专利名称：使用α－MSH及其衍生物的基因治疗系统和方法
技术领域：
本发明涉及基因治疗领域。
与本发明相关的背景技术多种疾病由遗传或环境因素诱发的缺陷基因而导致。这些疾病的例子包括各种不同形式的癌症、血友病、或低密度脂蛋白(LDL)受体缺乏症。基因治疗或基因替换治疗通过替换、增强、或抑制这些缺陷基因来实现疾病的根除。
引入治疗基因或核酸的常用载体包括病毒载体和非病毒载体。虽然病毒传递系统被视为在将基因引入细胞时是最有效的，但是因为可能会引起炎症或免疫反应，其应用受到限制。Forbes，S.J.，Review Article.Gene Therapy in Gastroenterology and Hepatology，Aliment Pharmacol.Ther.11823-826(1997).
最近，因为志愿者Jesse Gelsinger在接受宾夕法尼亚大学人类基因治疗研究所的临床基因治疗试验时死亡(1999年9月17)，加剧了对基因治疗的实施和安全性的争论。该实验打算借助修饰的腺病毒载体来治疗鸟氨酸转氨基甲酰酶(transcarbmylase)(OTC)。然而，对Gelsinger施用该载体“引发了罕见的和致死性的免疫系统反应，导致多器官衰竭和死亡”。Preliminary Findings，宾夕法尼亚大学卫生系统人类基因治疗研究所，1999年12月2日，<http//www.med.upenn.edu/ihgt/findings.html>。虽然腺病毒载体在若干方面优于其他病毒载体(其可以感染多种细胞且不像逆转录病毒载体那样限制于复制细胞)，但是其会激活免疫系统(从Gelsinger的案例可以看出)。这样，不构成生命威胁的起始剂量或采用重复引入的方式可能疗效一般。参见Forbes，S.J.，supra。
并且，基因治疗可能会引起的免疫应答并不限于所用的载体。因为载体会引入遗传序列，该序列编码对宿主可看作是“外源”的蛋白质、多肽、酶，因而对表达该序列的细胞的免疫应答和表达的产物就限制了治疗的效力。例如，在使用凝血因子VIII或凝血因子IX基因作为治疗基因的血友病治疗中，生成的抗新表达蛋白的抗体会限制治疗的效力。Forbes，S.J.，supra；还可参见Herzog，R.，Problems and Prospects in Gene Therapy for Hemophilia，CurrentOpinions in Hematology，5321-326(1998)。细胞毒性T细胞如嗜中性细胞也会攻击那些表达“外源”基因或病毒载体基因的细胞，从而在一定持续时间内也限制基因治疗的效力。
这样，需要通过减轻免疫系统的某些有害影响来提高基因治疗的安全性和效力。
发明简述本发明涉及用α-MSH和/或其衍生物作为基因治疗的辅助物。在本发明的一个方面，基因治疗载体包括表达α-MSH和/或其衍生物的核酸序列，而炎症或免疫应答基因的启动子可以控制其表达。所述序列也可以借助于内部核糖体进入位点序列与治疗基因一起表达。在本发明的另一方面，药理有效量的α-MSH和/或其衍生物可以在携带目的基因的基因治疗载体施用之前、之后、和/或同时施用。发明详述以下所引文献全文结合于此作为参考。本发明涉及使用α-促黑激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)和/或其衍生物作为辅助治疗的基因治疗方法和系统。因为α-MSH和/或其衍生物有消炎和退热作用，其可以减轻基因治疗载体或表达蛋白引起的患者的炎症反应，从而辅助基因治疗的实施。与其他免疫抑制剂不同，α-MSH和/或其衍生物还有抗菌效力，可以同时保护身体免受感染，并限制免疫系统的负效应。
在本发明的一个方面，可以在携带目的治疗基因或核酸的基因治疗载体施用之前、或之后施用药理有效量的α-MSH和/或其衍生物。另外，α-MSH和/或其衍生物也可以与基因治疗载体一起混合施用。基因治疗载体可以包括如腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、或腺病毒相关病毒(AAV)载体等病毒载体，和如脂质体、磷酸钙、抗体，或基于受体的转移载体、电穿孔、或核酸直接注射等非病毒载体。
在本发明的另一方面，基因治疗载体携带一段DNA分子，该分子包括可以在宿主细胞内表达α-MSH和/或其衍生物的序列。利用常用的分子克隆技术可以将α-MSH和/或其衍生物的基因序列克隆进病毒载体或质粒表达载体。结构启动子如巨细胞病毒(CMV)启动子或诱导启动子可以促使其表达。优选地，该诱导启动子利用炎症基因启动子，如白介素启动子(特别是IL-6启动子)，或者也可以利用补体系统基因启动子。其他的炎症基因启动子包括TNF-α或NF-κB效应元件启动子。
携带α-MSH和/或其衍生物的基因治疗载体也可以携带合适的目的治疗基因或核酸。这样，α-MSH和/或其衍生物的表达就定位在目的治疗基因表达的区域。α-MSH和/或其衍生物的定位效应可以抑制局部的炎症反应而不会危害宿主全身的免疫系统，其也可以保护整合了基因治疗载体的细胞不受嗜中性细胞或T细胞的炎症细胞毒作用的伤害。在本发明的一个优选具体实施例中，在携带感兴趣的治疗基因的相同DNA载体上，克隆α-MSH和/或其衍生物基因和相关的启动子可以实现这一共定位效应。
此外，α-MSH和/或其衍生物也可以通过内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site，IRES)进行表达。IRES序列可以放在治疗基因和α-MSH和/或其衍生物基因之间。这样，这两个基因可以借助同一个启动子作为二顺反子mRNA转录物进行转录，并且该二顺反子mRNA又可以在5’端和在IRES序列同时翻译。因为来自治疗基因的蛋白和α-MSH和/或其衍生物都产生自单一转录物，那么很可能一个单细胞就可以表达这两种蛋白。IRES序列和载体都是商品化的，如来自Clontech Laboratories，Palo Alto，California(pIRES，cat#6028-1)。
进一步地，利用多内部核糖体进入位点(IRES)序列构建的成串的多α-MSH和/或其衍生物基因可以增加α-MSH和/或其衍生物的产量。克隆在α-MSH和/或其衍生物基因上游的分泌信号肽也可以将α-MSH和/或其衍生物转运到需要的细胞外环境。这种分泌信号肽的例子包括表皮生长因子信号肽、碱性成纤维细胞生长因子信号肽、或白介素6信号肽。
α-MSH是一段保守的(ancient)含13个氨基酸的肽，SYSMEHFRWGKPV(α-MSH(1-13))，由较大前体分子阿黑皮素原(propiomelanocortin)经翻译后加工而获得。其与同样来自阿黑皮素原的促肾上腺皮质激素(“ACTH”)共有该1-13个氨基酸序列。多种细胞可以分泌α-MSH，包括垂体细胞、单核细胞、黑素细胞、及角质形成细胞。其也可以在大鼠皮肤、人体表皮、或完整的和切除垂体的大鼠的胃肠道的粘膜屏障中发现。同时参见，Eberie，A.N.，The Melanotrophins，Karger，Basel，Switzerland(1998)；Lipton，J.M.，et.al.，Anti-inflammatory Influence of the Neuroimmunomodulatorα-MSH，Immunol.Today 18，140-145(1997)；Thody，A.J.，et.al.，MSHPeptides are Present in Mammalian Skin，Peptides 4，813-815(1983)；Fox，J.A.，et.al.，Immunoreactive α-Melanocyte Stimulating Hormone，Its Distribution in the Gastrointestinal Tract of Intact andHypophysectomized Rats，Life.Sci.18，2127-2132(1981).
已知α-MSH及其衍生物有强退热和消炎作用，同时其几乎没有毒性。它们在体外可以减少宿主细胞促炎介体(proinflammatorymediator)的产生，并且也可以降低炎症模型动物的局部和全身的炎症反应。α-MSH序列的核心部分(4-10)，例如，有学习和记忆的行为作用，但是几乎没有退热和消炎活性。相反地，退热及消炎活性的活性信息序列位于α-MSH的羧基末端氨基酸序列，即赖氨酸-脯氨酸-缬氨酸(Lys-Pro-Val或KPV)。该三肽分子在体外和体内都具有活性，这些活性类似于母体分子的活性。α-MSH和/或其衍生物的消炎活性在以下两个专利和文献中有所披露，这些文献结合于此作为参考美国专利第5,028,592号(1991年7月2日授权Lipton，J.M.，题为Antipyretic and Anti-inflammatory Lys Pro ValCompositions and Method of Use)；美国专利第5,157,023号(1992年10月20日授权Lipton，J.M.，题为Antipyretic andAnti-inflammatory Lys Pro Val Compositions and Method of Use)；同时参见Catania，A.，等，α-Melanocyte Stimulating Hormone in theModulation of Host Reactions，Endocr.Rev.14，564-576(1993)；Lipton，J.M.等，Anti-Inflammatory Influence of the Neuroimmunomodulatorof α-MSH，Immunol.Today 18，140-145(1997)；Rajora，N.，等，α-MSHProduction Receptors and Influence on Neopterin，in a HumanMonocyte/macrophage Cell Line，J.Leukoc.Biol.59，248-253(1996)；Star，R.A.，等，Evidence of Autocrine Modulation of MacrophageNitric Oxide Synthase by α-MSH，Proc.Nat’l.Acad Sci.(USA)92，8015-8020(1995)；Lipton，J.M.，等，Anti-inflammatory Effects of theNeuropeptide α-MSH in Acute Chronic and Systemic inflammation，Ann.N.Y.Acad.Sci.741，137-148(1994)；Fajora，N.，等，α-MSHModulates Local and Circulating tumor Necrosis Factor-α inExperimental Brain Inflammation，J.Neuroosci，17，2181-2186(1995)；Richards，D.B.，等，Effect of α-MSH(11-13)(lysine-proline-valine)onFever in the Rabbit，Peptides 5，815-817(1984)；Hiltz，M.E.，et.al.，Anti-inflammatory Activity of a COOH-terminal Fragment of theNeuropeptide α-MSH，FASEB J.3，2282-2284(1989)。
α-MSH衍生物包括但不限于具有氨基酸序列KPV(α-MSH(11-13))的肽、具有MEHFRWG(α-MSH(4-10))的肽、或具有HFRWGKPV(α-MSH(6-13))的肽。这些衍生物还可以包括上述肽的同二聚体或异源二聚体，其可以通过在任何上述多肽的N末端连接半胱氨酸残基并使两个多肽的半胱氨酸形成二硫键而获得。这些肽也可以是N末端乙酰化的和/或C末端酰胺化的。
替换或去除某些氨基酸残基也可以产生有生物功能性的衍生物，而不会改变这些肽的效力。例如，α-MSH序列的稳定可以较大地提高该肽的活性，而将L-氨基酸替换为D-氨基酸会提高或降低这些肽的效力。已知对黑素细胞及黑素瘤细胞有显著生物活性的一种稳定的α-MSH的类似物[Nle4，D-Phe7]-α-MSH在退热方面的效力比母体肽强约10倍。进一步地，在α-MSH(11-13)序列的羧基末端添加氨基酸可以降低或增加其退热的效力。加入甘氨酸，形成的10-13序列会略微降低其退热效力；形成的9-13序列几乎没有效力，而形成的8-13序列的效力强于11-13序列的效力。目前已知Ac-[D-K11]-α-MSH 11-13-NH2具有与三肽α-MSH(11-13)的L形式基本相同的效力。然而，在三肽的12位以D-脯氨酸替换会导致其失活。参见如，Holdeman，M.等，Antipyretic Activity of a Potentα-MSH Analog，Peptides 6，273-5(1985)。Deeter，L.B.，等，AntipyreticProperties of Centrally Administered α-MSH Fragments in the Rabbit，Peptides 9，1285-8(1989).Hiltz，M.E.，Anti-inflammatory Activity ofα-MSH(11-1 3)AnalogsInfluences of Alterations in Stereochemistry，Peptides 12，767-71(1991)。
通过替换具有近似亲水值(hydropathic values)的氨基酸也可以得到生物功能等同物。因而，例如，异亮氨酸和亮氨酸，其分别具有亲水值+4.5和+3.8，可替换亲水值为+4.2的缬氨酸，并得到相似生物活性的蛋白质。另一方面，对于亲水值为负值的氨基酸，赖氨酸(-3.9)可替换精氨酸(-4.5)，等等。一般说来，人们认为在氨基酸的亲水值是在被替换的氨基酸的约+/-1亲水值单位的范围内的情况下，氨基酸可被成功替换。
对于α-MSH和/或其衍生物的抗菌性能，其已描述在PCT申请No.PCT/US00/06917中(公布号WO 00/59527，题为Anti-microbialAmino Acid Sequences Derived from alpha-Melanocyte StimulatingHormone，2000年3月17日由发明人Catania，A.和Lipton，J.提交，并要求题为Antimicrobial Amino-Acid Sequences Derived fromAlpha-Melanocyte Stimulating Hormone的美国临时申请No.60/126,233(1999年3月24日提交)的优先权)。以上公布的PCT和临时申请结合于此作为参考。
可以用常用的固相肽合成技术和反相高效液相色谱技术制备和纯化α-MSH和/或其衍生物。进行基因治疗的患者可以通过注射或口服方式接收药理有效量的α-MSH和/或其衍生物。可以根据具体的基因治疗部位选择如静脉、腹腔内、皮内等注射方式。患者在施用了α-MSH和/或其衍生物以后，可以继续在医生指导下按常规基因治疗程序施用药理有效量的携带目的治疗基因或核酸的基因治疗载体。如果需要的话，可以在施用基因治疗载体后施用附加量的α-MSH和/或其衍生物。
或者，基因治疗载体的转运混合物也可以包括药理有效量的α-MSH和/或其衍生物，两者同时施用。
常用的寡核苷酸合成技术可以与其他技术一起用于制备和纯化表达α-MSH和/或其衍生物的基因序列。合成互补的寡核苷酸并退火可以获得能用于克隆的双链DNA分子。借助生物工程技术可以在每一寡核苷酸末端添加含有合适的限制性酶切位点的附加序列。优选地，α-MSH序列下游的寡核苷酸序列含有一个终止密码子(TAG)。
此外，用多聚酶链式反应，可以合成一段相应于IL-6 cDNA的信号肽的序列，核苷酸33至120个(Genbank Accession No.J03783)，并可以将其克隆到载体上，如pBluescript KS(Stratagene，San Diego，CA)。相似地，用含有适当匹配的限制性酶切位点的寡核苷酸也可以合成IL-6或NF-κB的启动子，并克隆到携带信号肽的pBluescript的上游。利用标准的限制性酶切和DNA连接作用，α-MSH或其衍生物的序列可以连接于该信号肽和启动子。
如果需要一段内部核糖体进入位点(IRES)序列，以上的寡核苷酸序列可以包括这样一段序列，或者其也可以整合到PCR引物上，并通过常用的PCR技术连接。或者α-MSH和/或其衍生物可以克隆到Clontech Laboratories的pIRES载体上。如果需要的话，可以用多倍IRES序列构建多倍α-MSH和/或其衍生物。可以用如脂质体、电穿孔、或基因枪等非病毒载体，将有效量的含有这些构建序列和含目的治疗基因的表达质粒直接注射或引入患者。
另外，可以使用标准的限制性内切酶和连接技术、平端克隆、或PCR技术，将α-MSH和/或其衍生物的构建序列插入合适的复制缺陷逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、或腺病毒相关病毒载体。组装细胞系借助于辅助病毒可将载体DNA组装进病毒颗粒以用于基因治疗。
可首先测定重组病毒的效价，然后将合适量的病毒颗粒引入患者或宿主。当然，除了α-MSH和/或其衍生物以外，病毒载体还可以已经含有治疗基因或核酸。
一旦重组病毒引入细胞，这些细胞可表达α-MSH和/或其衍生物，进而抑制炎症。细胞表达的α-MSH通过抑制NF-κB活性而实现消炎作用已经有所报道Ichiyama，等，Autocrineα-Melanocyte-Stimulating Hormone Inhibits NF-κB Activation inHuman Glioma，J.Neurosci.Res.58684-689(1999)，其结合于此作为参考文献。
应当明了的是，对以上本发明实施例进行修改并不偏离本发明的精神。应当进一步明了的是，各实施例可以单独实施或与其他实施例相互结合实施。
权利要求书(按照条约第19条的修改)18.根据权利要求11所述的方法，其中所述基因治疗载体是一个病毒载体。
19.根据权利要求11所述的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体。
20.根据权利要求3所述的基因治疗系统，其中所述药理有效量的赖氨酸-脯氨酸-缬氨酸是在发炎或免疫应答基因启动子控制下进行表达。
21.根据权利要求20所述的基因治疗系统，其中所述发炎基因启动子是白介素6的启动子。
权利要求
1.一种基因治疗系统，包括至少携带一治疗基因或核酸的基因治疗载体；以及与所述基因治疗载体结合的药理有效量的α-MSH和/或其衍生物。
2.根据权利要求1所述的基因治疗系统，其中所述药理有效量的α-MSH和/或其衍生物可以在所述基因治疗载体施用之前、之后、或同时施用。
3.根据权利要求1所述的基因治疗系统，其中所述药理有效量的α-MSH和/或其衍生物由所述基因治疗载体携带的核酸表达。
4.根据权利要求3所述的基因治疗系统，其中由所述基因治疗载体携带的所述核酸包括治疗基因或核酸。
5.根据权利要求3所述的基因治疗系统，其中所述药理有效量的α-MSH和/或其衍生物是在发炎或免疫应答基因启动子控制下进行表达。
6.根据权利要求5所述的基因治疗系统，其中所述发炎基因启动子是白介素6的启动子。
7.根据权利要求3所述的基因治疗系统，其中所述药理有效量的α-MSH和/或其衍生物由含至少一个内部核糖体进入位点序列的核酸表达。
8.根据权利要求3所述的基因治疗系统，其中所述药理有效量的α-MSH和/或其衍生物由含至少一个分泌信号肽的核酸表达。
9.根据权利要求1所述的基因治疗系统，其中所述基因治疗载体是一个病毒载体。
10.根据权利要求9所述的基因治疗系统，其中所述病毒载体是腺病毒载体。
11.一种基因治疗方法，包括在施用携带至少一治疗基因或核酸的基因治疗载体之前、之后、或同时，施用药理有效量的α-MSH和/或其衍生物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述药理有效量的α-MSH和/或其衍生物由所述基因治疗载体携带的核酸表达。
13.根据权利要求11所述的方法，其中由所述基因治疗载体携带的所述核酸包括治疗基因或核酸。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述药理有效量的α-MSH和/或其衍生物是在发炎或免疫应答基因启动子控制下进行表达。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述发炎基因启动子是白介素6的启动子。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述药理有效量的α-MSH和/或其衍生物由含至少一个内部核糖体进入位点序列的核酸表达。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述药理有效量的α-MSH和/或其衍生物由含至少一个分泌信号肽的核酸表达。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述基因治疗载体是一个病毒载体。
19.根据权利要求11所述的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体。
全文摘要
本说明书披露了α－MSH和/或其衍生物作为基因治疗的辅助治疗的应用。在一方面，基因治疗载体包括表达α－MSH和/或其衍生物的核酸。发炎或免疫应答基因的启动子可以控制α－MSH和/或其衍生物的表达。这些序列也可以和治疗基因借助于内部核糖体进入位点序列一起表达。在另一方面，可以在施用携带目的基因的基因治疗载体之前、之后、或同时，施用药理有效量的α－MSH和/或其衍生物。
文档编号A61P43/00GK1429073SQ01808571
公开日2003年7月9日 申请日期2001年4月27日 优先权日2000年4月28日
发明者詹姆斯·M·利普顿, 安娜·P·卡塔尼亚 申请人:曾根公司