专利名称：可静脉给药的肝肿瘤基因治疗系统的构建方法及应用的制作方法
可静脉给药的肝肿瘤基因治疗系统的构建方法及应用本发明属于生物技术发明领域。本发明描述了一种应用于肿瘤的基因治疗的方 法。该基因药物以血清型8型的腺相关病毒(AAV8)为载体，携带了受microRNA靶序列调控 的杀伤性治疗基因。该基因药物治疗肝脏肿瘤的原理是，利用肿瘤细胞的内源性microRNA 来调控由该基因药物携带的杀伤性治疗基因(外源基因，如自杀基因TK基因等)的表达， 即利用肿瘤细胞的内源性microRNA来调控外源由AAV8导入的杀伤性治疗基因的表达。在 非癌组织和细胞内，因内源性microRNA调控，细胞不表达该杀伤性治疗基因。当该杀伤性 治疗基因为TK基因时，TK基因的表达产物能将与其相对应的化学药物底物作用成为对肝 癌细胞有杀伤作用的药物，进而造成肝癌组织、细胞的被杀伤；而非癌组织和非癌细胞因为 不表达该杀伤性治疗基因，所以不会被杀伤，从而保护了非癌组织和非癌细胞。这样，该基 因药物就可以经外周静脉内给药，该药物也能靶向性地到达肝脏内的肝癌组织、细胞内，且 在肝癌组织内表达杀伤性治疗基因，从而最终达到系统性治疗肝癌的作用。背景基因治疗是指利用基因分子生物学和细胞学技术，将外源基因转移到体内，通过 导入基因的作用来纠正体内某些基因结构变异或表达异常，从而达到治疗目的的一种方法。肿瘤的基因治疗可利用肿瘤细胞与正常细胞分子水平的差异，高效选择性杀伤肿 瘤细胞或抑制肿瘤细胞的生长。该方法是肿瘤治疗除外科手术、放疗、化疗外的一种新的治 疗模式。肝细胞癌(HCC)是严重危害人类生命健康的重大疾病之一。传统的外科切除和新 兴的微创外科处理是目前主要的治疗手段。但是肿瘤体积过大与位置不佳、肝功能贮备差 或门脉高压常常限制了外科治疗的适应症，而术后高复发率则往往导致成功的手术前功尽 弃。由于供体器官的短缺，肝移植不可能被普遍施行，受益者非常有限。肝癌对化疗又不敏 感或容易产生赖药性。因此，原发性肝细胞癌(HCC)综合治疗方案仍然需要补充新疗法，其 中基因治疗是有前途的研究方向。各种抗肿瘤基因，如抗肿瘤血管生成基因、杀伤性治疗基因、自杀基因、抑癌基因 和免疫调节基因等已被用于肝癌的基因治疗，并取得了令人鼓舞的治疗效果。但是，目前大 多数的肝癌基因治疗仍然处于实验阶段，有以下几个关键性的问题需要更深入地研究1)肿瘤靶向性的问题目前肿瘤基因治疗的发展方向是提高治疗基因对靶细胞 的特异性，尤其是在使用肿瘤杀伤性治疗基因的基因疗法，要求目的基因选择性表达在肿 瘤细胞内，方能准确地杀伤肿瘤细胞，保护正常组织，减少毒副作用。2)肝脏靶向性的问题静脉内注射是最方便的外源基因导入途径，但多数载体具 有广泛宿主范围组织或细胞特异性缺乏，难以专一靶向至肝脏；因此，多采用瘤体内注射、 经肝动脉注射、经门静脉注射等方法，给临床应用带来不便，且全身副反应较大。3)治疗基因的长期表达和调控的问题肝癌易于复发的特性严重影响了现有治 疗手段对肝癌的疗效及预后。因此，肝癌基因治疗应以防止复发(或再生)与转移为目标， 在综合治疗中发挥独特作用。这需要长期表达治疗基因，并且最好能进行调控。
4)机体针对病毒载体免疫反应的问题如人群中存在的病毒衣壳的中和抗体可 能会导致基因治疗的失败。miRNA是一类长度约18 25个核苷酸左右的内源性非编码的单链小分子RNA，能 够通过与靶mRNA的3 ‘ UTR特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对 基因进行转录后表达的调控。miRNA在进化上高度保守。miRNA由基因组DNA编码，在RNA聚合酶II的作用下被 转录产生。这些miRNA通过RNA诱导的沉默复合体(RNA_inducedsilencing complex,RISC) 靶向到达mRNA，进而产生miRNA阻遏翻译或引导miRNA对mRNA进行酶切的功能。miRNA具 有转录后基因调控功能，从而控制基因表达及细胞发育、分化、增殖和凋亡等。有研究人员 发现线虫体内的异时性基因lin-4编码的miRNA与lin-14反义互补。据估计，脊椎动物 基因组编码多达1000种不同的miRNA，研究人员推测，这些miRNA可能调控至少30%的基 因的表达。尽管研究人员目前已在人体内发现超过700多种miRNA，但仍需进一步研究以 了解这些分子的确切的细胞学功能，及其在疾病发生中所扮演的角色。有研究报道，miRNA 具有肿瘤抑制因子及癌基因的作用。那些在癌症发生和发展中发挥作用的miRNA被称作 oncogenic miRNA，即oncomiR。oncomiR的失调与基因突变或表观遗传变异有关，这些变异 包括缺失突变、扩增突变、点突变及DNA异常甲基化等。Lu等人采用串珠流式细胞miRNA表达谱分析技术对来自人恶性肿瘤组织的miRNA 进行系统表达分析，其中包括结肠癌、肝癌、胰腺癌和胃癌。miRNA表达谱成功对低分化肿瘤 进行了分类。研究揭示了 miRNA表达水平在癌症诊断中的重要作用[Lu J，Getz G，Miska EA，et al. (2005). Nature. 435，834-838]。Bottoni 等人则采用芯片技术及 RT-PCR 分析了 垂体腺瘤和正常垂体样本中的全部miRNA，结果发现miRNA表达水平可以区分垂体微腺瘤 和垂体巨腺瘤，还有一些miRNA参与细胞增殖与凋亡的过程。miRNA可以作为有效的诊断 标志，提高对垂体腺瘤的分类水平[Bottoni A, Zatelli MC, Ferracin M, et al. (2007). J Cell Physiol. 210,370-377. ]。Lee 等人采用原位 RT-PCR 技术，经分析发现 miR221、 miR301和miR376a的异常表达只在胰腺癌细胞中出现，而没有在良性胰腺肿瘤及正常间质 和导管处出现。miRNA的异常表达可以作为胰腺肿瘤发生的研究线索，同时也可能为胰腺癌 诊断提供新的生物学标志[Lee EJ, Gusev Y，Jiang J，et al. (2007). Int J Cancer. 120， 1046-1054.]。microRNA在癌症预后判断中的作用Takamizawa等人报道指出，let_7miRNA的 表达往往在人肺癌中缺失，而let-7miRNA表达的减少与术后生存期的减短显著相关。此 外，let-7miRNA在A549肺腺癌细胞株中的过表达可在体外抑制肺癌细胞的生长。他们的 研究结果表明了 let_7miRNA表达水平的改变具有潜在临床和生物学作用[Takamizawa J， Konishi H,Yanagisawa K, et al. (2004). Cancer Res. 64，3753-3756. ]。Yanaihara 等人的 研究可以区分肺癌组织和非恶性肿瘤组织的miRNA表达模式。前体miRNA hsa-miR155的 高表达和hSa-let-7a-2的低表达与肺腺癌的低生存率相关。他们的研究表明，miRNA不仅 可以作为肺癌的诊断学标志，还可以作为预后预测的标志[Yanaihara N, Caplen N, Bowman Ε, et al. (2006). CancerCell. 9，189-198]。Roldo 等人则发现，miR21 在胰腺肿瘤中的过 表达与高Ki67增殖指数及出现肝转移高度相关。他们的研究结果表明，miRNA表达水平 的改变与恶性肿瘤的进展状态相关[Roldo C，Missiaglia E，Hagan JP, et al. (2006).J ClinOncol. 24,4677-4684.]。此外，Bloomston等人将胰腺癌细胞中的miRNA的表达水 平与正常胰腺和慢性胰腺炎组织细胞的miRNA进行比较，结果发现，胰腺癌细胞中miRNA 表达水平与后两者不同，可以有效区分开来。miR196a-2的高表达可以用于预测不良预后 [Bloomston M, Frankel WL, Petrocca F, et al. (2007) · JAMA.四7，1901-1908.]。某些miRNA表达状态受到癌细胞中表观遗传学改变的控制，比如DNA甲基化和组 蛋白修饰。采用染色质修饰药物激活肿瘤抑制性miRNA可以靶向调节癌基因，这一策略也 许能在不久的将来成为癌症的新型治疗方法。miRNA可以与基因组学、蛋白质组学中的生物 学标志相结合，成为癌症诊断和判断预后的参考指标[Cho WC. (2007). Mol Cancer. 6, 25.； Cho WC, Cheng CH. (2007). Expert Rev Proteomics. 4，401-410.]。尽管每个 miRNA 可以 调控成百个靶向基因，但在癌症研究中鉴别出miRNA的准确靶点仍然是一大难题。此外， 由于干细胞可以分化发育成为多种类型的细胞，因而成为研究者们瞩目的焦点。已有研究 指出miRNA通路在干细胞分化中起调控作用，而其机制是否可用于癌症的预防与治疗还需 要进一步石if究[Cho WC. Afuture of cancer prevention and cures :highlights of the Centennial Meeting of theAmerican Association for Cancer Research. (2007). Ann Oncol. ]。miRNA在多种病理过程中的功能的发现，使得对疾病进行分子水平的诊断和预后 预测成为可能，对于癌症尤其如此。Andrew Fire和Craig Mello因发现RNA干扰现象——双链RNA诱导的基因沉默 而获2006年度诺贝尔奖。自从在一些生物体内发现相互作用的反义RNA具有调控功能以 来，转录后的基因调节便跻身于主要基因调控机制的行列。miRNA通过碱基互补诱导RNA 干扰路径，从而抑制靶向mRNA。数以百计的miRNA的发现使我们对于RNA干扰现象在生物 医学上的意义有了全新的认识。研究者的目光开始集中于利用反义寡核苷酸抑制miRNA功 能，或者采用小干扰RNA类技术研究miRNA。科学家们致力于揭开miRNA生物学的神秘面 纱，挖掘其在疾病治疗方面的应用潜力。对患者进行的有关oncomiR的大型高通量研究，可 以对癌症进行新的分类，并对患者预后做出更为准确的预测。miR-122为肝脏特异性表达的microRNA，占已发现的肝脏所有microRNA表达量 的72%，具有调节肝脏脂类代谢的功能。研究表明，与正常肝脏相比约70%的肝细胞癌和 各种肝癌细胞系的miR-122表达明显下降。由于正常细胞和肝癌细胞miR-122表达的差 异，提示miR-122可以作为肝癌基因治疗的很好的靶点。[Lagos-Quintana M，Rauhut R， et al. (2002). “ Identification of tissue-specificmicroRNAs from mouse. " . Curr Bio/12 (9) :735-9οSempere LF,Freemantle S,etal. (2004). " Expression profiling of mammalian microRNAs uncovers a subset ofbrain-expressed microRNAs with possible roles in murine and human neuronaldifferentiation. " . Genome Bio/5 (3) :R13。Esau C,Davis S,et al. (2006). " miR_122regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. " . Cell Metab3(2) :87-98.]miR-133在人类的肌肉组织细胞中特异性地高表达，而在非肌肉组织细胞中的 表达受到抑制。在人类的基因组中，常见三种miR-133亚型，miR-133a-l、miR-133a-2、 miR-133b。这三种miR-133亚型分别被发现于人的第18、20、6条染色体。[lvey KN, Muth A, Arnold J, et al(March 2008). “ MicroRNA regulation ofcell lineages in mouse and human embryonic stem cells" . Cell Stem Cell 2(3) :219-29.]
TK基因，是单纯疱疹病毒(HSV病毒)基因组中的TK基因，是一种“自杀基因”，也 称药物敏感基因。此基因与丙氧鸟苷(GCV)可构成一个系统，称为单纯疱疹病毒胸腺嘧啶 激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)系统。该系统原理是单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶将无毒性 的药物前体(丙氧鸟苷)转变为毒性物质，从而发挥杀细胞作用。TK作为治疗基因，需要 表达成胸腺嘧啶激酶，该酶作用前药GCV能发挥治疗作用，停用CGV则可以终止治疗。这 个系统对肝癌的作用机制即是这种病毒介导的酶与前体药物治疗，这些基因编码的特异 性酶可以将无毒性的药物前体转变为毒性物质，从而达到治疗肝癌的目的。单纯疱疹病 毒胸腺嘧啶激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)系统不仅可以杀死转染了 HSV-TK基因的肝癌 细胞，还可通过旁观者效应杀死周围未转染的肝癌细胞。停用GCV后，不产生杀伤作用。 [Brown DG, Visse R， et al. (October 1995). “ Crystal structures of the thymidine kinase fromherpes simplex virus type-1 in complex with deoxythymidine and ganciclovir" .Nat. Struct. Biol. 2 (10) :876-81.]CAG启动子序列中包含了巨细胞病毒的增强子和鸡的β-肌动蛋白内含 子。该启动子可使外源基因在肝脏中能长期稳定地表达。Bhiratori Y. Kmai F， et al. (1998May) ·，，Gene therapy for hepatic micrometastasis of murine colon carcinoma. ” ； JHepato 1. 28(5) :886-95.]病毒载体的导入途径包括外周静脉内注射、门静脉注射、瘤体内注射、肝动脉内注 射、脾内注射、胆管内导入等。外周静脉内注射是最有效、方便及具有良好依从性的系统给 药方式。利用AAV8载体外周静脉注射易于富集于肝脏，我们设计由外周静脉给药途径将治 疗基因导入肝脏。腺相关病毒(AAV)为目前肿瘤基因治疗理想的载体之一。主要优点包括几乎不 引起人类疾病、定点整合避免随机整合造成宿主细胞突变的危险、免疫原性低、能转导分裂 细胞和非分裂细胞、具有广泛的趋向性、携带的外源基因可长期稳定表达。AAV2是最广泛 使用的载体，可转染神经、肌肉、肝脏、肺以及其他组织，但转导肝脏的效率较低难以满足需 要，而新近发现的AAV8载体静脉注射易富集于肝脏，其转导肝脏的效率比AAV2高10 100 倍。此外，与AAV2的人群中抗体阳性率达30 80%相比，人群中抗AAV8抗体阳性率只有 6%，从而极大降低了由于机体针对AAV载体的先存免疫所导致的治疗失败。多个研究报告 证实AAV8是有潜力的高效感染肝脏的基因治疗载体。腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)因在腺病毒制品中发现而得名。腺 伴随病毒(adeno-associated virus, AAV)是微小病毒科(parvovirus)成员，其基因组为 4682个核苷酸组成的单链DNA。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒或单纯疱疹病 毒，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组 将整合到细胞染色体中成为潜伏状态，而不产生子代病毒。最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV(AAV2)。AAV2基因组长约4. 71Λ，基因 组两端为长度I^bp的“反向末端重复序列”(ITR)，呈回纹-发卡结构。基因组中有两个 大开放阅读框(ORF)，分别编码r印和cap基因。AAV-2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质 粒中。其中含有2个各145bp长的倒转末端重复序列(Inverted terminal repeat, ITR) 它们是AAV基因组的复制起点，并与AAV复制、整合或包装等功能有关。其基因组其余部分 可分为2个功能区，r印基因区和cap基因区。R印蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。腺相关病毒(AAV)能以较高滴度感染多种包括人在内的哺乳动物细胞或组织 (Kotin, R. M. ， et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2211-2215,1990) (Samulski, R. J.， et al. , EMBO J. 10 :3941_3950，1991)，从而既实现了治疗基因的长期稳定表达，又降低了 随机插入带来的使染色体基因突变的风险。而且，AAV至今未发现与任何人类疾病相关，也 未发现任何由于整合而引起的生物性状的改变，因此安全性明显好于逆转录病毒载体和腺 病毒载体，后者分别于人类的癌症和呼吸道疾病相关。目前通用的AAV病毒载体都是基于 血清型2，即AAV2，对它的研究已有近30年的历史。实验证明重组AAV2(rAAV2)在多种组 织中都是很好的基因转移载体(Monahan，P and R. Samulski, 2000, Gene Ther. 7 :24-30)， 但随着其体内实验的增加，rAAV2载体的局限也越来越明显(Bartlett，J. S.，R. Wilcher, and R. J. Samulski. 2000. J. Virol. 74 :2777-2785. ) (Davidson, B. ， C. Stein, J. Heth, et al. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 :3428-3432.) :AAV2 在某些组织中感染效率很高， 而在另一些组织中的感染效率却很低；另外，人体对AAV的感染会产生中和抗体，在正常人 群中有85%存在针对各种AAV、主要是针对AAV2的抗体。近几年人们将目光集中在对各 种血清型的AAV病毒载体的组织特异性的研究上，利用AAV各血清型的天然感染特性，可 以获得对各种组织具有不同转导效率的AAV病毒载体。(Chao，H.，Y. Liu, J. Rabinowitz, C. Li, R. J. Samulski, et al. 2000. Mol. Ther. 2 :619-623.) (Chiorini, J.，L. Yang, Y. Liu, B.Safer, and R. Kotin. 1999. J. Virol. 73 1309-1319.)(Chiorini, J. A. , B. Zimmermann, L. Yang, R. et al. 1998. Mol. Cell. Biol. 18 :5921-5929.)AAV病毒及基因组结构AAV病毒是一类体积小、无包膜的病毒，内含单链DNA，其 中正链和负链的数量基本相等。AAV病毒属于微小病毒属(Parvoviridae)，它的复制需要 辅助病毒的存在。(Kotin，RM. 1994. Hum. Gene Ther. 5 :793-801)目前文献报道的灵长类 AAV 病毒有六种血清型，分别被命名为 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6。(Baclunann PA, MD. Hoggan, JL. Melnick,1975, Parvoviridae, Intervirology 5 :83-92)(Bantel-Schaal U. , and H. zur Hausen. 1998. Virology 134 :52-63)(Rutledge. EA. , CL.Halbert, and DW. Russell. 1998. J. Virol. 72 :309-319)到目前为止，AAV1、2、3、4、5、6 的全序列都已经清 楚,各种血清型基因组的同源性在52-82%之间。(BanteUchaal U. ,and H. zur Hausen. J.Virol. 1999,73:939-947)各种天然血清型AAV病毒的同源性比较文献报道的灵长类AAV病毒共有六种血清型，分别被命名为血清型1、2、3、4、5、6， 其后，又增加了血清型7、8。其中只有AAV5最初是从人体中分离出来的(Bantel-khaal， and H. zur Hausen. 1984. Virology 134 :52-6 ，其余 5 种血清型的 AAV 病毒都是在 石if究腺病毒时发现的(Ursula Bantel-Schaal, Hajo Deliusand Harald zur Hausen. J.Virol. 1999,73 :939-947)。到目前为止，全部6种血清型的AAV病毒的全序列都已经 清楚，(John Chiorini, Frank Kim, Linda Yang, andRobert Kotin. J. Virol. 1999,73 1309-1319)，除AAV5外，AAV1、2、3、4、6血清型基因组的同源性普遍较高，特别是ITR和R印 区域，其中Rep在AAV1、2、3、4、6中的同源性高达89-93%，因此AAV1、2、3、4、6血清型之间 R印可以识别来自另一血清型的ITR，并支持其包装。(Chiorini J,L. Yang, Y. Liu, B. Safer, and M. Kotin. 1997. J. Virol. 71 :6823-6833) (Muramatsu, S. ， H. Mizukami, N. Young, andK. Brown. 1996. Virology 221 :208-217)。而 AAV5 与其它 AAV 血清型的 Rep 的同源性只有 67% (U rsula Bantel-Schaal, Hajo Delius and Harald zurHausen. J. Virol. 1999,73 939-947)(John Chiorini, Frank Kim, Linda Yang, andRobert Kotin. J. Virol. 1999,73 1309-1319)，因此AAV5的R印不能识别其它血清型AAV的ITR。AAV病毒的细胞受体与R印相比，AAV各血清型的Cap的同源性较低，AAVU AAV2、AAV3、AAV5、AAV4、 AAV6的Cap的氨基酸同源性在45 80%之间，其中AAVl与AAV6之间的同源性最高，AAV5 与其它血清型的 Cap 的同源性最低。(UrsulaBanteUchaal，Hajo Delius and Harald zur Hausen. J.Virol. 1999,73 :939-947)。这是各血清型具有不同宿主范围和细胞特异性 的基础。AAV病毒的宿主范围和细胞特异性是由其感染的细胞上相应受体的种类和多少决 定的。目前受体研究较清楚的是AAV2、AAV3、AAV4、AAV5等血清型。AAV2、AAV3血清型的 细胞受体是硫酸肝素糖蛋白O^paran sulfate proteoglycan)，其受体结合位点位于AAV2 的VP3蛋白上。其共受体(corec印tor，功能是帮助AAV病毒进入细胞)是人成纤维生长因 子受体 1 (fibroblast growth factor receptor 1)禾口整合素 ανβ5。 (Qing，K. ，C. Mah, J. Hansen, S.Zhou, V.Dwarki, and A. Srivastava. 1999. Nat. Med. 5 :71-77) (Summerford, C.，J. S. Bartlett,and R. J. Samulski. 1999. Nat. Med. 5 :78-82)。AAV4、AAV5 的细胞受体是 唾液酸(sialic acid) (Walters Rff, Yi SM, Keshavjee S, Brown KE, et al. J Biol Chem 2001，276 :20610-6)，没有硫酸肝素结合位点，因此AAV5的细胞特异性与AAV2等有很大区 别，尤其表现在AAV5在动物和人的神经系统和呼吸道上皮的感染效率比AAV2高得多(AAV4 不感染呼吸道上皮)。AAV7和AAV8是美国宾西法尼亚大学James M. Wilson实验室的高光坪博士首次 报道的(11854-11859_PNAS_S印tember 3，2002_vol. 99_no. 18)。作者在该论文中强调了 AAV7和AAV8作为载体将在基因治疗中具有价值。有趣的是，这两种病毒的基因和序列并不 是通过传统的病毒分离方法获得病毒得到的，而是依据已经发现的各种AAV病毒序列的同 源性设计引物采用PCR方法从恒河猴组织中扩增出来的。AAV7和AAV8的全长序列登录在 GenBank(accession numbers :AAV7，AF513851 ；and AAV8,AF513852)中。随着对 AAV2/8 载 体的研究和应用的深入，科学家们发现AAV2/8载体在肝脏、肌肉、视网膜、神经系统、胰腺 等组织中都具有良好的组织嗜性和转导效率。尤其是发现随着剂量的增大，AAV2/8载体能 够转染几乎100%的肝细胞。AAV8载体的这些特点使得它具有广泛的应用潜力。发明_既述本发明要解决的关键问题是提供一种可由外周静脉给药的杀伤性治疗基因治疗 系统用于治疗肝细胞癌和肝转移癌。我们选择TK基因作为其中一种备选的治疗基因，其表达产物胸腺嘧啶激酶联合 丙氧鸟苷可以杀死转染了 TK基因的肿瘤细胞。通过停用GCV，可以停止基因治疗，从而达到 有效控制基因治疗。本发明中，利用了细胞中相对应的内源性miRNAGn :miR-122、miR-133)可以与导 入DNA的mirT (如miR-122T、miR-133T)结合，即与导入的AAV8中的mirT结合。MmirT 又进一步调节TK基因的表达。发明详述
8中，利用了细胞中相对应的内源性miRNAGn :miR-122、miR-133)可以与导 入DNA中所编码的mirT (如miR-122T、miR_133T)结合，即与导入的AAV8中的mirT结合。 而mirT又与miRNA相互作用，进一步调节TK基因(及其他杀伤性治疗基因)的表达。TK 基因的表达产物胸腺嘧啶激酶将无毒性的前体药物丙氧鸟苷(GCV)转化为对细胞有毒性 的药物，进而可以杀死转染了 TK基因的肿瘤细胞。通过停用GCV，可以停止基因治疗，从而 达到有效控制基因治疗。为了解决可由外周静脉系统给药、对肝细胞癌和肝转移癌的靶向 性治疗，我们还使用了系统给药时主要感染肝脏的AAV8，并在AAV8所包装的治疗基因表达 单元中使用CAG启动子。具体详述如下。肝脏和肝癌导向性和特异性主要通过AAV8载体层面和miR调节层面等2个层面 来设计解决。在肝癌组织与非肝癌组织、肌肉组织等选择性表达TK基因的层面上，我们设 计了导入DNA的mirT (如miR-122T、miR_133T)。为了能在肝癌组织里高表达TK基因，我 们使用CAG启动子，该启动子能解决CMV启动子在肝癌组织里产生基因沉默的问题。为解决特异性杀伤肿瘤而避免肝毒性的问题，我们利用肝细胞癌和肝脏转移癌低 表达或不表达miR-122，而正常肝细胞高表达miR-122的特点，通过在TK基因的3’ UTR引 入miR-122的靶序列(mirT)。正常肝脏高表达的miR-122与miR-122的靶序列特异性结 合，即正常肝细胞中的miR-122将会与位于TK基因的3’UTR的miR-122的靶序列特异性结 合，从而抑制自杀基因(TK基因)的表达，这样就可以避免正常肝细胞被杀伤。而在肝细胞 癌和肝脏转移癌等肝癌组织、肿瘤细胞中，miR-122是低表达或不表达的，不能对自杀基因 产生抑制作用，即，位于TK基因的3’ UTR的miR-122的靶序列就不会起作用，因而受其调 控的下游的TK基因就会得到表达，从而达到特异性杀伤肝癌肿瘤细胞的作用。这样就能实 现特异性杀伤肿瘤且避免肝毒性。本研究利用miR-122调控自杀基因的表达，可能提高肝 癌基因治疗的靶向性、高效性和安全性，从而为原发性肝细胞癌的综合治疗方案补充新疗 法，并可能为预防肝癌的复发提供了有效办法。此外，利用其它组织特异性microRNA调控 可以抑制自杀基因在特定组织的表达，避免治疗系统的副作用。比如在自杀性治疗基因的 3’UTR引入肌肉组织特异性表达的miR-133的靶序列，抑制自杀基因在肌肉的表达，避免损 伤肌肉组织。为解决由外周静脉给药将治疗基因导入肝脏的问题，我们选用了 AAV8作为载体。 AAV8载体外周静脉注射易于富集于肝脏。AAV8系统给药主要感染肝脏，但也感染其他器官，主要是肌肉组织，造成肌肉组织 损伤的副作用，我们选用组织特异性的microRNA抑制TK基因在特定组织的表达。如在TK 基因的3’ UTR引入肌肉特异性miR-133的靶序列(miR_133T)，从而避免TK基因转染肌肉 造成副作用。运用本发明的原理，也可以采用除TK基因以外的其它杀伤性治疗基因来做为治 疗基因，如FASL基因、TNF-α基因、TRAIL基因、金黄色葡萄球菌外毒素、p53基因等可以 导致肿瘤细胞被杀伤的其它基因，这些基因可替代TK基因做为治疗基因，即在重组AAV8病 毒(rAAV8-TK-miR-122T)的治疗基因(TK基因)的位置使用上述FASL基因、TNF-α基因、 TRAIL基因、金黄色葡萄球菌外毒素、ρ53基因等。概括表述本发明中的核心内容是一种可由外周静脉给药、用于治疗肝细胞癌和 肝转移癌的、使用杀伤性治疗基因的重组病毒系统的构建方法及其应用，该系统中的重组AAV的结构是“rsCAAV8-治疗基因-miRNA调控靶序列”。该系统中的重组AAV的结构中， 治疗基因是TK基因，也可以是除TK基因以外的其它基因来做为治疗基因，如FASL基因、 TNF-α基因、TRAIL基因、金黄色葡萄球菌外毒素、p53基因等；miRNA调控靶序列可以有 两种模式miR-122T单调控模式和miR-122T和miR_133T共同调控模式。该系统的构建和应用包括以下步骤或环节1、构建含miR-122和/或miR-133靶序列的HSV-TK自杀基因重组质粒 pscAAV-TK-miR-122T、pscAAV-TK-miR-122T-miR-133T 和不含 miR-122 和 miR-133 靶序列 的对照质粒以及EGFP、Firefly Luciferase(Luc)的报告基因质粒。2、体外研究microRNA对报告基因和自杀基因的调控作用。3、动物体内研究microRNA对报告基因和自杀基因的调控作用。4、重组AAV8病毒rAAV8-TK_miR-122T和对照重组病毒以及重组报告基因病毒的 包装和制备。5、动物实验研究，上述重组AAV8病毒rAAV8-TK_miR-122T和对照重组病毒以及重 组报告基因病毒的使用中，使用GCV对肝癌动物模型的作用。6、构建含miR-122和miR-133靶序列的TK自杀基因重组质粒载体 pscAAV-TK-miR-122T-miR-133T。为后续的工作打基础。
图1构建含miR-122的EGFP、Luc告基因的质粒和TK自杀基因的重组质粒的 表达单元的结构示意图。见实施例1。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序 列；CAG promoter是CAG启动子，其序列中包含了巨细胞病毒的增强子和鸡的β -肌动 蛋白内含子；PolyA是多聚腺嘌呤加尾信号序列；Iuc是荧光素酶基因；miR-122targetS 是4个mirl22靶序列定向串联后得到的序列，图中标示为紧邻的4个miR122T。图1 的 B、D、F 分别为pscAAV2-EGFP、pscAAV2_Luc 和 pscAAV2_TK。图 1 的 A、C、L· 分别为 pscAAV2-EGFP-miR-122T、pscAAV2-Luc_miR-122T 和 pscAAV-TK_miR-122T。图aiiiR-122对报告基因的调控的体外研究。见实施例2。图中显示，与对照组相 比，在表达miR-122的Huh7细胞中，pscAAV2-EGFP_miR-122T质粒转染组的EGFP表达明显 抑制；而在不表达miR-122的Hela细胞中，pscAAV2-EGFP-miR-122T质粒转染组的EGFP表 达无变化。图3miR-122对报告基因的调控的体外研究。见实施例2。图中显示，因miR-122T的 作用的影响，在表达miR-122的Huh7细胞Luc的活性被抑制达4. 5倍，而在不表达miR-122 的Hela细胞则无抑制。图細11 -122调控抑制自杀基因对细胞的杀伤的体外研究。见实施例3。图中显 示，与对照相比，转染pscAAV2-TK-miR-122T的Huh7细胞存活率明显增高，Hela细胞实验 组与对照组无差异。图5小鼠肝脏内miR-122调控Luc基因的表达。见实施例4。图中显示，在小鼠肝 脏内，因miR-122调控作用，与对照组相比，pscAAV2-Luc-miR-122T组的Luc基因的表达被 抑制了四倍。图6利用miR-122调控避免自杀基因对小鼠正常肝脏的杀伤。见实施例5。图中 显示，pscAAV2-TK组出现明显肝脏损伤，ALT明显升高，在注射后6、10和14天，分别升高5. 9,27. 1和26. 6倍。而pscAAV2-TK-miR-122T组与生理盐水对照组相比，未发现异常。图7利用miR-122调控避免自杀基因对小鼠正常肝脏的杀伤。见实施例5。图中 显示，pscAAV2-TK组出现明显肝脏损伤，连续14天检测小鼠体重，体重明显下降，并且出现 1只小鼠死亡。而pscAAV2-TK-miR-122T组与生理盐水对照组相比，未发现异常。图8利用miR-122调控避免自杀基因对小鼠正常肝脏的杀伤。见实施例5。图中 显示，pscAAV2-TK组出现明显肝脏损伤，肝脏病理切片显示细胞水肿、坏死和炎症细胞浸 润。而pSCAAV2-TK-miR-122T组与生理盐水对照组相比，未发现异常。图9重组病毒rscAAV8-TK-miR-122T对小鼠肝癌模型的治疗作用和安全性。见实 施例7。结果显示，rscAAV8-TK-miR-122T明显抑制了肿瘤的生长。图10重组病毒rscAAV8-TK-miR-122T对小鼠肝癌模型的治疗作用和安全性。见 实施例7。结果显示，ALT检测无明显异常，各组间无明显差异。图11重组病毒rscAAV8-TK-miR-122T对小鼠肝癌模型的治疗作用和安全性。见 实施例7。病理结果显示，与对照组相比rscAAV8-TK-miR-122T不损伤正常肝组织图12受miR-122调控的重组病毒rscAAV8-EGFP_miR-122T的报告基因表达的体 外研究。见实施例8。结果显示，与对照组相比，在表达miR-122的Huh7细胞中，实验组 rscAAV8-EGFP-miR-122T的EGFP表达明显受到抑制，而在不表达miR-122的Hela细胞中， 实验组的EGFP表达无变化。图 13pscAAV2-EGFP-miR-122T 的质粒图谱。见实施例 1。图 14pscAAV2-Luc-miR_122T 的质粒图谱。见实施例 1。图15pscAAV-TK-miR_122T的质粒图谱。见实施例1。图 16pscAAV-TK-miR-122T-miR-133T 的质粒图谱。见实施例 9。以下实施例对本发明作了详细说明，但并不意味着限制本发明的内容。实施例1构建含miR-122的EGFP、Luc等报告基因的质粒和TK自杀基因的重组 质粒将EGFP、Luc和TK基因分别插入自身互补型AAV载体pscAAV2的多克隆位点Nhe I禾口 Kpn I中，获得重组质粒pscAAV2-EGFP、pscAAV2_Luc和pscAAV2_TK，这3种重组质粒 所插入的EGFP、Luc和TK等基因所构成的基因表达单元的结构示意图见附图1的B、D、F。合成两端含有EcoR I和Bgl II酶切位点的miR-122靶序列的Oligo DNA0该序 列包含4个拷贝的miR-122靶序列。该Oligo DNA包含了不完全互补的上游序列和下游序 列。miR-122 靶序列的 Oligo DNA 的上游序列(miR_122T f)5，aattccaaacaccattgtcacactccaagaccaaacaccattgtcacactccagtcgaccaaacacc attgtcacactccaagaccaaacaccattgtcacactccaa 3，miR-122 靴序列的 Oligo DNA 的下游序列(miR_122T r)5，gatcttggagtgtgacaatggtgtttggtcttggagtgtgacaatggtgtttggtcgactggagtgt gacaatggtgtttggtcttggagtgtgacaatggtgtttggaatt 3，将这对(上游序列和下游序列)Oligo DNA退火。将pscAAV2-EGFP、pscAAV2_Luc 和pscAAV2-TK用Kpn I和Bgl II双酶切，在EGFP、Luc和TK基因的3，-UTR插入退火 后的 miR-122 靶序列，得到质粒载体 pscAAV2-EGFP_miR-122T、pscAAV2-Luc_miR-122T 和，这3种重组质粒所插入的EGFP、Luc和TK基因所构成的基因表达单 元的结构示意图见附图1的A、C、E和附图13、14、15。实施例2miR_122对报告基因的调控的体外研究将pscAAV2-EGFP-miR_122T质粒以及对照质粒pscAAV2_EGFP转染至Hela细胞和 Huh7细胞中。转染24h后，于荧光显微镜下，观察Hela细胞和Huh7细胞内绿色荧光表达，结 果(见附图2)显示与对照组相比，pscAAV2-EGFP-miR-122T质粒转染组在表达miR-122的 Huh7细胞中EGFP表达明显抑制，而在不表达miR-122的Hela细胞中，EGFP表达无变化。Hela细胞和Huh7细胞转染pscAAV2-Luc-miR_122T质粒(说明书附图中简写 为pLuc-122T)及其对照质粒pSCAAV2-LUC (说明书附图中简写为pLuc)，转染24h后，裂 解每孔细胞，在细胞裂解液中加入Iuciferase分析试剂盒中的底物50ul，用发光检测仪 (ModulusTM Luminometer)测定其相对光强度单位(RLU，relativelight unit)。结果(见 附图幻显示在Huh7细胞Luc的活性被抑制达4. 5倍，在Hela细胞无抑制。实施例3miR_122调控抑制自杀基因对细胞的杀伤的体外研究用pscAAV2-TK-miR-122T质粒(说明书附图中简写为pTK_122T)以及对照 pscAAV2-TK质粒(说明书附图中简写为ρΤΚ)转染至Hela细胞和Huh7细胞中。同时给予 不同浓度的GCV处理，5天后，用MTT法检测细胞存活情况。结果(见附图4)显示，与对照 相比，转染pscAAV2-TK-miR-122T的Huh7细胞存活率明显增高，Hela细胞实验组与对照组 无差异。实施例4小鼠肝脏内miR-122调控Luc基因的表达采用水动力注射法，将1. 6ml含质粒DNA的生理盐水在5至7秒钟内经小 鼠尾静脉注射至体重16 17g的BALB/c小鼠体内。每组6只小鼠，分别注射质粒 pscAAV2-Luc-miR-122T(说明书附图中简写为pLuc_122T)和对照质粒pscAAV2_Luc (说 明书附图中简写为PLuc)，每种质粒各注射1 μ g。在注射后M小时，每只小鼠腹腔内注射 D-荧光素(150mg/kg)，10min后，CXD系统收集光子5秒钟。结果(见附图5)显示，与对照 相比，Luc基因的表达被抑制了四倍。实施例5利用miR-122调控避免自杀基因对小鼠正常肝脏的杀伤采用水动力注射法，将1. 6ml含质粒DNA的生理盐水在5至6秒钟内经小鼠尾静 脉注射至体重16 17g的BALB/c小鼠体内，不含质粒的生理盐水对照组也采取相同方法 处理。试验分3组，每组6只小鼠。3组分别注射l)pscAAV2_TK(说明书附图中简写为ρΤΚ)；2)pscAAV2-TK-miR-122T(说明书附图中简写为 ρΤΚ-122Τ)；3)不含质粒的生理盐水(说明书附图中简写为NS)。注射后，每天腹腔注射GCV (注射剂量50mg/kg体重)，共14天。检测指标1)每天检测体重；2)注射后6、10和14天，采集血清，检测ALT ；3)注射14天后，取肝脏病理。结果(图6、7、8)显示，pscAAV2-TK组出现明显肝脏损伤，这些变化包括1)小鼠体重明显下降，并且出现1只小鼠死亡；
12
2) ALT明显升高，在注射后6、10和14天，分别升高5. 9,27. 1和26. 6倍；3)肝脏病理切片显示细胞水肿、坏死和炎症细胞浸润。而pscAAV2-TK-miR-122T组与生理盐水对照组相比，体重、ALT水平和肝脏病理均 未发现异常。实施例6重组病毒rscAAV8-TK-miR_122T病毒的制备重组病毒rscAAV8-TK-miR-122T 病毒(简称 AAV8-TK_miR-122T)的制备，按文献 方法(伍志坚，吴小兵等，一种高效的重组腺伴随病毒生产系统，中国科学(C辑)37(5) 423-430)制备重组AAV8病毒；用“氯仿处理-PEG/NaCl-氯仿抽提”方法(吴小兵等，一种 快速和高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法，科学通报45 (19) =2070-2075)纯 化获得粗提液；进一步用分子量截流原理以膜包法纯化获得AAV8病毒精纯液。实施例7重组病毒rscAAV8-TK-miR-122T对小鼠肝癌模型的治疗作用和安全性制备人肝癌H印G2细胞裸鼠肝脏移植瘤模型，通过尾静脉注射待检测药物。分为 3组，每组6只植瘤模型裸鼠。3组分别为1)重组病毒rscAAV8-TK-miR-122T治疗组(说明书附图中简写为TK_miR-122T)；2)重组病毒rscAAV8-EGFP-miR-122T对照组(说明书附图中简写为 EGFP-miR-122T)；3)正常对照组注射生理盐水(说明书附图中简写为NS)。重组病毒的注射剂量为lX1012vg/只；注射后，每天腹腔内注射GCV(注射剂量 50mg/kg体重)，共10天。检测指标1)注射后5和10天，采集血清，检测ALT ；2)注射10天后，观察肿瘤大小。结果显示rscAAV8-TK-miR-122T明显抑制了肿瘤的生长，而重组病毒 rscAAV8-EGFP-miR-122T对照组和注射生理盐水正常对照组的肿瘤均大幅度生长(见附 图9) ；ALT检测指标上，各组间无明显差异(见附图10)；病理结果显示，与对照组相比 rscAAV8-TK-miR-122T不损伤正常肝组织(图11)。实施例8受miR-122调控的重组病毒rscAAV8-EGFP_miR-122T的报告基因表达的 体外研究将重组病毒rscAAV8-EGFP-miR-122T (实验组)及重组病毒rscAAV8_EGFP (对照 组)分别感染Hela细胞和Huh7细胞。感染24h后，于荧光显微镜下，观察Hela细胞和Huh7 细胞内绿色荧光蛋白的表达。结果显示，与对照组相比，在表达miR-122的Huh7细胞中，实 验组的EGFP表达明显受到抑制，而在不表达miR-122的Hela细胞中，实验组的EGFP表达 无变化(见附图12)。实施例9构建含miR-122和miR-133靶序列的TK自杀基因重组质粒合成两端有Kpn I和EcoR I酶切位点的miR-133靶序列的Oligo DNA0该序列包 含3个拷贝的miR-133靶序列。该Oligo DNA包含了不完全互补的上游序列和下游序列。miR-133 靶序列的 Oligo DNA 的上游序列(miR_133T f)5' cacagctggttgaaggggaccaaagacacagctggttgaaggggaccaaagacacagctggttgaag gggaccaaag3'
miR-133 靶序列的 Oligo DNA 的下游序列(miR_133T r)5' aattctttggtccccttcaaccagctgtgtctttggtccccttcaaccagctgtgtctttggtcccc ttcaaccagctgtggtac3，并将每对Oligo DNA 退火。将 pscAAV2-TK-miR-122T 用 Kpn I 禾Π EcoR I 酶切，插 入退火后的miR-133靶序列，得到质粒载体pscAAV-TK-miR-122T-miR-133T(见附图16)。名词解释1、AAV 病毒adeno-associated virus,腺病毒相关病毒。2、ITR :inverted terminal r印eat，倒转末端重复，是AAV病毒基因组的反向末端 重复序列。翻译习惯上，inverted翻译成倒转或反向都可以。3、微小RNA(miRNA)是一种存在于动植物体内的，长度为22nt左右的非编码RNA。 它通过降解靶mRNA或抑制其翻译调节细胞内的基因表达，在细胞的生长、分裂、分化和凋 亡以及某些疾病(如癌症)的发生和进程中发挥重要的调节作用。4、miR-122T :miRNA 122的靶序列。是研究已经发现的各种miRNA中的一种miRNA 的靶序列。miRNA的靶序列的通用简写为mirT。5,CAG promoter :CAG启动子，其序列中包含了巨细胞病毒的增强子和鸡的β -肌 动蛋白内含子。6, polyA 多聚腺嘌呤加尾信号序列。7、RLU-Relative Light Unit {|。8、TK :胸腺嘧啶激酶，及其编码基因，为单纯疱疹病毒(HSV病毒)基因组中的TK 基因。9、ALT 丙氨酸氨基转移酶。10、GCV Ganciclovir，丙氧鸟苷。ll、rscAAV 自身互补型AAV载体。12, EGFP 增强型绿色荧光蛋白，及其编码基因。13、HepG2 人肝癌 H印G2 细胞。14、Huh7 人肝癌 Huh7 细胞。15、3，UTR :3，非编码区。序列表<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所<120>—种可经外周静脉内给药的肝脏肿瘤自杀基因治疗系统的构建方法和应用<160>4<210>1<211>108<212>DNA<213>人工序列<220><223>miR-122T f<400>1aattccaaacaccattgtcacactccaagaccaaacaccattgtcacactccagtcgaccaaacacc
attgtcacactccaagaccaaacaccattgtcacactccaa 108
<210>2
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>miR-122T r
<400>2
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cacagctggttgaaggggaccaaagacacagctggttgaaggggaccaaagacacagctggttgaag
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<212>DNA
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<220>
<223>miR-133T r
<400>4
aattctttggtccccttcaaccagctgtgtctttggtccccttcaaccagctgtgtctttggtcccct
tcaaccagc tgtggtac8权利要求
1.一种可由外周静脉给药、用于治疗肝细胞癌和肝转移癌的、使用杀伤性治疗基因的 重组病毒系统“rscAAV8-治疗基因-miRNA调控靶序列”的构建方法及其应用。
2.根据权利要求l，“rscAAV8-治疗基因-miRNA调控靶序列”中，治疗基因是TK基因。
3.根据权利要求1，“rscAAVS-治疗基因-miRNA调控靶序列”中，治疗基因是除TK基 因以外的其它治疗基因，如FASL基因、TNF-α基因、TRAIL基因、金黄色葡萄球菌外毒素、 p53基因等。
4.根据权利要求1，"rscAAV8-治疗基因-miRNA调控靶序列”中，miRNA调控靶序列是 miR-122T, S卩，治疗基因受miR_122T调控。
5.根据权利要求1，"rscAAV8-治疗基因-miRNA调控靶序列”中，miRNA调控靶序列是 miR-122T和miR_133T，即，治疗基因受miR_122T和miR_133T共同调控。
6.根据权利要求2和4，"rscAAV8-治疗基因-miRNA调控靶序列”中，治疗基因是TK 基因，miRNA调控靶序列是miR-122T，S卩，重组病毒是rscAAV8-TK_miR-122T，TK基因受 miR-122T 调控。
7.根据权利要求2和5，"rscAAV8-治疗基因-miRNA调控靶序列”中，治 疗基因是TK基因，miRNA调控靶序列是miR-122T和miR_133T，S卩，重组病毒是 rscAAV8-TK-miR-122T-miR-133T, TK 基因受 miR_122T 和 miR_133T 共同调控。
8.根据权利要求3和4，“rscAAV8-治疗基因-miRNA调控靶序列”中，治疗基因是除TK 基因以外的其它治疗基因，如FASL基因、TNF-α基因、TRAIL基因、金黄色葡萄球菌外毒素、 p53基因等，miRNA调控靶序列是miR_122T。
9.根据权利要求3和5，“rscAAV8-治疗基因-miRNA调控靶序列”中，治疗基因是除TK 基因以外的其它治疗基因，如FASL基因、TNF-α基因、TRAIL基因、金黄色葡萄球菌外毒素、 p53基因等，miRNA调控靶序列是miR-122T和miR_133T。
全文摘要
本发明描述了一种应用于肿瘤的基因治疗的方法。该基因药物以血清型8型的腺相关病毒(AAV8)为载体，携带了受microRNA靶序列调控的杀伤性治疗基因(包括自杀基因)。该基因药物治疗肝脏肿瘤的原理是，利用肿瘤细胞的内源性microRNA来调控由该基因药物携带的杀伤性治疗基因(自杀基因)的表达，即利用肿瘤细胞的内源性microRNA来调控外源由AAV8导入的杀伤性治疗基因的表达。在非癌组织和细胞内，因内源性microRNA调控，细胞不表达该杀伤性治疗基因。当该杀伤性治疗基因为TK基因时，该基因的表达产物能将与其相对应的化学药物底物作用成为对肝癌细胞有杀伤作用的药物，进而造成肝癌组织、细胞的被杀伤；非癌组织和细胞因为不表达该自杀基因，所以不会被杀伤，从而保护了非癌组织和细胞。这样，该基因药物就可以经外周静脉内给药，该药物也能靶向性地到达肝脏内的肝癌组织、细胞内，且在肝癌组织内表达杀伤性治疗基因，从而最终达到系统性治疗肝癌的作用。
文档编号A61P1/16GK102115733SQ20101000004
公开日2011年7月6日 申请日期2010年1月5日 优先权日2010年1月5日
发明者吴小兵, 王刚, 董小岩 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 北京五加和分子医学研究所有限公司