存在一定的缺点。所以，我们需要建立一种更加科学，更加快速准确的方法来检测病毒感染滴度。这对于该类产品的研究开发，质量控制乃至临床应用都具有重要意义。2、技术方案本方法的建立是以传播缺陷型仙台病毒载体为研究对象，流式细胞仪为检测方法，建立以泊松分布为基础的数学模型做曲线拟合，结合所建立的计算方法，以函数中的一项参数做结果判定。其技术流程为LLC-MK2细胞铺六孔板一细胞记数，病毒感染细胞(每个MOIn对应一个孔)一消化并收集细胞一固定一渗透化一封闭一一抗孵育一FITC标记的二抗孵育一流式上机检测，记录各M01n对应的阳性细胞百分数一使用CurveExpert1.3做曲线拟合，结果判定。本技术方案为针对传播缺陷型仙台病毒载体，对于其它类型病毒载体同样适用。数学模型的推导和建立过程为-本数学模型的建立是基于泊松分布，所谓随机变量X服从Poisson分布，是指X取值范围为O,其相应取值概率为XPoisson分布主要用于描述单位时间(空间)中稀有事件的发生数，比如一定区域内某种微生物或粉尘的计数分布，单位容积充分摇匀的水中的细菌数，比如某河中平均每毫升河水中有6个细菌，则由该河中随机抽取1毫升水中的细菌数X服从以P=6为参数的Poisson分布，._6"x=0，1…泊松分布适合于模拟病毒感染单细胞层面，由于病毒的体积相对于细胞非常小(l:109)，一定量的病毒感染单细胞层面时，可看作一定区域内某种微生物的计数分布。而且该仙台病毒为传播缺陷型，子一代病毒不会感染其它细胞，在某一MOI(病毒与细胞总的数量比，相当于一个细胞的区域范围内平均有MOI个病毒)下，那么一个细胞被k个病毒感染的概率为,、M01kxe-M01Pr(X=k)=-每个细胞被感染的概率P即细胞至少被一个病毒感染的概率，贝IJ:Pr(cellinfected)=p=Pr(X》l),、—顧=1-Pr(X=0)=1-e那么在此M0I下，细胞被感染的阳性百分数为y-恥i、9dINF=100X(l-e)设样品中实际的活性病毒滴度为m，实验前由于m未知，假定其滴度为n,m=BXn,根据血球记数仪得到的细胞总数，结合假定值n将样品做成不同稀释度，即得到不同的MOL，由于m=BXn，则M0I=BXM0In(MOI为对应于m的实际值，MOL为根据假定值n得到的表观值)，将其代入上式，同时被感染的细胞中有一定比例由于状态不好，不能表达大量病毒蛋白，或由于染色时不均一产生假阴性，需引入一个参数A，艮卩%IFN=100XAX(l-en)(此即为所建立的数学模型)3、有益效果该方法的建立有利于病毒载体类基因治疗药物的研究开发，质量控制和临床应用，有望成为一种标准方法，为其它相关方法提供对照。具有较高的理论价值和应用价值。通过与传统的方法如噬斑法，免疫荧光法做对照，该方法具有以下优点1.传统方法多将样品高倍稀释，采用单点上样，无法避免高倍稀释带来的累计误差，而流式测定采用多个稀释度，采用曲线拟合，避免了这种不足。2.传统方法多采用肉眼观测记数，客观性差，不同操作者之间变异大，而流式测定借助仪器分析，结果更客观。3.由于被感染的细胞有一定比例由于状态不好，无法支持病毒大量复制，或由于染色原因造成一定比例假阴性。采用传统方法无法避免这种误差，会造成结果偏低，而流式测定的数学模型中引入一项参数A，可将此误差校正，而结果判定由B决定，因此避免了对结果的干扰。4.病毒感染细胞后到染色之前需培养一定时间，在此过程中一小部分细胞(包括感染细胞和非感染细胞)会分裂，免疫荧光法中镜下观察常见两个荧光细胞连在一起的现象(图五)，很难区别是一个阳性细胞分裂为两个还是两个单独的阳性细胞(实际操作中若两细胞间隔大于一个细胞判为两个，否则判为一个)，给结果判定带来误差，而流式测定是记数阳性比(细胞分裂前后，阳性比不会改变)，则回避了细胞分裂带来的误差。图l各MOIn对应的流式荧光直方图和细胞的感染率。图l-l阴性对照的流式荧光直方图1-2MOI^15对应的流式荧光直方图，细胞的感染率为97.2%;图1-3M0I^10对应的流式荧光直方图，细胞的感染率为97.3%;图l-4MOI^5对应的流式荧光直方图，细胞的感染率为96.4%;图l-5MOL^2对应的流式荧光直方图，细胞的感染率为88.1%;图l-6M0I=1对应的流式荧光直方图，细胞的感染率为66.6%;图卜7M0I=0.8对应的流式荧光直方图，细胞的感染率为56.4%;图l-8M0I^0.6对应的流式荧光直方图，细胞的感染率为47.6%;图1-9M0I^0.4对应的流式荧光直方图，细胞的感染率为32.0%;图I-IOM0I^0.2对应的流式荧光直方图，细胞的感染率为16.9%;图l-llMOI。=0.l对应的流式荧光直方图，细胞的感染率为9.4%;图1-12MOI=0.05对应的流式荧光直方图，细胞的感染率为4.6%。图2根据先IF^100XAX(卜e—BXMO、)所得拟合曲线，r二O.99927370,A=0.9756678,B=1.0896634。图3孵育时间<3天对应的流式荧光直方图。图3-l阴性对照的流式荧光直方图3-2可见阴性峰和阳性峰未完全分开，出现假阴性；图3-3可见阴性峰和阳性峰未完全分开，出现假阴性。图4分别使用LLC-MK2/F细胞和Vero细胞的噬斑图片；图4-1使用LLC-MK2/F细胞的阳性对照；图4-2使用LLC-MK2/F细胞的阴性对照；图4-3使用LLC-MK2/F细胞的传播缺陷型仙台病毒；图4-4使用Vero细胞的阳性对照；图4-5使用Vero细胞的阴性对照；图4-6使用Vero细胞的传播缺陷型仙台病毒。图5应用免疫荧光法，视野下的阳性细胞。一个细胞代表一个有感染能力的病毒，可见两个细胞相连的现象。具体实施例方式以下给出了检测传播缺陷型仙台病毒载体的具体实施例，但本发明并不局限在以下实施例中。l.材料与方法1.l研究对象携带外源治疗基因的传播缺陷型仙台病毒(Sev/AF)。该病毒载体F基因缺失，其包膜上的F蛋白由经过改造的恒河猴肾细胞(LLC-MK2)LLC-MK2/F/Ad反式提供。以该病毒感染LLC-MK2后，形成的子一代病毒缺失F蛋白，失去感染其它细胞的能力。1.2仙台病毒阳性对照(无缺陷型)为本实验室保存。1.3试剂1.3.1胎牛血清(FCS)，MEM，0.25%trypsin-Versene为Gibco产品。1.3.2anti-Sev兔血清，FITC标记的羊抗兔IgG。1.3.3缓冲液、稀释液、洗液PBS，1%BSA;固定液4%多聚甲醛；封闭掖5%FCS;渗透化液0.l%TritonX-100~PBS。1.4细胞LLC-MK2细胞为恒河猴肾细胞，购自ATCC(ATCCCCL7.1)。该细胞使用含10%FCS的MEM培养基，以2X106接种于75cm2方瓶，于37°C，5%C02孵箱中培养三天后，用0.25%trypsin-Versene消化传代。1.5仪器流式细胞仪，FACSCanto,美国BD公司产品；国产800型离心机。1.6数据分析软件CurveExpert1.3。1.7实验流程1.7.1试验前72小时以LLC-MK2细胞铺六孔板，MEM_10%FCS2ml/孔。1.7.2上样病毒前首先选择一孔，将细胞消化后用血球记数仪记数。结合细胞总数，假定值n，病毒上样体积(lOOyl)，将样品用1細SA做不同稀释度，得到不同的MOIn。1.7.3病毒上样，每个MOL对应一个细胞孔，上样体积为100ul，同时设一阴性孔，加lOOul1%BSA。摇匀，使病毒液均匀铺在细胞上，置37'C，5%的C02培养箱培养1小时，每隔15分钟摇板一次。1.7.4吸去病毒上清，加入PBS(lml/孔)洗一遍，吸干PBS。加入2ml的MEM，37°C，5%的0)2培养箱培养3天。1.7.5吸去MEM，加入PBS(lml/孔)洗一遍，吸干PBS。加入0.5ml/孔0.25%trypsin-Versene，37°C,3min，加入0.5ml/孔10%FCS-MEM，吹匀转入流式管，1000rpm,5min，弃上清。1.7.6固定先用750ulPBS重悬细胞，置震荡器上缓慢加入250ul16%多聚甲醛，4。C，30min。1500rpm,5min，弃上清。1.7.7渗透化0.l%TritonX-100—PBS1ml重悬细胞，37'C，15min。1500rpm，5min,弃上清。1.7.8封闭5%FCS-PBSlml重悬细胞，室温30min。1500rpm，5min，弃上清。1.7.9—抗孵育每管加入0.5ml以1%BSA-PBS1:500稀释的兔抗仙台病毒抗体，4°C，60min。2000rpm，5min，弃上清。以1柳SA-PBS洗一次。1.7.10二抗孵育每管加入0.5ml以1%BSA-PBS1:500稀释的FITC标记的羊抗兔IgG，4°C，60min。2000rpm，5min，弃上清。以1%BSA-PBS洗一次。1.7.11每管加入0.5mlPBS，吹匀，过滤网，流式上机检测。以阴性管设置阴性门和阳性门的分界线，记录各管的阳性细胞百分数(即各MOIn对应的阳性细胞百分数)。1.7.12以MOIn为横坐标，阳性百分数为纵坐标，根据所建立的数学模型，使用CurveExpert1.3做曲线拟合。2.结果与分析该实验共进行三次，以其中一次为例详细阐述细胞记数为1.0X107孔，则假定IU为2.OX109IU/ml(假定值n，该值理论上可任意设定，但为稀释方便，可取细胞的整数倍)，根据上样体积100ul，做不同稀释度，使M0I。依次为15，10，5，2，1，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1，0.05,同时设一阴性孔，共12孔。流式上机检测时，在通用模板上做两个图，第一个为FSC-SSC散点图，调整FSC，SSC电压，使细胞群位于合适位置，做门P,，圈住目标细胞群。第二张图为FITC荧光值的直方图，让第二张图显示P!门内细胞群showp叩ulation-P"同时设左侧阴性门&右侧阳性门P3。上阴性管，调整相应荧光电压，使阴性细胞峰位于阴性门&内(接近100%)，然后检测各M0I。对应管，记录阳性门P3内阳性百分数(图1)，阴性管的阴性百分比为99.8%,各M0L阳性百分数为(表一)，<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表一各M0L下的细胞阳性百分数使用所建立的数学模型，用CurveExpertL3做曲线拟合(图2)，所得拟合参数。实际的IU为BXr^2.OX109IU/mlX1.09=2.18X109IU/ml。另两次实验结果为2.lX109IU/ml,2.lX109IU/ml综上所述，三次测定结果分别为2.18X109IU/ml，2.lX109IU/ml，2.1X109IU/ml,(2.13±0.05X109IU/ml，CV=2.34%)。病毒感染细胞后孵育时间的确定是一项重要的条件，孵育时间过短，则病毒没有充分在胞质中复制表达，表现在荧光直方图上即用阴性管确定阴性们和阳性门分界线后，各样本的阴性峰和阳性峰不能分布于分界线的两侧(图3)，出现假阴性。如果孵育时间过长，则由于病毒在细胞中的大量复制影响细胞状态，那么在后续的操作过程中被病毒感染的阳性细胞容易破碎丢失，从而影响实验结果。本研究在优化条件时分别在病毒孵育后第一，二，三，四天收集细胞检测，结果表明第一和第二天出现假阴性，第三天检测阴性峰和阳性峰刚好位于分界线两侧，而且在第三天镜检细胞形态完好。因此确定孵育时间为三天。该方法的质控要点主要有两项，第一各MOL对应管的阴性峰和阳性峰应位于由阴性管确定的分界线的两侧；第二；所得到拟和曲线r〉0.999。3.分析与讨论下面将以噬斑法和免疫荧光法检测该传播缺陷型仙台病毒的感染滴度，并将结果与上述新建立的方法做对比。噬斑法检测噬斑法是检测病毒感染滴度的经典方法，其依赖于病毒复制和若干轮的细胞分裂而产生肉眼可见的病毒噬斑，由于该病毒为传播缺陷型，因此用vero细胞和辅助细胞LLC-MK2/F验证能否形成噬斑。Vero细胞无辅助功能，无法形成有感染能力的病毒，理论无法产生噬斑，而LLC-MK2/F能辅助产生有感染能力的病毒，因此理论能产生噬斑。将vero和LLC-MK2/F两种细胞各铺6孔板，待细胞长至单层后，弃培养基，PBS洗两遍。加入200lU预稀释的病毒样品，用病毒稀释液做阴性对照，用标准的无缺陷型仙台病毒做阳性对照，理论上阳性对照在两种细胞都能产生噬斑。37'C孵育lh。孵育过程中，将预热好的2X培养基和l%Agar0se以l:l混合，加入5ng/mlTrypsin，轻轻混匀。孵育完毕后，吸弃残余液体，加入上述制备的混合液lml/孔，室温下凝固后，放入孵箱培养三天。待镜下观察出现细胞病变效应后，甲醛固定，结晶紫染色。结果(图4):无缺陷型仙台病毒在两种细胞均可形成噬斑，阴性对照和传播缺陷型仙台病毒均未形成噬斑。可能是由于辅助细胞辅助效率不高，无法产生大量有感染能力的病毒。由此可见，噬斑法不适合检测此类传播缺陷型病毒。免疫荧光法该缺陷型仙台病毒载体适合用免疫荧光法检测感染滴度，病毒进入一个细胞后，只在该细胞中表达，因此可通过免疫荧光标记，荧光显微镜记数。其具体方法是将该样品稀释5X106倍，每孔上样100ul，培养三天后，用甲醇固定细胞于培养板，一抗孵育(兔抗Sev血清)，FITC标记的羊抗兔二抗标记，荧光显微镜下记数，每个有荧光的细胞代表一个IU，则样品IU浓度4X10X5X106，A为6孔板中各孔有荧光的细胞平均数，以该方法测定3次，结果分别为2.08X109IU/ml，2.4X109IU/ml，1.93X109IU/ml(2.14士0.24X109IU/ml，CV=11.2%)。通过与流式测定结果比较，可见流式测定在精密度上明显优于免疫荧光法，两者优缺点比较如下-一.免疫荧光法将样品稀释5X106倍，采用单点上样，无法避免高倍稀释带来的累计误差，而流式测定釆用多个稀释度，采用曲线拟合，避免了这种不足。二.免疫荧光法肉眼观测记数，客观性差，不同操作者之间变异大，而流式测定借助仪器分析，结果更客观。三.由于被感染的细胞有一定比例由于状态不好，无法支持病毒大量复制，或由于染色原因造成一定比例假阴性。采用免疫荧光法无法避免这种误差，会造成结果偏低，而流式测定的数学模型中引入一项参数A，可将此误差校正，而结果判定由B决定，因此避免了对结果的干扰。四.病毒感染细胞后到染色之前需培养三天，在此过程中一小部分细胞(包括感染细胞和非感染细胞)会分裂，免疫荧光法中镜下观察常见两个荧光细胞连在一起的现象(图5)，很难区别是一个阳性细胞分裂为两个还是两个单独的阳性细胞(实际操作中若两细胞间隔大于一个细胞判为两个，否则判为一个)，给结果判定带来误差，而流式测定是记数阳性比(细胞分裂前后，阳性比不会改变)，则回避了细胞分裂带来的误差。权利要求1.一种应用流式细胞术检测病毒载体类基因治疗药物感染滴度的方法，其特征在于建立了模拟病毒感染细胞特点的数学模型和相应的结果计算方法，具体步骤为1)根据泊松分布原理，在某一MOI(multiplicityofinfection，即病毒和细胞数量比值)下，细胞被感染的阳性百分数为％INF＝100×(1-e-MOI)；2)设病毒样品中实际的感染滴度为m，实验前由于m未知，假定其滴度为n，m＝B×n，根据血球记数仪得到的细胞总数，结合假定值n将样品做成不同稀释度，即得到不同的MOIn，由于m＝B×n，则MOI＝B×MOIn，将其代入上式，同时被感染的细胞中有一定比例由于状态不好，不能表达大量病毒蛋白，或由于染色时不均一产生假阴性，需引入一个参数A，即，此即为确定的数学模型；3)结果计算方法通过曲线拟和得到B值，那么实际的病毒感染滴度m＝B×n。2.—种应用流式细胞术检测病毒载体类基因治疗药物感染滴度的方法，其特征在于建立了相应的技术方案，具体步骤为1)试验前细胞铺六孔板，2ml完全培养基/孔，置37'C，5%的0)2培养箱培养至细胞长满；(2)上样病毒前首先选择一孔，将细胞消化后用血球记数仪记数。结合细胞总数，假定值n，病毒上样体积(lOOul)，将样品用稀释液做不同稀释度，得到不同的MOIn;(3)病毒上样，每个MOL对应一个孔，上样体积为lOOul，同时设一阴性孔，力卩lOOixl样品稀释液。摇匀，使病毒液均匀铺在细胞上，置37°C，5%的0)2培养箱培养1小时，每隔15分钟摇板一次；(4)吸去病毒上清，加入PBS(lml/孔)洗一遍，吸干PBS。加入2ml的基础培养基，37°C，5%的0)2培养箱培养；(5)吸去培养基，加入PBS(lml/孔)洗一遍，吸干PBS。加入0.5ml/孔0.25%trypsin-Versene,37"C，3min，加入0.5ml完全培养基/孔，吹匀转入流式管，1000rpm，5min，弃上清；(6)固定lml固定液重悬细胞充分混匀，4°C，30min。1500rpm，5rain，弃上清；(7)渗透化lml渗透化液重悬细胞，37°C，15min。1500rpm，5min，弃上清；(8)封闭lml封闭液重悬细胞，室温30min。1500rpm，5min，弃上清；(9)一抗孵育每管加入O.5ml以抗体稀释液l:500稀释的一抗，4'C，60min。2000rpm，5min，弃上清。以抗体稀释液洗一次；(10)二抗孵育每管加入0.5ml以抗体稀释液1:500稀释的FITC标记的二抗，4°C，60min。2000rpm，5min，弃上清。以抗体稀释液洗一次；(11)每管加入0.5mlPBS，吹匀，过滤网，流式上机检测。以阴性管设置阴性门和阳性门的分界线，记录各管的阳性细胞百分数(即各MOIn对应的阳性细胞百分数)。3.按照权利要求2所述的技术方案，所选用的病毒样品稀释液，抗体稀释液和洗液为濕SA—PBS。4.按照权利要求2所述的技术方案，所选用的固定液为4%多聚甲醛，固定方法为先用750U1PBS重悬细胞，置震荡器上缓慢加入250nl16%多聚甲醛。5.按照权利要求2所述的技术方案，所选用的渗透化液为0.l%TritonX-100~PBS。6.按照权利要求2所述的技术方案，所选用的封闭液为5WFCS-PBS。7.按照权利要求1和权利要求2所述的应用流式细胞术检测病毒载体类基因治疗药物感染滴度的方法，其特征为所述的病毒载体类基因治疗药物为适合该数学模型的所有病毒载体，如传播缺陷型仙台病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体。8.—种应用流式细胞术检测病毒载体类基因治疗药物感染滴度的方法，其特征在于建立了相应的方法质控指标，即第一各MOIn对应管的阴性峰和阳性峰应位于由阴性管确定的分界线的两侧；第二；所得到拟和曲线r〉0.999。全文摘要本发明公开了一种流式细胞术检测病毒载体类基因治疗药物感染滴度的方法。首先建立了模拟病毒感染细胞特点的基于泊松分布的数学模型，并且确定了相应计算方法。具体实施步骤为细胞铺六孔板，待细胞长满后选择一孔计数，病毒感染细胞，培养一定时间后消化，收集细胞，将收集的细胞依次固定，渗透化，封闭，一抗孵育，FITC标记的二抗孵育，用流式细胞仪检测，将所得结果根据所建立的数学模型做曲线拟合，结果判定。将该方法与传统方法如噬斑法，免疫荧光法做对比，证实该方法更准确，精密度高，而且不受细胞状态和病毒感染细胞后培养过程中细胞分裂的影响。该方法的建立对于此类产品的质量控制和临床应用有重要意义。文档编号G01N33/48GK101387636SQ200810147329公开日2009年3月18日申请日期2008年8月7日优先权日2008年8月7日发明者付志浩,李永红,王军志,饶春明,凯高申请人:中国药品生物制品检定所