专利名称：糖尿病性局部缺血疾病的基因治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用肝细胞生长因子(HGF)对糖尿病缺血疾病进行基因治疗的试剂和方法。更明确地，本发明涉及基因治疗糖尿病缺血疾病的方法，其包括非侵袭性给予含HGF基因或以HGF基因为有效成分的治疗试剂。
背景技术：
HGF是一种蛋白质，首先发现它是强烈刺激肝细胞成熟的生长因子，并且克隆了编码它的基因(生物化学和生物物理研究交流(Biochem.Biophys.Res.Commun.)122，1450(1984)；美国国家科学院会议论文集(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83，6489(1986)；欧洲生物化学协会联合会会刊(FEBS Letter)22，231(1987)；自然342，440(1989)；美国国家科学院会议论文集87，3200(1991))。后来，研究者发现HGF不仅可以作为体内的肝细胞再生因子修复和再生损伤的肝脏，还有血管生成的功能，并在局部缺血疾病和动脉疾病的治疗和预防中发挥重要作用(Symp.Soc.Exp.Biol.47，细胞行为，227-234(1993)；美国国家科学院会议论文集90，1937-1941(1993)；循环97，381-390(1998))。已报道，给予兔下肢局部缺血模型HGF，可以观察到明显的血管生成及血流改善，血压降低的抑制和局部缺血症状的改善。根据这些报道，目前认为HGF可表达为一种血管生成因子并具有其功能。
如上所述，HGF具有血管生长因子的功能而表现出各种各样的功能，许多研究者试图把它制成药物。然而，HGF在血液中的半衰期成为一个问题。HGF的半衰期只有10分钟左右，很难维持在血液中的浓度。因此，问题在于如何把HGF的有效浓度递送到效应部位。
众所周知蛋白制剂绝大多数通过静脉注射给予，上述向局部缺血模型给予HGF便是如此，静脉和动脉内给予的实例见(循环97，381-390(1998))。尽管静脉或动脉内给予HGF对局部缺血疾病和动脉疾病有效，针对HGF特异性有效的给药方法、用药剂量等还在研究中。由于上述HGF的半衰期和递送到效应部位的问题，针对HGF蛋白特别有效的给药方法或剂量还在研究。
另一方面，由于最近分子生物学的快速发展，有可能利用基因转移的方法活化细胞功能并进行了各种各样的尝试。已进行了心区基因治疗的试验。已报道了一些基因转移的方法，比如冠状扩散注入法等，但还没有针对局部缺血部位的基因转移法实例，尤其对特定糖尿病性局部缺血疾病的骨骼肌肌肉内输注法。
此外，已知糖尿病并发的或直接导致的局部缺血疾病很少发生血管再生并且预后不理想。目前还不知道这种糖尿病性局部缺血疾病给予HGF基因是否有效。
发明内容
本发明的目的是提供利用HGF基因治疗糖尿病性局部缺血疾病的制剂和方法。
发明人研究了HGF基因是否适于糖尿病性局部缺血疾病的治疗，结果发现通过直接在局部缺血性部位给予HGF基因得到极有效的结果。具体地，就下肢局部缺血疾病而言，发现在局部缺血下肢给予HGF基因获得了有效的结果。如上所述，已知糖尿病并发型或糖尿病所致局部缺血疾病很少发生血管再生并且预后不理想。所以，与单纯的局部缺血疾病不同，目前未知HGF基因对糖尿病性局部缺血疾病是否有效。本发明首次揭示了HGF基因对糖尿病性局部缺血疾病的有效性。
由于本方法为非侵袭性治疗，因此其具有可根据病情重复给予本基因的优势。
因此，本发明的要点如下(1)一种糖尿病性局部缺血疾病的治疗制剂，其包括肝细胞生长因子(HGF)作为有效组分；(2)根据(1)的治疗制剂，其用于局部缺血部位给药；(3)根据(1)或(2)的治疗制剂，其中糖尿病性局部缺血疾病选自糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神经病或糖尿病缺血性心肌梗塞；
(4)根据(3)的治疗制剂，其中糖尿病性局部缺血疾病是糖尿病性下肢局部缺血；(5)根据(1)到(4)任何一项的治疗制剂，其用于缺血部位的肌肉内给药；(6)根据(1)到(5)任何一项的治疗制剂，其中HGF基因是仙台病毒(HVJ)-脂质体的形式。
(7)根据(1)到(6)任何一项的治疗制剂，其中HGF基因可根据需要重复给药；(8)根据(1)到(7)任何一项的治疗制剂，其中HGF基因的量至少50μg；(9)治疗糖尿病性局部缺血疾病的方法，其包括把HGF基因导入人体。
(10)根据(9)的方法，其中HGF基因给药于局部缺血部位。
(11)根据(9)或(10)的方法，其中糖尿病性局部缺血疾病选自糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神经病或糖尿病缺血性心肌梗塞；(12)根据(11)的方法，其中糖尿病性局部缺血疾病是糖尿病性下肢局部缺血；(13)根据(9)到(12)任何一项的方法，其中HGF基因向局部缺血部位的肌肉内给药；(14)根据(9)到(13)任何一项的方法，其中HGF基因是仙台病毒(HVJ)-脂质体的形式；(15)根据(9)到(14)任何一项的方法，其中HGF基因可根据需要重复给予；(16)根据(9)到(15)任何一项的方法，其中HGF基因的量至少为50μg；(17)HGF基因在制备糖尿病性局部缺血疾病的治疗制剂中的用途。
(18)根据(17)涉及的用途，其中糖尿病性局部缺血疾病选自糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神经病或糖尿病缺血性心肌梗塞；(19)根据(18)涉及的用途，其中糖尿病性局部缺血疾病是糖尿病性下肢局部缺血；(20)根据(17)到(19)中任何一项的用途，其中HGF基因是仙台病毒(HVJ)-脂质体的形式；并且(21)根据(17)到(20)中任何一项的用途，其中HGF基因的量至少为50μg。
附图简述
图1显示参考例1中糖尿病性下肢局部缺血大鼠及对照组大鼠(在正常大鼠中诱导下肢局部缺血)的血流灌注率随时间的变化。
图2显示参考例1中糖尿病性下肢局部缺血大鼠及对照组大鼠(在正常大鼠中诱导下肢局部缺血)缺血部位肌肉内的HGF浓度。
图3显示参考例1中糖尿病性下肢局部缺血大鼠(给予或未给予HGF基因)及对照组大鼠(在正常大鼠中诱导下肢局部缺血)的血流灌注率。
图4为通过对下肢局部缺血部位的骨骼肌进行ALP(碱性磷酸酶)染色，揭示参考例1中糖尿病性下肢局部缺血大鼠(给予或未给予HGF基因)及对照组大鼠(在正常大鼠中诱导下肢局部缺血)的血管数比较结果。
图5显示参考例2中添加了葡萄糖的血管内皮细胞的培养上清(加或未加HGF)及对照组(未加葡萄糖)中的MMP-1浓度。
图6显示参考例3中添加了葡萄糖的血管内皮细胞的培养上清(加或未加HGF)及对照组(未加葡萄糖)中，表达于血管内皮细胞中的转录因子的mRNA水平。
实施本发明的最佳模式本文所用“HGF基因”指能表达HGF(HGF蛋白)的基因。具体指，在自然342440(1989)；日本专利公开号2777678；生物化学和生物物理研究交流163967(1989)；和生物化学和生物物理研究交流172321(1990)等文献中描述的，整合至下述适当表达载体(非病毒载体，病毒载体)的HGFcDNA。编码本发明HGF基因的碱基序列已在上述文献中描述，并在数据库如Genbank中登记。因此，根据这类序列信息，以适当DNA片段作为PCR引物，通过如对肝脏或白细胞的mRNA实施RT-PCR，可克隆HGF的cDNA。这类克隆可由本领域技术人员根据基础教材如分子克隆，第二版，冷泉港实验室出版社(1989)很轻易地实施。
本发明的HGF基因不限于上面提到的基因，还包括能编码与HGF功能基本相同之蛋白的那些基因。即下述基因归入本发明的HGF基因类1)在严格条件下与该cDNA杂交的DNA，和2)一种DNA，其编码蛋白的氨基酸序列为在所述cDNA编码蛋白中有一个或多个(优选几个)氨基酸被取代、删除和/或加入，而且其编码的蛋白质具有HGF的功能。以上1)和2)的DNA很容易获得，例如，通过定点诱变、PCR法和依次(ordinal)杂交法等。根据上述基础教材很容易实施这些方法。
随后阐述本发明基因治疗中应用的基因转移方法、剂型、剂量等。
含有上述基因作为有效成分以便给药于患者的基因治疗剂的剂型可大致分为两组一组使用非病毒载体，另一组使用病毒载体。它们的制备和给药方法详述于实验室手册(实验医学增刊，基因治疗的基本技术，Yodosha(1996)；实验医学增刊，基因转移和表达分析中的实验方法，Yodosha(1997)；基因治疗的开发及研究手册，日本基因治疗协会编，NTS(1999))。具体描述如下。
A.非病毒载体的使用将目的基因整合至一种常用的基因表达载体中，产生的重组表达载体可用于将该目的基因用以下方法导入细胞或组织。
将基因转移至细胞中的方法包括脂转染法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、用显微玻璃管将DNA直接导入法等。
就基因转移至组织中的方法而言，将所述重组表达载体掺入细胞可通过，如使用内在型脂质体的基因转移方法，使用静电型脂质体的基因导入方法，HVJ-脂质体法，改良的HVJ-脂质体法(HVJ-AVE脂质体法)，受体-介导的基因导入法，将DNA分子与载体(金属粒子)一起通过粒子枪导入的方法，直接导入裸露DNA的方法，使用带正电的多聚体的导入方法，等。
它们中，HVJ-脂质体是一种融合产物，其通过在脂质双层所构成的脂质体中容纳DNA而产生，其中所述脂质体已融合至灭活的仙台病毒(日本血凝病毒HVJ)。HVJ-脂质体法的特征是与常规脂质体法比较，它与细胞膜的融合具有非常高的融合活性，它是优选的导入方法。制备HVJ-脂质体的方法可详见文献(实验医学单册，基因治疗的基本技术，Yodosha(1996)；基因导入和表达分析中的实验方法，Yodosha(1997)；临床研究杂志，931458-1464(1994)；美国生理学杂志，271R1212-1220(1996))等，详述于下文实验实施例。具体优选Z株(可得自ATCC)作为HVJ病毒株，但也可使用其它HVJ株(例如，ATCC VR-907和ATCC VR-105)。
此外，直接导入裸露DNA的方法是上述方法中最简单的一种，因此也是优选的导入方法。
本文所用表达载体可以是任何表达载体，只要它们可体内表达目的基因。实例如pCAGGS(基因108193-200(1991))，pBK-CMV，pcDNA3.1，pZeoSV(Invitrogen，Stratagene)等。
B.病毒载体的使用使用病毒载体的代表性方法包括使用诸如重组腺病毒、逆转录病毒等作为病毒载体的方法。更具体地，可将目的基因导入DNA病毒，如脱毒的逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒，痘苗病毒，痘病毒，脊髓灰质炎病毒，新培斯病毒，仙台病毒，SV40，人类免疫缺陷病毒(HIV)等，然后使病毒感染细胞以便将所述基因导入细胞。
上述病毒载体中，已知腺病毒的感染效力比其它病毒载体的高很多。故优选使用腺病毒载体系统。
将基因治疗剂导入患者的方法有，能将基因治疗剂直接导入机体的体内法，和从人体取出细胞，将基因治疗剂导入其中，然后再导回体内的离体法(Nikkei Science，1994年4月期20-24页；Monthly Yakuji，36(1)23-48(1994)；实验医学增刊12(15)(1994)；基因治疗的开发及研究手册，NTS(1999))。本发明优选体内法。
可根据上述给药方案采用各种剂型(如液体)。当使用含有所述基因作为有效成分的注射剂时，可通过将所述有效成分溶于一种标准溶剂(缓冲液如PBS，生理盐水，无菌水等)来制备。然后可按要求将所述注射液用滤膜过滤除菌，再装入已灭菌的容器中。可在该注射液中加入常规载体等。脂质体，如HVJ-脂质体可采取悬浮剂，冷冻制剂，离心浓缩的冷冻制剂等形式。
本发明可以单独使用HGF基因或与已知的具有血管生成功能的因子联合使用。例如，已报道VEGF和FGF等因子具有血管生成功能，所以也可以使用这些基因。而且，已报道生长因子如EGF可以修复各种组织的细胞损伤，因此也可使用编码它们的基因。
本文中糖尿病性局部缺血疾病包括糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神经病或糖尿病缺血性心肌梗塞等，本发明的治疗制剂可用于任何一种上述疾病。而且，本发明的治疗制剂不仅可用于危重糖尿病性局部缺血病人而且可用于进展性轻微症状的病人。
可针对本发明的基因治疗制剂选择足以治疗疾病或症状的正确给药方法和部位。给药方法优选非胃肠道给药。给药部位优选局部缺血部位。本文“局部缺血部位”包括局部缺血的患处及其周边的部位。
具体地，可给药至血管或局部缺血部位的肌肉中。但优选局部缺血部位的肌肉中给药。换言之，给药至下肢局部缺血部位的骨骼肌能刺激局部缺血病灶的血管生成并改善血流。从而使局部缺血部位的功能恢复并正常化。在心脏病如心肌梗塞中，可通过给药至心肌而获得相似的效应。
优选的给药方法有通过非侵袭性导管、非侵袭性注射器等进行的给药。此外，可通过回波的使用来实施非侵袭性导管给药，非侵袭性注射器给药等。利用非侵袭性导管的方法如直接将HGF基因从心脏病人的心室内部空间注射至心肌。
应用本发明的HGF基因使糖尿病性局部缺血疾病的患者有可能得到积极的治疗。例如，它能使除了外科手术切除患处以外无法有效治疗的重症患者恢复功能。
本发明治疗剂的用量根据患者的症状变化，可将每成人患者的剂量定为HGF基因约1μg-50mg，优选约10μg-5mg，更优选约50μg-5mg。
本发明的治疗制剂适于每隔几天给药一次，或每隔几周给药一次，优选每周给药一次。根据本发明的治疗，基因均为非侵袭性给药，因此目的基因可根据需要尽可能多地给药。
现在参照下面的实例具体解释本发明。然而，请注意本发明不以任何方式受限于这些实施例。
材料方法制备HVJ脂质体制剂将10mg干脂质(磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、与胆固醇1∶4.8∶2的混合物)与含HGF基因(100μg)-HMG1(高迁移率1组核蛋白，25μg)的200μl平衡盐溶液(137μM NaCl，5.4μM KCl，10μM Tris-HCl；pH7.6)经强烈搅拌及超声处理而混合，形成脂质体。纯化的仙台病毒(Z株)用UV(110尔格/mm2/秒)照射3分钟。将脂质体悬浮液与仙台病毒(HVJ)混合，4℃加热10分钟，然后37℃加热30分钟。弃去游离的HVJ，从而得到HVJ脂质体试剂。
实验动物给药组糖尿病大鼠中的局部缺血大鼠(DM-大鼠)对照大鼠正常大鼠中的局部缺血大鼠HVJ脂质体制剂的给药方法大鼠(6周龄；每组6只动物)经腹膜内给予链脲霉素而激发糖尿病，通过外科切除这种糖尿病大鼠一条腿的股骨动脉，造成下肢局部缺血。
将含有HGF基因的HVJ脂质体制剂注入下肢骨骼肌。
检测详述给予脂质体制剂后，通过多普勒激光影像仅(LDI)利用激光散射分析监测下肢血流，以此作为侧支(bypass)循环的形成和血流改善效果的指征。取局部缺血下肢相对于正常下肢的彩色直方图平均值为灌注比。
下肢局部缺血部位毛细血管密度通过碱性磷酸酶(ALP)染色检测，比较糖尿病性下肢缺血大鼠组与对照下肢缺血大鼠组的结果。另外，比较了HGF基因治疗组与未用HGF基因治疗组的结果。
参考例1糖尿病大鼠下肢局部缺血部位的HGF表达状态大鼠(6周龄；每组6只动物)经腹膜内给予链脲霉素而激发糖尿病。通过外科切除这种糖尿病大鼠，以及作为对照的正常大鼠(6周龄；每组6只动物)的一条腿之股骨动脉，造成下肢局部缺血。
一周后，用多普勒激光影像仪测定局部缺血部位的灌注比。局部缺血部位或糖尿病性下肢局部缺血大鼠的灌注比远低于对照组下肢缺血大鼠的灌注比(见图1)。
3周和5周后再次测量下肢灌注比，得到相同的结果。即糖尿病性下肢缺血大鼠的下肢灌注比远低于对照组大鼠下肢灌注比(见图1)。
糖尿病性下肢局部缺血大鼠的缺血部位肌肉中内部HGF浓度显著低于对照组下肢局部缺血大鼠的。这个结果表示，由于肌肉中内部HGF的减少，糖尿病患者的血管再生能力很差。故糖尿病性下肢局部缺血大鼠几乎没有血管再生并且不形成侧支循环(见图2)。
实验1针对糖尿病性下肢局部缺血大鼠的HGF基因治疗效果(I)
大鼠(6周龄；每组6只动物)经腹膜内给予链脲霉素而激发糖尿病。通过外科切除这种糖尿病大鼠一条腿之股骨动脉，造成下肢局部缺血。之后，将含有HGF基因(50μg)的HVJ脂质体制剂注射至下肢局部缺血部位的肌肉中。
3周后，用多普勒激光影像仅(LDI)监测局部缺血部位的灌注比。糖尿病性下肢缺血大鼠给予HGF之后，相对于对照组下肢缺血大鼠和未如上述给药的糖尿病性下肢缺血大鼠组，缺血部位的灌注比显著增加。
以对照组下肢局部缺血大鼠的灌注比为100％，HGF基因未处理组糖尿病性下肢缺血大鼠的灌注比为67％，HGF基因处理组糖尿病性下肢缺血大鼠的灌注比为129％。图3显示了结果(见图1)。
实验2针对糖尿病性下肢局部缺血大鼠的HGF基因治疗效果(II)经过上述处理的糖尿病性下肢局部缺血大鼠和对照组下肢局部缺血大鼠接受HGF基因治疗。5周后，取每一动物的下肢缺血部位的骨骼肌，进行ALP染色并比较每单位面积的血管数。HGF基因未处理组糖尿病性下肢缺血大鼠的血管计数显著少于对照组下肢局部缺血大鼠的血管计数，但HGF基因处理组糖尿病性下肢缺血大鼠的血管计数显著增加。结果见表4。
参考例2葡萄糖浓度和HGF的添加对血管内皮细胞之MMP-1产生的影响在各含0,25mM和50mM葡萄糖的三种无血清培养基中培养血管内皮细胞(衍生自人的主动脉)。培养24小时后，检测培养上清中MMP-1的浓度。
将每种样品与下组比较，该组在添加葡萄糖之前30分钟时加入100ng/ml HGF。
上清中MMP-1浓度随葡萄糖浓度的减少而明显减少，并且显示给予HGF可以抑制MMP-1的减少。结果见图5。
参考例3HGF对血管内皮细胞的影响(与血管生成相关的转录因子ETS-1的改变)
血管内皮细胞的培养如参考例2所述进行，并检测所述细胞中转录因子ETS-1 mRNA的表达。以对照组内皮细胞的ETS-1 mRNA作为100％，HGF处理组的血管内皮细胞以葡萄糖依赖方式减少。另一方面，HGF处理组血管内皮细胞与对照组相比，ETS-1 mRNA的表达水平相同或更高(P＜0.01)。结果见图6。
如上所述，血管内皮细胞在高葡萄糖浓度下MMP-1(血管再生所必需的一种基质裂解酶)表达减少，转录因子ETS-1(其在血管再生过程中表达并增加)mRNA的表达减少。
结果表明，在高葡萄糖浓度条件下，几乎不发生血管再生。另一方面，血管内皮细胞在高浓度葡萄糖条件下加入HGF，MMP-1表达和ETS-1mRNA的表达显著增加。因此，这些结果表明HGF使血管生成更容易。
产业适用性糖尿病引起下肢局部缺血的治疗制剂以HGF基因做为有效成分，它可以使伴有HGF表达减少之糖尿病缺血疾病的患处特有的不良血管再生得到改善，并且显示了显著的血管再生效应。所以，它可通过增加局部缺血患处的血流而使病情好转。而且，本发明的治疗制剂可以根据病人病情多次给药，从而刺激血管生成。所以，根据这些效应，本发明的治疗制剂有可能治疗糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神经病和糖尿病缺血性心肌梗塞。
权利要求
1.一种糖尿病缺血疾病的治疗制剂，它包含肝细胞生长因子(HGF)作为有效成分。
2.权利要求1的治疗制剂，其用于缺血部位给药。
3.权利要求1或2的治疗制剂，其中所述糖尿病性局部缺血疾病选自糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神经病或糖尿病缺血性心肌梗塞。
4.权利要求3的治疗制剂，其中所述糖尿病性局部缺血疾病是糖尿病性下肢局部缺血。
5.权利要求1-4中任何一项的治疗制剂，其用于向缺血部位的肌肉中给药。
6.权利要求1-5中任何一项的治疗制剂，其中所述HGF基因为仙台病毒(HVJ)-脂质体的形式。
7.权利要求1-6中任何一项的治疗制剂，需要时可重复给药。
8.权利要求1-7中任何一项的治疗制剂，其中HGF基因的给药量至少为50μg。
9.一种治疗糖尿病性局部缺血疾病的方法，其包括将HGF基因转移至人体内。
10.权利要求9的方法，其中将HGF基因给药至局部缺血部位。
11.权利要求9或10的方法，其中糖尿病性局部缺血疾病选自糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神经病或糖尿病缺血性心肌梗塞。
12.权利要求11的方法，其中所述糖尿病性局部缺血疾病为糖尿病性下肢局部缺血。
13.权利要求9-12中任何一项的方法，其中将HGF基因给药于局部缺血部位的肌肉中。
14.权利要求9-13中任何一项的方法，其中所述HGF基因为仙台病毒(HVJ)-脂质体的形式。
15.权利要求9-14中任何一项的方法，其中HGF基因可根据需要重复给予。
16.权利要求9-15中任何一项的方法，其中HGF基因的给药量至少为50μg。
17.HGF基因在制备糖尿病性局部缺血疾病的治疗制剂中的应用。
18.权利要求17的应用，其中糖尿病性局部缺血疾病选自糖尿病性下肢局部缺血、糖尿病缺血性神经病或糖尿病缺血性心肌梗塞。
19.权利要求18的应用，其中所述糖尿病性局部缺血疾病为糖尿病性下肢局部缺血。
20.权利要求17-19中任何一项的应用，其中所述HGF基因为仙台病毒(HVJ)-脂质体的形式。
21.权利要求17-20中任何一项的应用，其中HGF基因的给药量至少为50μg。
全文摘要
在糖尿病缺血部位给予HGF(肝细胞生长因子)基因可以促进糖尿病缺血部位的血管生成,并因此使局部缺血疾病康复。
文档编号A61K9/127GK1339973SQ00803835
公开日2002年3月13日 申请日期2000年10月26日 优先权日1999年10月29日
发明者森下竜一, 荻原俊男 申请人:医学基因生物科学株式会社