G6PD基因及其表达产物在治疗结直肠癌中的应用的制作方法

本发明属于基因治疗技术领域。更具体地，涉及g6pd基因及其表达产物在治疗结直肠癌中的应用。

背景技术：

结直肠癌是常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。我国结直肠癌发病率逐年升高，严重影响人类健康和生命。

据美国癌症协会估计，死于不同程度的耐药的肿瘤患者占90％以上，肿瘤的耐药问题已经成为肿瘤化疗成功与否的关键因素。结肠癌的发生率及死亡率较高，该领域的医生也同样为化疗中肿瘤耐药问题所困扰。指南推荐的一线化疗药物奥沙利铂，是最常用的化疗药物之一。然而其化学治疗效果仍然有待提高，很大部分原因也要归咎于因耐药而导致的复发和转移。然而，肿瘤耐药的发生机制非常复杂，它仍然是当前临床治疗所面临的最主要问题之一，对其全面深入的研究有助于恶性肿瘤包括结肠癌的治疗。

因此，要提高结直肠癌患者的治疗效果，依赖于基础研究的进展，明确影响疾病化疗耐药的分子机制，找到复发转移和化疗耐药的预测、预后指标及新型药物靶点的研究，是研究工作的重点。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有结直肠癌治疗技术的缺陷和不足，提供g6pd基因及其表达产物在治疗结直肠癌中的应用，并在此基础上，提供一种靶向人g6pd基因的干扰核酸载体及其包裹方法，能够特异性的针对沉默抑制g6pd基因的表达，从而达到治疗结直肠癌的目的。

本发明的目的是提供g6pd基因及其表达产物在制备预防结直肠癌的制剂和/或在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。

本发明另一目的是提供一种靶向抑制g6pd基因的干扰序列(shrna)及干扰材料。

本发明的再一目的是靶向抑制g6pd基因的干扰序列(shrna)及干扰材料在制备具有预防结直肠癌恶性增殖和/或治疗化疗耐药的结直肠癌功能的药物中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首次研究发现并公开了g6pd基因及其表达产物在预测和/或防治结直肠癌中的应用。并在此基础上，提供一种靶向抑制人g6pd基因的干扰材料及其包裹方法，能够特异性的针对沉默抑制g6pd基因的表达，可以在有效治疗结直肠癌的同时，避免其基因治疗的非特异性及副作用。

因此，以下所述应用均应在本发明保护范围之内：

g6pd基因在制备预测结直肠癌的制剂和/或在制备防治结直肠癌的药物中的应用。

g6pd基因表达产物在制备预测结直肠癌的制剂和/或在制备防治结直肠癌的药物中的应用。

g6pd基因抑制剂或g6pd基因表达产物抑制剂在制备预测结直肠癌的制剂和/或在制备防治结直肠癌的药物中的应用。

优选地，上述g6pd基因是指人g6pd基因。

其中，所述防治包括预防和治疗。所述预防结直肠癌是指预测和/或防止早、中期结直肠癌的恶性增殖。所述治疗结直肠癌是指治疗和/或克服奥沙利铂化疗耐药晚期结直肠癌。

具体地，上述的预测结直肠癌的制剂可以包括：通过实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或芯片技术预测g6pd基因及其表达产物的表达水平以诊断结直肠癌的产品。

一种g6pd基因的抑制剂和/或g6pd基因表达产物的抑制剂，也在本发明保护范围之内。

具体优选地，所述g6pd基因的抑制剂为特异性沉默g6pd基因的干扰片段，或由基因载体包裹特异性沉默g6pd基因的干扰片段所得的靶向抑制g6pd基因的干扰材料。具体所述干扰片段可选择为sirna或shrna，其核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.2所示。

一种包含有g6pd基因的抑制剂和/或g6pd基因表达产物的抑制剂的具有预防结直肠癌恶性增殖和/或治疗化疗耐药的结直肠癌功能的药物，也在本发明保护范围之内。

所述抑制剂包括抑制g6pd基因表达的物质、抑制g6pd基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制g6pd基因表达产物活性的物质。同时，所述抑制剂还包括：通过干扰rna抑制g6pd基因表达的双链核糖核酸，或基于g6pd抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制g6pd蛋白活性的蛋白质。

一种由基因载体包裹特异性沉默g6pd基因的干扰片段所得的靶向抑制g6pd基因的干扰材料，也在本发明保护范围之内。

其中，所述干扰片段为sirna或shrna，其核苷酸序列如seqidno.1或seqidno.2所示。所述基因载体的结构式如下所示：

优选地，所述基因载体的制备方法为：以聚天冬氨酸为主体，利用酸敏性苯亚胺键在主链上连接聚乙二醇，再引入低分子量的聚乙烯亚胺胺解侧链，得到ph敏感型响应性聚阳离子基因载体peg-pasp-pei(ppp)。

优选地，所述低分子量的聚乙烯亚胺是指分子量为1800的聚乙烯亚胺。

具体优选地，作为一种优选的可实施方式，所述基因载体的制备方法如下：

(1)采用fuchs-farthing法合成n-羧基-l-天冬氨酸-苄脂-环内酸酐(bla-nca)，利用苄胺作为引发剂，开环聚合得到聚天冬氨酸苄酯；

(2)聚乙二醇(peg)在催化剂的催化作用下，与对羧基苯甲醛反应，合成得到peg-cho；

(3)再将聚天冬氨酸苄酯和peg-cho进行反应，形成苯亚胺的酸敏性结构，用低分子量的聚乙烯亚胺进行胺解，合成得到基因载体peg-pasp-pei。

其中，优选地，步骤(1)中bla-nca和苄胺的摩尔比为45～55：1。

更优选地，步骤(1)中bla-nca和苄胺的摩尔比为49：1。

优选地，步骤(2)中peg和对羧基苯甲醛的摩尔比为1：5～15。

更优选地，步骤(2)中peg和对羧基苯甲醛的摩尔比为1：10。

优选地，步骤(3)中聚天冬氨酸苄酯和peg-cho的摩尔比为0.8～1.5：1。

更优选地，步骤(3)中聚天冬氨酸苄酯和peg-cho的摩尔比为1.1：1。

具体优选地，利用基因载体制备干扰材料(ppp/dna纳米基因复合物)的方法为：

将特异性沉默g6pd基因的干扰片段(如seqidno.1或seqidno.2所示的shrna序列)克隆到载体中形成质粒dna，然后将ppp聚合物和质粒dna分别溶解在超纯水中得到浓度为5mg/ml的母液，然后用pbs缓冲液稀释，分别得到1mg/ml的ppp聚合物溶液和dna溶液；再根据ppp/dna的n/p比为30，将ppp聚合物溶液与dna溶液混合后在室温下孵育25～35min，通过静电作用力形成ppp/dna纳米基因复合物，即基因干扰材料。

其中，优选地，所述pbs缓冲液的浓度为10mm，ph7.4。

优选地，孵育时间为30min。

另外，上述包裹有shrna的干扰材料能够特异性地沉默抑制g6pd的表达，可有效抑制早中期结直肠癌的复发转移，有效治疗晚期结直肠癌。

因此，所述干扰材料在制备结直肠癌的治疗药物中的应用也在本发明的保护范围之内。

另外，上述预防和/或治疗结直肠癌的药物还包括：通过抑制g6pd基因而实现抑制结直肠癌细胞生长，促进结直肠癌细胞凋亡、坏死，抑制结直肠癌细胞克隆形成，和/或抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭目的的药物，同时还包括：通过干扰rna抑制g6pd基因基因表达的双链核糖核酸，或基于g6pd基因抗原蛋白的肿瘤疫苗、或用于抑制g6pd基因蛋白活性的蛋白质。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)是磷酸戊糖途径(ppp)的第一个限速酶，协助葡萄糖进行新陈代谢，在这过程中会产生5-磷酸核糖(r5p)和烟酰胺腺嘌呤二核苷腺(nadph)。nadph是细胞内抗氧化防御系统的重要组成成分，用于维持谷胱甘肽(gsh)的还原状态，作为gsh还原酶的辅酶维持细胞中还原性谷胱甘肽的含量，在细胞防御活性氧损伤方面起着重要的作用。本发明研究发现，特异性地沉默抑制g6pd的表达，可有效抑制早中期结直肠癌的复发转移，有效治疗晚期结直肠癌，在结直肠癌的基因治疗方面具有重要的应用前景。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次公开了g6pd基因及其表达产物在预测和/或防治结直肠癌中的应用。并在此基础上，提供一种靶向抑制人g6pd基因的干扰材料(即干扰核酸载体)及其包裹方法，能够特异性的针对沉默抑制g6pd基因的表达，能有效地下调g6pd的表达，可以在有效治疗结直肠癌的同时，避免其基因治疗的非特异性及副作用。

本发明提供的是一种可用于治疗结直肠癌的基因技术，该技术是一种针对结直肠癌的基因治疗方法，相比传统的结直肠癌的治疗方法，使用基因技术来防止结直肠癌的复发转移、克服结直肠癌的化疗耐药具有特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早、中期就能得到有效的复发转移风险预测，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。同时，对于晚期结直肠癌患者采用相应的治疗措施，延缓疾病的发展，延长生存期。

附图说明

图1为基因载体peg-pasp-pei(ppp)的核磁共振氢谱图。

图2为hct116及dld-1细胞分别经负载shrna基因/ppp纳米复合物、负载对照基因/ppp纳米复合物转染后的g6pd蛋白表达量检测。

图3靶向沉默g6pd增强了奥沙利铂抑制结细胞增殖及诱导凋亡的能力。

图4靶向沉默g6pd增强了奥沙利铂抗pdx小鼠的肿瘤增殖能力。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1基因载体的制备

1、以聚天冬氨酸为主体，利用酸敏性苯亚胺键在主链上连接聚乙二醇，引入低分子量的聚乙烯亚胺胺解侧链，形成了一种新型的ph敏感型响应性聚阳离子基因载体peg-pasp-pei(ppp)。

具体地，合成方法如下：

(1)采用fuchs-farthing法合成n-羧基-l-天冬氨酸-苄脂-环内酸酐(bla-nca)，利用苄胺作为引发剂，开环聚合得到聚天冬氨酸苄酯；

(2)聚乙二醇(peg)在催化剂的催化作用下，与对羧基苯甲醛反应，合成得到peg-cho；

(3)再将聚天冬氨酸苄酯和peg-cho进行反应，形成苯亚胺的酸敏性结构，用低分子量的聚乙烯亚胺进行胺解，合成得到基因载体peg-pasp-pei。

其中，步骤(1)中bla-nca和苄胺的摩尔比为：49：1。

步骤(2)中peg和对羧基苯甲醛的摩尔比为1：10。

步骤(3)中聚天冬氨酸苄酯和peg-cho的摩尔比为1.1：1。

2、通过¹hnmr表征聚合物的组成与结构，所得基因载体peg-pasp-pei(ppp)的结构式如下所示：

其氢核磁共振图谱如附图1所示。

实施例2干扰材料(ppp/dna纳米基因复合物)的制备

1、设计g6pd特异性shrna序列

设计针对g6pd基因的特异性干扰序列，并由生物公司合成。

具体干扰序列如下：

shrna-1(如seqidno.1所示)：gccttccatcagtcggata；

shrna-2(如seqidno.2所示)：cctcatggtgctgagattt。

2、制备ppp/dna纳米基因复合物

(1)将上述shrna序列(shrna-1或shrna-2)克隆到载体中形成质粒dna。

(2)将ppp聚合物和质粒dna分别溶解在超纯水中得到浓度为5mg/ml的母液，然后用pbs缓冲液(ph7.4，10mm)稀释，分别得到1mg/ml的ppp聚合物溶液和dna溶液；再根据ppp/dna的n/p比为30，将ppp聚合物溶液与dna溶液混合后在室温下孵育30min，通过静电作用力形成ppp/dna纳米基因复合物，即基因干扰材料。

实施例3ppp/dna纳米基因复合物的体外细胞转染

本实施例利用peg-pasp-pei(ppp)载体输送针对g6pd基因的干扰序列，并转染结直肠癌hct116及dld-1细胞，通过免疫印迹试验分析对g6pd表达的影响。

1、具体方法如下：

(1)将hct116及dld-1结直肠癌细胞以每孔4×10⁵个细胞接种于6孔板中，并在含10％fbs(v/v)的rpmi-1640培养基中过夜培养，使其贴壁生长。

(2)移去原有培养基，加入新鲜培养基的同时，分别加入ppp/包含shrna质粒dna纳米复合物和ppp/control质粒dna纳米复合物，并继续孵育48h。

(3)收集细胞，加入500μlripa蛋白裂解液在冰上裂解15min，之后离心收集(13000rpm，15min)并用bca法进行定量。

(4)在蛋白裂解液中加入巯基乙醇在100℃下加热10min使其变性，之后将其加入10％sds-page凝胶进行蛋白分离，并通过电转法将蛋白印迹在pvdf膜上。

(5)脱脂奶粉在4℃封闭4h后，依次使用一抗、二抗进行孵育。最后使用化学发光液对目的蛋白g6pd及内参蛋白β-actin显色并进行曝光压片。

2、通过免疫印迹试验分析表明，与对照组比较，包含shrna的质粒dna的纳米基因复合物能有效地下调g6pd表达(如图2所示)。

实施例4靶向沉默g6pd增强了奥沙利铂抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡的能力

1、利用peg-pasp-pei(ppp)载体输送针对g6pd基因的shrna干扰序列，并转染结直肠癌hct116细胞，通过免疫印迹试验分析对g6pd表达的影响。结果显示，g6pd的表达被有效下调(如图3所示)。

2、利用peg-pasp-pei(ppp)载体携载shrna后，转染结直肠癌hct116或dld-1细胞，检测靶向沉默g6pd后对奥沙利铂体外抗肿瘤效果的影响。结果如图3所示，g6pd被沉默之后，结直肠癌细胞的存活率与奥沙利铂单药处理组相比，明显下降(图3a-b)；另外通过凋亡试剂盒检测发现，靶向沉默g6pd显著增强了化疗药物奥沙利铂诱导结直肠细胞(hct116及dld-1)凋亡的能力图3c-d)。

综上研究结果表明，抑制沉默g6pd基因的表达，可显著增强化疗药物奥沙利铂的体外抗结直肠癌的效果。

实施例5靶向沉默g6pd增强了奥沙利铂抗pdx小鼠的肿瘤增殖能力

1、患者的肿瘤移植于免疫缺陷小鼠的模型(patientderivedtumorxenograftpdx)备受广大科研者青睐，这种模型的建立在肿瘤研究中被广泛应用和证实，逐渐成为肿瘤小鼠模型的金标准，pdx是指将病人的新鲜肿瘤组织简单处理后移植到免疫缺陷小鼠上，依靠小鼠供的环境生长，这种模型保留了原代肿瘤的微环境和基本特性，为研究肿瘤提供了一个很好的体内模型。

pdx模型的建立

(1)病人肿瘤标本的收集：尽可能在肿瘤离体后收集，标本可来源于结直肠癌患者手术标本。新鲜肿瘤组织最好取肿瘤靠近边缘、坏死较少的肿瘤组织，完全浸泡于0℃带或不带血清、0.05％青霉素及链霉素双抗prmi1640培养基中。

(2)清洗后转移到带上述培养基的消毒培养皿中(0℃)，完全浸泡并带回动物房操作。用消毒组织剪将肿瘤组织修剪成2*2*3mm，并用以上培养基中清洗3遍。

(3)麻醉下的4-6周龄的scid小鼠或者裸鼠皮下后两侧皮肤各开一个约3mm小口，并分离出一个小口袋状空间，将修剪的肿瘤小块组织种植于皮下，缝合皮肤剪口。

(4)在切口滴一滴100x双抗溶液防止伤口感染。剩余组织储存于-80℃冰箱或制作石蜡切片待以后做进一步的分析。

(5)每种肿瘤都种植于5个小鼠，至少每周观察一次种植肿瘤情况。观察内容包括有无肿瘤生长及测量肿瘤的长、宽并计算肿瘤的体积。

(6)在接种肿瘤的第一周，在移植部位可以看到一个隆起的小结，然后会消失，约在12-16周后移植肿瘤才开始生长成1-2cm³大小。

2、评估靶向沉默g6pd对奥沙利铂抗肿瘤活性的影响

具体方法如下：

(1)摘取上述pdx裸鼠身上的移植瘤，并修剪成约2*2*3mm的小块。

(2)选取4～5周龄的裸鼠，随机分为4组(每组5只)，并在每只裸鼠的皮下接种上述移植瘤。

(3)观察裸鼠成瘤情况，并测量其最长径(l)和最短径(s)。待肿瘤体积长至100mm³左右时，给予如下治疗：a.对照组：腹腔注射200μlpbs，4天一次；b.奥沙利铂处理组：腹腔注射，5mg/kg，4天一次；c.基因复合物靶向沉默g6pd组：尾静脉注射，1.7mg/mice,4天一次；d.联合治疗组。

(5)每四天测量一次裸鼠肿瘤体积，4周后处死动物，取出瘤体，称重并拍照。

3、实验结果

结果如附图4所示，联合治疗组肿瘤生长速度对比单药组及对照组明显减缓，且老鼠的体重没有明显的变化(图4a)，最后的肿瘤体积也明显缩小(图4b)。

综上研究结果显示，表明通过基因治疗的手段靶向沉默g6pd能够显著地增强奥沙利铂的抗肿瘤效果(具体方式可选择：利用本发明的peg-pasp-pei(ppp)载体输送针对g6pd基因的干扰序列，联合奥沙利铂用药)，可显著提高结肠癌的治疗效果，具有很好的临床应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。