人nlk基因和egfr基因治疗肿瘤的用途及其相关药物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体公开了单独的人NLK基因；以及人NLK基因与人EGFR基因作为协同施药靶标，在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途。本发明还进一步构建了NLK基因小干扰RNA、NLK基因干扰慢病毒载体、NLK基因干扰慢病毒，并公开了他们在与EGFR基因协同治疗肿瘤中的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的慢病毒载体、慢病毒能够特异性抑制人NLK基因和/或人EGFR基因的表达，尤其是慢病毒，本发明的NLK基因干扰慢病毒能单独、或者与EGFR基因干扰慢病毒协同抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
【专利说明】人NLK基因和EGFR基因治疗肿瘤的用途及其相关药物
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体地涉及单独的人NLK基因；以及人NLK基因和人 EGFR基因协同治疗肿瘤的用途及其相关药物。
【背景技术】
[0002] 目前肿瘤的基因治疗已经取得了蓬勃快速的发展，但是迄今为止，仍然存在很多 需要解决的问题。目前用于肿瘤基因治疗的基因太少，能抑制肿瘤生长的基因为数不多，急 需提供更多可利用的基因。另外，由于肿瘤的发生、发展、转移等过程是一个多基因参与、涉 及多条信号通路的复杂网络系统，因此单个基因治疗或单一治疗方法往往疗效有限。因此， 未来基因治疗发展的重点将在于挖掘并鉴定在临床上有重要价值的基因，探索多个具有不 同抗肿瘤作用机理的基因联合治疗以及将多基因靶向药物联合治疗等。
[0003] Nemo样激酶（Nemo-like kinase, NLK)定位于细胞核，是一种属于脯氨酸介导 的蛋白激酶超家族中保守的丝氨酸-苏氨酸激酶，最初认为与果蝇的眼细胞的极化及脊 椎动物多种发育过程有关（Choi KW, Benzer S. Rotation of photoreceptor clusters in the developing Drosophila eye requires the Nemo gene. Cell. 1994;78:125-36. Verheyen EMjMirkovic I，MacLean SJj Langmann Cj Andrews BCj MacKinnon C. The tissue polarity gene Nemo carries out multiple roles in patterning during Drosophila development. Mech Dev. 2001; 101:119-32.)。近年来的研究认为NLK可调节、磷酸化转录因 子，并通过多种信号途径参与细胞的凋亡过程（Brott BK, Pinsky BA, Erikson RLNlk is a murine protein kinase related to Erk/MAP kinases and localized in the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95:963-8. Mirkovic IjCharish KjGorski SMjMcKnight KjVerheyen EM. Drosophila Nemo is an essential gene involved in the regulation of programmed cell death. Mech Dev.2002;119:9-20. )〇
[0004] 关于NLK在肿瘤中的研究已有在结直肠癌、前列腺癌和肝癌中的报道。NLK被 认为是结肠癌fct/β-catenin信号通路的抑癌基因。野生型的NLK在结直肠癌中被诱 导表达，通过磷酸化TCF/LEF抑制细胞生长，促进p53非依赖的细胞凋亡，但不影响细胞 周期（Yasuda J, Tsuchiya A, Yamada T, Sakamoto M, Sekiya T, Hirohashi S. Nemo-like kinase induces apoptosis in DLD-1human colon cancer cells. Biochem Biophys Res Commun2003;308:227-33.)。在前列腺癌中，NKL负调节雄性激素受体信号转导途径。NLK 过表达可显著诱导雄性激素受体阳性表达的前列腺癌细胞发生细胞凋亡。进一步的研究发 现，NLK能够通过与雄激素受体形成复合物的方式抑制雄激素受体对靶基因的转录活性，且 在转录水平抑制雄激素受体mRNA的表达（Emami KH，Brown LG，Pitts TE，Sun X，Vessella RL, Corey E. Nemo-like kinase induces apoptosis and inhibits androgen receptor signaling in prostate cancer cells.Prostate.2009;69:1481-92·)。而在人肝癌细 胞系中，敲除NLK的表达可以抑制细胞生长，同时发现，Gl-S期细胞增加，细胞周期相关蛋 白cyclin D1、⑶K2的表达也明显降低，说明NLK在肝癌形成中可能具有通过作用cyclin D1、CDK2 而发挥促有丝分裂的作用（Jung KH，Kim JK，Noh JH，Eun JW，Bae HJ，Xie HJ，Ahn YM, Park WS,Lee JY, Nam Sff. Targeted disruption of Nemo-like kinase inhibits tumor cell growth by simultaneous suppression of cyclin Dland CDK2in human hepatocellular carcinoma. J Cell Biochem. 2010;110:687-96·)。综上，NLK 在不同肿瘤 的发生发展中可能发挥不同的生物学功能。
[0005] 表皮生长因子受体（epidermalgrowth factor receptor, EGFR) EGFR 是一种跨膜 蛋白质，属于ErbB受体家族成员，其配体（EGF、TGF-a等）与EGFR胞外段结合使之二聚 化，由此导致胞内段酪氨酸激酶活化以及一系列信号转导的级联反应，促进细胞增殖，血管 生成，转移并抑制细胞凋亡(梁后杰，邹岚.EGFR靶向药物治疗晚期结直肠癌最新进展.中 国处方药2009; 84:58-61.)，从而导致肿瘤的发生。大量研究发现EGFR基因在多种肿瘤组 织中过表达或异常活化，从而使肿瘤细胞增殖、侵袭和转移能力增强。EGFR已成为经临床 验证的多种类型肿瘤的治疗祀点（Ciardiello F, Tortora G. EGFR antagonists in cancer treatment. N Engl J Med2008;358:1160-1174. )〇
[0006] RNAi是利用双链RNA介导的序列特异性的转录后基因沉默现象，已成为研究 基因功能的一种新兴的有效手段，并有望成为肿瘤等疾病基因治疗的工具（Izquierdo M.Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy.Cancer Gene Ther. 2005; 12 (3) :217-27.)。慢病毒（Ientivirus)载体是高效的基因转导工具，主要用于 感染对常规方法转染效率较低的细胞，如原代细胞等。慢病毒颗粒可同时感染增殖和非增 殖的细胞，且感染比较稳定、持久。运用慢病毒载体，可实现特定基因的高表达，也可以表 达发夹结构 RNA (short hairpin RNA，shRNA)以 RNA 干扰（RNA interference，RNAi)方式 下调某基因的表达。本发明拟采用慢病毒介导的RNAi技术研究NLK基因在与EGFR基因协 同抑制肿瘤细胞增殖中的功能，为恶性肿瘤的非手术临床治疗提供理论依据。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于公开了 NLK基因作为癌症治疗的靶标，治疗肿瘤的用途及其相 关药物；以及将NLK基因和EGFR基因共同作为癌症治疗的靶标，通过同时沉默NLK基因和 EGFR基因的表达，实现协同治疗肿瘤的用途，及其肿瘤治疗药物。
[0008] 本发明以RNA干扰为手段，研究了单独的NLK基因在肿瘤发生和发展中的作用，以 及，NLK基因与EGFR基因在肿瘤发生和发展中的协同作用，公开了一种抑制或降低肿瘤细 胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，该方法包括：向肿瘤细胞施用一种能够特异性抑制 NLK基因和/或EGFR基因的转录、翻译，或能够特异性抑制NLK蛋白和/或EGFR蛋白表达 的活性的物质，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化或存活。
[0009] 本发明第一方面，公开了分离的人NLK基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在 制备肿瘤诊断药物中的用途。
[0010] 所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与人NLK基因的表达相关的任意一种肿瘤； 更进一步的，为一种恶性肿瘤，例如选自：结肠癌。
[0011] 本发明中，所述人NLK基因作为针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备或筛选肿瘤 治疗药物，或者制备肿瘤诊断药物。进一步的，所述针对肿瘤细胞的作用祀标为RNA干扰作 用靶标。
[0012] 所述将分离的人NLK基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其 一，将人NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物；其 二，将人NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物。
[0013] 所述将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗 药物具体是指：将NLK基因作为RNA干扰作用的靶标，来研制针对肿瘤细胞的药物或制剂， 从而提高或降低肿瘤细胞内NLK基因的表达水平。
[0014] 所述将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗 药物具体是指：将NLK基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进 人NLK基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的NLK基因小分子干扰RNA (SiRNA)即是以人NLK基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的 药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将NLK基因及其蛋白作为作用对象。
[0015] 所述将NLK基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将NLK基因表达产物作为一项肿瘤 诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。
[0016] 所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制NLK基因的转录或翻译，或能够特异性抑制 NLK蛋白的表达或活性的分子，从而降低肿瘤细胞中NLK基因的表达水平，达到抑制肿瘤细 胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
[0017] 本发明第一方面，还公开了分离的人NLK基因和人EGFR基因在制备或筛选肿瘤治 疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。
[0018] 所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与人NLK基因和人EGFR基因的表达相关的 任一种肿瘤；更进一步的，为一种恶性肿瘤，例如选自：肺癌或结肠癌。
[0019] 本发明中，所述人NLK基因和人EGFR基因作为针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制 备或筛选肿瘤治疗药物，或者制备肿瘤诊断药物。进一步的，所述针对肿瘤细胞的作用祀标 为RNA干扰作用靶标。
[0020] 所述将分离的人NLK基因和人EGFR基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方 面的内容：其一，将人NLK基因和人EGFR基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应 用于制备肿瘤治疗药物；其二，将人NLK基因和人EGFR基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞 的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物。
[0021] 所述将人NLK基因和人EGFR基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用 于制备肿瘤治疗药物具体是指：将NLK基因和人EGFR基因共同作为RNA干扰作用的靶标， 研制能同时针对两种基因的肿瘤治疗药物或制剂，从而提高或降低肿瘤细胞内NLK基因和 人EGFR基因的表达水平；或者，将NLK基因和人EGFR基因分别作为RNA干扰作用的靶标， 来研制分别针对两种基因的肿瘤治疗药物，从而获得能提高或降低肿瘤细胞内NLK基因和 人EGFR基因表达水平的肿瘤治疗药物或制剂。
[0022] 所述将人NLK基因和人EGFR基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用 于筛选肿瘤治疗药物具体是指：将人NLK基因和人EGFR基因同时作为作用对象，对药物进 行筛选，以找到可以分别影响(抑制或促进）人NLK基因表达的药物和影响(抑制或促进）人 EGFR基因表达的药物，然后作为肿瘤治疗备选组合物药物；或者找到可以同时影响(抑制 或促进）人NLK基因和人EGFR基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的 NLK基因小分子干扰RNA( s i RNA )、基因干扰核酸构建体、慢病毒，以及EGFR基因小分子干扰 RNA (siRNA)、基因干扰核酸构建体、慢病毒，均是以NLK基因和EGFR基因分别为作用对象 筛选获得的；当它们共同使用时，存在协同作用的效果，比单一一种物质的使用效果更好； 可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将 人NLK基因和人EGFR基因及其蛋白作为作用对象。
[0023] 所述将人NLK基因和人EGFR基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将NLK基因表达产 物和人EGFR基因表达产物作为肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断试剂的制备。
[0024] 本发明的所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制人NLK基因和/或人EGFR基因的 转录或翻译，或能够特异性抑制人NLK基因和/或人EGFR基因的表达或活性的分子，从而 降低肿瘤细胞人NLK基因和/或人EGFR基因的表达水平，达到抑制肿瘤细胞的增殖、生长、 分化、存活的目的。
[0025] 本发明制备或筛选的肿瘤治疗药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、 小分子化学药(例如抑制剂)、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
[0026] 所述核酸分子包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸内 切酶ΠΙ制备的小干扰RNA (esiRNA)或者短发夹RNA (shRNA)。
[0027] 所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低人NLK基因和人EGFR基因的转录或翻译， 或者足够降低人NLK蛋白和人EGFR蛋白的表达或活性的剂量。以使人NLK基因和人EGFR 基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0028] 本发明中，当人NLK基因和人EGFR基因作为协同施药靶标进行肿瘤治疗和药物筛 选时，是通过RNA干扰的方法，以人NLK基因和EGFR基因作为RAN干扰的靶基因，降低这两 个基因的表达水平。
[0029] 采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法是通过单独降低人NLK基因的表达水平 抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的，或者通过同时降低人NLK基因和人EGFR基因的表 达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人NLK基因 表达水平的物质；或者，将能有效降低人NLK基因和人EGFR基因表达水平的物质给药于患 者。
[0030] 本发明第二方面公开了一种治疗肿瘤的核酸分子药物，其有效成分含有降低肿瘤 细胞中NLK基因表达的分离的核酸分子，以及降低肿瘤细胞中EGFR基因表达的分离的核酸 分子；所述降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的核酸分子包含：
[0031] a) NLK基因双链RNA，所述NLK基因双链RNA中含有能够在严紧条件下与NLK基因 杂交的核苷酸序列；或者
[0032] b) NLK基因 shRNA，所述NLK基因 shRNA中含有能够在严紧条件下与NLK基因杂交 的核苷酸序列；
[0033] 所述降低肿瘤细胞中EGFR基因表达的分离的核酸分子包含：
[0034] A. EGFR基因双链RNA，所述EGFR基因双链RNA中含有能够在严紧条件下与EGFR 基因杂交的核苷酸序列；或者
[0035] B. EGFR基因 shRNA，所述EGFR基因 shRNA中含有能够在严紧条件下与EGFR基因 杂交的核苷酸序列。
[0036] 进一步的，所述肿瘤为肺癌或结肠癌。
[0037] 较优的，所述NLK基因双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互 补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与NLK基因的靶序列基本相同。
[0038] 较优的，所述EGFR基因双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链 互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与EGFR基因的靶序列基本相同。
[0039] 较优的，所述NLK基因 ShRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链 片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述 正义链片段的序列与NLK基因的靶序列基本相同。
[0040] 较优的，所述EGFR基因 ShRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义 链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所 述正义链片段的序列与EGFR基因的靶序列基本相同。
[0041] 更优的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一 ：UUCAAGAGA、AUG、CCC、 UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0042] 更优的，所述NLK基因的靶序列，为SEQ ID NO: 1所示序列；所述EGFR基因的靶序 列，为SEQ ID NO:2所示序列。
[0043] 所述NLK基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默NLK基因表达时，与所述siRNA 互补结合的mRNA片段所对应的NLK基因中的片段。同理，所述EGFR基因的靶序列即为 siRNA用于特异性沉默EGFR基因表达时，与所述siRNA互补结合的mRNA片段所对应的EGFR 基因中的片段。
[0044] 所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为 19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。
[0045] 进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA (siRNA)。
[0046] 最优的，NLK基因小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO :9所示，具体为 5' -GCAGCC⑶CAUUACAGCAA-3'。SEQ ID NO :9 所示的 NLK 基因 siRNA 的第一链为以 SEQ ID NO: 1所示的序列为RNA干扰靶序列设计的针对人NLK基因的小干扰RNA中的一条链，该第 一链与第二链组成的siRNA能够起到特异性沉默肿瘤细胞中内源NLK基因表达的作用。
[0047] 最优的，EGFR基因小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID N0:10所示，具体为 5' -GGCUGGUUAUGUCCUCAUU-3'。SEQ ID NO :10 所示的 EGFR 基因 siRNA 的第一链为以 SEQ ID NO: 2所示的序列为RNA干扰靶序列设计的针对人EGFR基因的小干扰RNA中的一条链， 该第一链与第二链组成的siRNA能够起到特异性沉默肿瘤细胞中内源EGFR基因表达的作 用。
[0048] 最优的，所述NLK基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 11所示，具体为： 5' -GCAGCCGUCAUUACAGCAA CUCGAG UUGCUGUAAUGACGGCUGC-3'。
[0049] 最优的，所述EGFR基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 12所示，具体为： 5, -GUGGCUGGUUAUGUCCUCAUUCUCGAG AAUGAGGACAUAACCAGCCAC-3，。
[0050] 当用作治疗肿瘤的药物时，是将安全有效量的双链RNA或shRNA施用于哺乳动物。 具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0051] 本发明第三方面，公开了一种治疗肿瘤的慢病毒载体药物，其有效成分含有NLK 基因干扰慢病毒载体和EGFR基因干扰慢病毒载体，所述NLK基因干扰慢病毒载体含有编码 前述NLK基因 shRNA的基因片段，所述EGFR基因干扰慢病毒载体含有编码前述EGFR基因 shRNA的基因片段。
[0052] 进一步的，所述肿瘤为肺癌或结肠癌。
[0053] 所述NLK基因干扰慢病毒载体是将编码前述NLK基因 shRNA的DNA片段克隆入已 知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述NLK基因干扰慢病毒载体经过病毒包装 成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出所述shRNA，通过酶切加工等步骤， 最终获得所述NLK基因小干扰RNA，用于特异性沉默NLK基因的表达。EGFR基因干扰慢病 毒载体同NLK基因。
[0054] 编码所述NLK基因 shRNA基因片段的DNA序列含有SEQ ID NO: 1所示序列及其互 补序列。编码所述EGFR基因 shRNA基因片段的DNA序列含有SEQ ID NO: 2所示序列及其 互补序列。
[0055] 进一步的，本发明所述基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤 细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白 (GFP) 0
[0056] 进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.1-CMV-Ne。、 pLKO.1-Ne。、 pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagYFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP、 pLKO. l-pur〇-CMV-TagFP635、pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO. l-pur〇-UbC-TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAL 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-GW/lacZ 中的任一。
[0057] 本发明第四方面，公开了一种治疗肿瘤的慢病毒药物，其有效成分含有NLK基因 干扰慢病毒和EGFR基因干扰慢病毒，所述NLK基因干扰慢病毒由前述NLK基因干扰慢病 毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成；所述EGFR基因干扰慢病 毒由前述EGFR基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而 成。
[0058] 进一步的，所述肿瘤为肺癌或结肠癌。
[0059] 本发明的慢病毒可感染肿瘤细胞并产生分别针对NLK基因或EGFR基因的小分子 干扰RNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。该NLK基因干扰慢病毒和EGFR基因干扰慢病毒可用 于制备预防或治疗肿瘤的药物。
[0060] 本发明第五方面，公开了一种用于治疗肺癌或结肠癌的药物组合物，其组成含有 前述降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的核酸分子、NLK基因干扰慢病毒载体、NLK基因 干扰慢病毒中的至少一种；以及，前述降低肿瘤细胞中EGFR基因表达的分离的核酸分子、 EGFR基因干扰慢病毒载体、EGFR基因干扰慢病毒中的至少一种。
[0061] 优选的，上述成分为治疗肺癌或结肠癌的药物组合物的药效成分。
[0062] 当用作治疗肿瘤的药物时，是将安全有效量的双链RNA、shRNA、或慢病毒施用于哺 乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之 内的。
[0063] 本发明的药物组合物中，特异性沉默NLK基因表达，以及特异性沉默EGFR基因表 达的有效成分发挥了协同治疗的作用；本发明实施例记载，双基因敲减后的癌细胞生长抑 制率明显大于单基因敲减组的加和，表明特异性沉默NLK基因表达的物质与特异性沉默 EGFR基因表达的物质协同抑制肿瘤细胞的增殖。
[0064] 进一步的，本发明所述药物或药物组合物含有1?99wt%所述小干扰RNA、shRNA、 基因干扰核酸构建体和/或基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。 [0065] 制备药物时，通常将有效成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或 药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为 赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭 菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶 纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂（如羟基苯 甲酸甲酯和丙酯）、甜味剂等。
[0066] 本发明的有益效果为：本发明提供的SiRNA或者包含该小干扰RNA序列的核酸构 建体、慢病毒能够特异性抑制人NLK基因的表达，尤其是慢病毒，能单独，或者与EGFR靶向 慢病毒协同抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。本发明 中的NLK基因即可以作为单独的肿瘤治疗靶标，也可以作为EGFR基因协同治疗靶标，在肿 瘤治疗中具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0067] 图 I :GV115 质粒 DNA 图谱
[0068] 图 2 :GV113 质粒 DNA 图谱
[0069] 图3 :NLK shRNA质粒鉴定图
[0070] 1# :阴性对照（ddH20) ;2# :阴性对照（空载自连对照组）
[0071] 3# :Marker 自上而下依次为 5kb，3kb，2kb，I. 5kb，lKb，750bp，500bp，250bp，IOObp
[0072] 4# ?8# :NLK shRNAl-5 号转化子鉴定
[0073] 图4 :EGFR shRNA质粒鉴定图
[0074] 1# :阴性对照（ddH2〇)
[0075] 2# :阴性对照（空载自连对照组）
[0076] 3# :Marker 自上而下依次为 5kb，3kb，2kb，I. 5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，IOObp
[0077] 4# ?8# :EGFR shRNAl-5 号转化子鉴定
[0078] 图5 :NLK shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同时浸染人肺癌H1299细胞4天后， 显著抑制细胞增殖
[0079] 图6 :表示NLK shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同时浸染人结肠癌RKO细胞4 天后，显著抑制细胞增殖
【具体实施方式】
[0080] 下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制 本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条 件，如[美]Sambrook. J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社 2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
[0081] 实施例1针对人NLK基因和EGFR基因 RNAi慢病毒的制备
[0082] 1.构建慢病毒载体
[0083] I)构建针对人NLK基因和EGFR基因的慢病毒载体
[0084] 从Genbank调取NLK(ΝΜ_016231)和EGFR基因（NM_201282)信息；利用上海吉凯基 因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对NLK基因和EGFR基因的有效的siRNA 靶点。初步筛选得到具有明显抑制NLK基因表达功能的siRNA靶点序列（SEQ IDN0. 1)和 明显抑制EGFR基因表达功能的siRNA靶点序列（SEQ ID NO. 2)。通过Genbank数据库进行 BLAST分析，确定其不对任何其它基因产生干扰作用。
[0085] 表IsiRNA靶点序列
【权利要求】
1. 分离的人NLK基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用 途。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述人NLK基因作为针对肿瘤细胞的作用靶 标应用于制备或筛选肿瘤治疗药物，或者制备肿瘤诊断药物。
3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述针对肿瘤细胞的作用靶标为RNA干扰作 用靶标。
4. 分离的人NLK基因和人EGFR基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断 药物中的用途。
5. -种治疗肿瘤的核酸分子药物，其有效成分含有降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分 离的核酸分子，以及降低肿瘤细胞中EGFR基因表达的分离的核酸分子； 所述降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的核酸分子包含： a) NLK基因双链RNA，所述NLK基因双链RNA中含有能够在严紧条件下与NLK基因杂交 的核苷酸序列；或者 b) NLK基因 shRNA，所述NLK基因 shRNA中含有能够在严紧条件下与NLK基因杂交的核 苷酸序列； 所述降低肿瘤细胞中EGFR基因表达的分离的核酸分子包含： A. EGFR基因双链RNA，所述EGFR基因双链RNA中含有能够在严紧条件下与EGFR基因 杂交的核苷酸序列；或者 B. EGFR基因 shRNA，所述EGFR基因 shRNA中含有能够在严紧条件下与EGFR基因杂交 的核苷酸序列。
6. 如权利要求5所述的核酸分子药物，其特征在于，所述NLK基因双链RNA包含第一 链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列 与NLK基因的靶序列基本相同；所述NLK基因 shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连 接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互 补，并且所述正义链片段的序列与NLK基因的靶序列基本相同；所述EGFR基因双链RNA包 含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链 的序列与EGFR基因的靶序列基本相同；所述EGFR基因 shRNA包括正义链片段和反义链片 段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片 段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与EGFR基因的靶序列基本相同。
7. 如权利要求6所述的核酸分子药物，其特征在于，所述NLK基因的靶序列，为SEQ ID NO:1所示序列；所述EGFR基因的靶序列，为SEQ ID NO: 2所示序列。
8. 如权利要求5-7任一权利要求所述的核酸分子药物，其特征在于，所述双链RNA为 小干扰RNA，并且NLK基因小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO :9所示；EGFR基因小干扰 RNA第一链的序列如SEQ ID NO :10所示；所述NLK基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 11所 示；所述EGFR基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 12所示。
9. 一种治疗肿瘤的慢病毒载体药物，其有效成分含有NLK基因干扰慢病毒载体和EGFR 基因干扰慢病毒载体，所述NLK基因干扰慢病毒载体含有编码权利要求5-8任一权利要求 所述核酸分子药物中的NLK基因 shRNA的基因片段；所述EGFR基因干扰慢病毒载体含有编 码权利要求5-8任一权利要求所述核酸分子药物中的EGFR基因 shRNA的基因片段。
10. -种治疗肿瘤的慢病毒药物，其有效成分含有NLK基因干扰慢病毒和EGFR基因干 扰慢病毒，所述NLK基因干扰慢病毒由权利要求9所述慢病毒载体药物中的NLK基因干扰 慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成；所述EGFR基因干扰 慢病毒由权利要求9所述慢病毒载体药物中的EGFR基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质 粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
11. 一种治疗肺癌或结肠癌的药物组合物，其组成含有权利要求5-8任一权利要求所 述核酸分子药物中的降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的核酸分子、权利要求9所述慢 病毒载体药物中的NLK基因干扰慢病毒载体、权利要求10所述慢病毒药物中的NLK基因干 扰慢病毒中的至少一种；以及权利要求5-8任一权利要求所述核酸分子药物中的降低肿瘤 细胞中EGFR基因表达的分离的核酸分子、权利要求9所述慢病毒载体药物中的EGFR基因 干扰慢病毒载体、权利要求10所述慢病毒药物中的EGFR基因干扰慢病毒中的至少一种。
【文档编号】A61K48/00GK104225618SQ201310231694
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月9日 优先权日:2013年6月9日
【发明者】曹跃琼, 朱向莹, 金杨晟, 瞿红花 申请人:上海吉凯基因化学技术有限公司