专利名称：用于恶性肿瘤基因治疗的增殖和肿瘤细胞特异性基因操纵系统的制作方法
用于自中瘤基因治疗的增殖和肿瘤细胞特异性基因^^统
技术领域：
本发明属于生 术领域，具,及一种高度增殖特异',组真核细胞启动子(PCNATAI); ^以PCNATAI作为基因,的启动子，由肿瘤细胞特异鹏动子启动彭i的Cre重会SH激活，以高度增殖特异性和肿瘤细胞特异t4)5S^M莫式，启动外源性治疗基因在恶倒中瘤细胞中高^#异性皿的敦亥细 统；以^ffl该操l^统各皿部分构建的相应^M细胞表达质粒载体、彭鹏病毒穿舰粒载体和彭孤彌毒^iWo
背景M恶'鹏中瘤^^，害人类 的5^疾病，在全世界人口死亡原因中，第三，自2006年起恶倒中瘤已誠为我国城乡居民死亡的首要原因。目前恶倒中瘤的治疗仍采用手术切除为主，放、化疗为辅的综合治疗方法。因恶倒中瘤呈浸润性生长，手术不易^t刀；放、化疗不仅难以达到满意的疗效，还^患者带3fc 隹以耐受的全身性毒、副作用；故寻求有效的治疗fm径势在必行。近来的研，示，基因治g可能成为未来恶'创中瘤治疗的有效手段，并展示出诱人的光明前景，但高效,和可靠的安全性是决定基因治疗成功的先决条件。然而，现有基因治疗载軒但,效率低，且特异'隨；既不能在肿瘤细胞中高效,，又不能将治疗基因的，严格限定于肿瘤细胞中；因而不但治疗效果不理想，还^t成肿瘤周围组织中乃至全身多种正常细胞的损伤，这是制约恶倒巾瘤基因治疗的瓶颈。因此，构建安全、高效細巾瘤细胞特异性治疗基因^ii^体是恶ttl中瘤基因治疗亟,决的问题111。
高度增殖是所有恶倒中瘤细胞的共同特征，耐中瘤周围组织的正常细胞绝大多数处于非增殖状态。人增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antig叫PCNA)为全增殖期细胞特异性高,的标志物，^^有恶倒中瘤中的阳性敏糊为100%，其^i7K平与肿瘤的恶性禾SSS正比，耐中瘤周围组织中处于非增殖状态的正常细胞不敏PCNAP1。说明恶魁中瘤细胞中有高效撒活PCNA基因启动子的微环境；肿瘤周围组织中处于非增殖状态的正常细胞内不具备欽活PCNA基因启动子的斜牛；PCNA基因的启动子为严格的增殖特异性启动子，^f^7K平与细胞的增殖活i4^肿瘤的恶性禾號成正相关，^"肿瘤特异性基因治CT^殖特异性的要求。故利用PCNA基因启动子启动夕卜源性治疗基因的皿，不但可i^卜源性治疗基因在恶糊中瘤细胞内高效,，还可将外源性治疗基因的鋭限定在处于高度增殖状态的恶性肿瘤细胞内。ffl3l这种增殖特异性的限制，既可^^卜源性治疗基因的表达能有效剎穷恶倒中瘤细胞，又可防ih^卜源性治疗基因损伤处于非增殖状态的正常细胞。
目前已明确PCNA基因启动子属于典型的看,因启动子，，苷,列的-900^60区段中(启动子区DNA序列编号以緑起始位点的蹄酸编号为+1，起始位点上游邻近核苷酸编号为-1，并向5'方向编号，值依 增；起始位点下游邻近核苷酸编号为+2，并向3'方向编号依次递增)，多种反式作用因子的结合位点。我们用增强绿荧光蛋白(EGFP)报导系统，对PCNA基因启动子^g^ff列-900^64区段在多种人恶幽中瘤细iam及体外i歸大鼠M^,细胞中的,效斜卩增殖特异'l4a行了检测。初,实，用携带PCNA基因启动子-900^f64区段核苷,列及受其调控的下游EGFP ^t基因的獻亥细i^iM粒转染人恶l^中瘤细鹏后，顺$娘动报道蛋白EGFP的表达；而转染该真核细胞表达质粒的体外培养大鼠星形胶质细胞几乎不表达EGFP。以上结果说明PCNA基因启动子核苷,列的-90(M^4区段具备了必要的增殖特异性和緑活性。对其进行合理的优化麟)I贿可倉淛备出一^S用于多种恶倒中瘤基因治疗的广谱增殖特异't^a动子。我们^3l分段m，进一步确定，苷,列的-778^61区段不但增殖特异性最好，舰下游受其调控基因的録启动活性最强，可作为以增殖特异性模式启动夕卜源性治疗基因皿的核心启动子。
体内具有自糊胞更新能力的正常组织内都含有一定数量的特定干细胞(如骨M3tlfiL干细胞、表皮基廳细胞、毛囊的^ffl胞等)，群且织更M:程中作为种子细胞，不 1分裂增歹舰定向分化形成新的成熟细胞，用以替补衰老凋亡的细胞，在维擀且织中各种正常细胞数量的动拼衡方面具有;^T^ft的作用[31。如J^述，虽然PCNA基因启动子在处于非增殖状态的正常细胞内不能启动外源性治疗基因,，但因所有正常干细胞也都处于增殖活跃状态，用该启动子启动夕卜源性治疗基因鋭仍有可能会对这些正常千细lfi^生不良影响。故单纯解决了外源性治疗基因在恶粗中瘤细胞中就的增殖特异性，还不能傲錢因治疗的乡树安全。
已知^S倒中瘤细胞丽敬期转的蛋白标志物，如乳&镳细胞特异性就Her-2蛋白[41，肝细M细胞特异性皿HIP/PAPl和甲胎蛋白(AFP)^，;^癌细胞特异性皿癌Mjt原(CEA)等171。而另夕卜蝶倒中瘤细胞可高^ii其起源组织细胞棘的蛋白标志物，如B细胞性恶性淋巴瘤细胞高皿正常B淋巴细胞^W的蛋白标志物CD20181，，自细,源肿瘤高,正常星形皿细胞,的蛋白标志物，纤维酸性蛋白(GFAP)91，前列腺癌细胞高，正^列腺上皮细胞特有的蛋白标志t/fr列腺特异',抗原(PSMA)等网。以上事实说明i^肿瘤细胞有激活各自特异性蛋白标志物编码基因启动子的能力，也即这些启动子是不同恶'啦中瘤细胞的特异性启动子。因此，如能构建一个用PCNA基因启动子启动目的基因駄，用肿瘤细胞特异性启动子启动反式调控因，逸，由反式调控因子调控PCNA基因启动子,活性的目的基因皿操纵系统，既刚鈔卜源性治疗基因在恶翻中瘤细胞中高效敏，又可MilPCNA基因启动子增殖特异性和肿瘤细胞特异性启动子细胞特异性的鹏限制，i^卜源性治疗基因的敬M^格限制在恶倒中瘤细胞内，就可有效防必卜源性治疗基因对全身增殖期和非增殖期正常细,生4瞎异性刹别乍用，以确鹏倒中瘤基因治疗的娃性。
Crc重组酶(Crerecombinase,Cre) ;1^源于P1噬菌体的I型拓扑异构酶，可iffii辦异性识别元件LoxP催化DNA的位点特异性同源重组。该SK崔化效率高，短时间内即可超臓物和产物的动拼衡，且催ft^程不需對顿倉遣辅助因子。LoxP元件为^34bp的DNA序列，其两端
4为13bp的反转Sfij^列，中间为8bp的间隔序列，，列决定了LoxP元件的方向性，并进一步决定了Cre介导DNA重组的方式。当两个LoxP元件6^f向相同时，两个LoxP元件之间的序列在Cre的催化下被环^l^]除，使其上下游核苷,列对接重组叫。Cre-LoxP系统的高效、特异和稳定性使其成为基因和^fe体修饰的有力工具，可以il31特异性^:il^ Cre重组酶删除LoxP位点间的DNA序列，故可作为杨。、启动子的辅助调縣统。已知在人类基因组中无内源性LoxP元件的核苷,列，将Cr^LoxP系统导入A^织iffl胞不^g^^基因组结构和^t,列改变，所以将Cre-LoxP辅助调縣乡j^于人恶'幽中瘤基因治疗是安全的。
发明内容本发明目的之一是鹏一种高度增殖特异性X+亥细M动子'PCNATAr';本发明目的之二;W^—种由Cre重组酶激活、以高度增殖特异性丰1^调控下 瘤或自 因皿的餓细胞基因操縣统'PCNATAI-LoxP-stop"LoxP";本发明目的;tH^J^"^利用PCNATAI-LoxP-stop"LoxP操縣纖驗卜源性基因以肿瘤细胞特异性和增殖特异性)KS特异性模式在恶性肿瘤细胞中高效就的S^案。同时本发明还以恶性 瘤为例提供了使用方法和实例。
本发明的具体发明内容包括
发明l、 一种高度增殖特异性餓细胞启动子PCNATAI， K^,列如序列表l辦列表2际。
发明2、 一种如发明1所述的高度增殖特异性真核细胞启动子PCNATAI的获得方法，其待点是以AK生型增殖细胞核抗原PCNA位*核苷酸序列为原型，并对其进行下列两个片段的鹏得到
第一、用腺病毒E1B TATA ^t，,列AGGGTATATAATG取4，生型PCNA启动子区原-29—21位核苷,列；
第二用多数基因M的典型lf^始元件Inr核苷,列CCATTCC取代PCNA启动子区原有的-2—5位核苷,列，同时在其下游形成一个限制性内切酶&c n的识别位点。
发明3、 一种含有发明1所述的启动子PCNATAI、并由Cre重组酶激活、以高度增殖特异性模式调控下齢卜源性治疗基因皿的，细胞基因操m^统PCNATAI-LoxP-stop-LoxP,，苷酸序列如序列表3鹏列表4戶标。
发明4、 一种如发明3所述的真核细胞基因操纵系统PCNATAI-LoxP-stopioxP的获得方法，该方法包括
第一、以权利要求1戶皿的启动子PCNATAI作为i^^,动夕卜源性治疗基因,的核心启动元件；
第二、在启动子PCNATAI下游端插入pBS302质粒的"LoxP-Stop"LoxP"序列作为该操纵系统的,[Sii元件，其中Stop为^llh^列，LoxP为Cre重组酶的特异性识别序列。
发明5、 一种利用发明3臓的餓细鹏因操!^统PCNATAI-LoxP-StopioxP在恶幽中瘤细胞中以增殖和肿瘤细 3特异性模式高效操缀卜源性抑瘤或自 因皿的方法。即在恶性肿瘤细胞中翻中瘤细胞特异性 模式诚鄉Cre重乡鹏，使;til3i同源重组机制删除^lt异性识别位点之间的^^终，列Stop，从而解除Stop序列对PCNATAI启动的^31程的阻遏作用，最^^下齢卜源性抑瘤基因或自雜因在PCNATAI的启动下在恶魁中瘤细胞中以肿瘤细胞特异舰增殖特异^S特异性模式高效、特异性敏。
注*启动子区DNA序列编号以ff^(台位点的蹄,号为+l。起始位点上游邻近^^,号为-l，并向5'方向编号f6^值依7:fcii增；起始^^下游邻近^MS号为+2，并向3'方向编号依^iii增。本发明的储和积极鄉
本发明提供了一个指导外源性治疗基因在恶倒中瘤细胞中高效、特异性泰逸的^#^案，其中包括 一个优^S组的增殖特异性启动子， 一个基于该重组启动子的调节外源性抑瘤或自皿因魏對亥细鹏纵系统，以及利用该系统启动夕卜源性抑瘤或自然基因在恶粗中瘤细胞中高效、特异性就的^^案。
本发明的技术方案是以增殖特异'鹏动子PCNATAI作为启动夕卜源性治疗基因鋭的杨1>元件，舰CreioxP同源重组机制将肿瘤细胞特异性启动子的肿瘤细胞特异性和PCNATAI的增殖特异性有机结合，共同实5^卜源性抑瘤或自 因在恶糊中瘤细胞中的高效、特异性皿。
与现有^ffi比，本发明的优点是
(1) 对外源性治疗基因泰&的调控具有严格的增殖特异性。本发明以重组增殖特异性启动子
PCNATAI作为扬O启动元件，以增殖娜模式启动夕卜源性基因在处于高度增殖状态的恶倒中瘤细胞和肿瘤干细胞中高效、特异性泰ii。 PCNATAI改建于PCNA基因启动子^^77841区段，在改建重会做程中弓l入了对緑效賴有正性调节作用的&彌毒E1B启动子的TATA M典型的^^始元件Inr序列，定性定量检测结果显示PCNATAI不仅保留了野翅PCNA基因启动子的增殖特异性，而且fm^效率显著提高，可满足恶倒中瘤基因治疗对启动子增殖特异'隨转录效率的要求(详见 例1及2)。
(2) 实现了肿瘤细胞特异性与增殖特异性的有 合，傲卜源性治疗基因在恶倒中瘤细胞内高效特异性泰ii。在以PCNATAI为核心启动元件的同时，PCNATAI-LoxP-stop"LoxP操纵系统尚以两侧装备同向LoxP位点的转^mh^列(stop)作为P腿下游基因,的阻遏元件，并fflii以肿瘤细胞特异鹏动子介导Cre重组酶的^ii将肿瘤细胞特异性与增殖特异性有机结合，不i!M著增加了外源性治疗基因的，效率，还i鈔卜源性治疗基因的皿M^格限定在恶倒中瘤细胞内，既可显著提高恶倒中瘤基因治疗的疗效，又可保P錢因治疗的安全性。
(3) 翻范围广、实用性强、舰前景广阔。活跃增殖^0f有恶鹏中瘤细胞贿的生物学行为特征，^K需^S当棚中瘤细胞特异腿动子启动Cre ^iS^择翻A3S当的外源性治疗基因，即可将聘^l^^ffl于不同恶幽中瘤的基因治疗，因此 有很好的普适性和实用价值，細前景广阔。
图1是真核细ffiS纵系统PCNATAI-LoxP-Stop-LoxP物理图谱。
图2 ^中瘤细胞特异性和增殖特异性基因^i操,统的工作原理。
本发明的原遼和具体理论依据
(1) PCNATAI的g^t策略野4MPCNA基因启动子即为一严格的增殖特异'鹏动子，但定性和定量检测分析显^启动子的启动效^S低，尚不能完全满M治疗基因,强度的需要。核苷^)￥列分析显示，野^MPCNA基因启动子的结构类似^"錢因启动子，无典型的TATA盒，但其-33—21区核苷酸序列AGGGTGAGAGCGC与腺病毒E1B基因启动子的TATA盒AGGGTATATAATG有一定的序列同源性;itt^卜，^^g始位点周围的核苷,列gCA+in^也与典型的Inr核苷,列PyPyA+lNTPyPy不完全相符(A+l ^^,起始位点的腺嘌呤碱基，Py标嘧啶碱基G或C， N表示任意碱基，标施者为与Inr典辦列不相符的鹏)。TATA盒和Inr是餓细胞録的关觀件，对提^^7K平和稳定^f^始位点均有觀作用1121。因此，在启动子鹏中我们引入了l7彌毒E1B基因启动子的TATA盒，并利用DNA定点诱变技^l每转录起始位点周围核苷^)^列麟为典型的ta核苷鹏列CCATTCC，同时在^3t31程中弓l入了限制性内切酶5^n的识别位点，以方便DPE的删除和下齢卜源性治疗基因的插入。用增强型ftfe荧光蛋白和双荧光素酶检测系縱行的定性、定量检测结果显示，PCNATAI不仅保留了野生型PCNA基因启动子的增殖特异性，且，TJ905恶14AKM瘤细胞系中的,活性明显高于野生型PCNA基因启动子-778^f61区，为后者的1.6倍。同时PCNATAI与SV40增强子有很好的功能腿性，后者可在麟PCNATAI增殖特异性的同时，使PCNATAI的启动活性提高6倍。
(2) *^作系统的工作原理PCNATAI-LoxP-StoivLoxP操纟M统由两个基本元件构成， 一为启动子PCNATAI，为该操纵系统中启动下游基因转录的核心启动元件;一为LoxP-StopLoxP序列，其来自于美国Invitogen公司的商业倾粒pBS302，其中的Stop序歹伪緑终膀列，能有效终止PCNATAI启动的^31程，故为该操纵系统的^:fflji元件。故PCNATAI-LoxP-Stop-LoxP操纵系统的撒活需，个方面的条件(M主细胞处于高度增殖状态，使PCNATAI启动子具W^活性；離主细胞可反式Jii共Cre重组酶。鉴于恶蹈中瘤细MI中瘤干细胞均处于活跃增殖状态，PCNATAI启动子具皿高的,活性，^K需采用肿瘤细胞特异tija动子，如肝细胞癌中的AFP启动子、结肠癌细胞中的CEA启动子、前列I^S细胞中的PSMA启动子、B细胞淋巴瘤细胞中的CD20启动子、恶l4l^t细胞中的GFAP启动子等启动Ge重t鹏的表达，使宿主细胞可以反式麟Cre重OT，后者即可i賜蝶縣统中的LoxP位点，并舰同源重组机制删除LoxP位点间 It^dl^列Stop,解除其对PCNATAI启动的^31程的阻Ji3^呈，使该操l^m统下游的外^^性 抑瘤或自M因以肿瘤细胞特异'l4S增殖特异'I^S特异性泰ii (图2)。而在处于增殖状态的正 常细胞，由刊中瘤细胞特异鹏动子緑活性较低，不能介导Cre重组酶的有效敲，故Stop序 列对PCNATAI启动的^ii程的阻遏作用无法解除，故PCNATAI-LoxP-Stop"LoxP操IR^统调节 的外源性抑瘤或自縫因不能敲；而在肿瘤起源组织的正常细胞，虽肿瘤细胞特异性启动子可 能介导Cre重组酶的表达，但由于正常细胞多处于非增殖状态，故PCNATAI启动子活性较低，亦
无法^^介导下 瘤或自皿因的皿。因这种设刑妙;f有0增殖汰态和非增殖汰态的正常细
胞，均无同时撒活增殖特异鹏动子和肿瘤细胞特异鹏动子的可能性；从而《鈔卜源性治疗基因仅 能在处于高，殖汰态的恶幽中瘤细胞内高效、特异性表达，并^1TM^恶幽中瘤细胞的同时使 正常细胞娜卜源性治疗基因的3粥异I4^劳。 用于本发明的原始生tfMt斗
(1) PCNA基因启动子-778^1区f^ffM^列禾,PCR扩增^7^A基因组DNA获得；
(2) LoxP"StojvLoxP核,列由DNA合) ^直接合成，参照美国hvitogen公司的商业化 质粒pBS302中LoxP-stojvLoxP设计，具体序列见t^g1^^列表3 。
实施例l:
高度增殖特异性，细J^动子PCNArAI的获得方法以人基因组DNA为丰鎌，禾U用聚合 ,式反应(PCR)技术扩增AW翅PCNA启动子的-77^61区，并亚克隆至天根生化禾报有 限公司的商业化T载体pBS-T中，构誠含有野生型PCNA启动子的-778~+61区的重纟顿粒 pBS-PCNAP。以限制性内切酶Aat n及Kpn I齢酶切pBS-PCNAP释放出野翅PCNA启动子 区。iffilDNA合離术合成PCNATAI启动子的-5741区，募33—21区含乐彌毒E1B 基因启动子的TATA盒结构，-2—5区包含典型的Inr结构，其余序列则与野 PCNA启动子的 对鹏列相同，同时在其5'端及3'端分别引入Aatn及KpnI的识别序列。禾佣Aatn及KpnI 消化PCNATAI启动子的-57~+61区后将其插入pBS，PCNAPAat n及Kpn I消化产物，构建成功含 高度增殖特异性真核细胞启动子PCNATAI的重纟1M粒pBS-PCNATAI，并经DNA测序证实其序 列的正确性。
操纵系统PCNATAI-LoxP-stop-LoxP的获得方法利用DNA合^gfe术合成美国Invitrogen公 司商业4tM粒pBS302中的LoxP-stopLoxP核,列，并在其5'端及3'端分别引入限制性内切 酶Spe I及Not I的识别位点。以Spe I及Not I线性化含高度增殖特异性真核细胞启动子PCNATAI的重乡!M粒pBS-PCNATAI，并将Spel及Notl消化的LoxP-stop-LoxP核M^列插A^性ffcM粒中， 构^^含PCNATAI-LoxP-stop"LoxP的重SM粒pBS-PCNATAI-loxP-stop4oxP，并经测序证实其序 列的正确性。
实施例3:
在不同体外,细JjaSm皿中定性检测PCNATAI的g效率
以增强的雜荧光蛋白EGFP基因为报导基因，在不同体外培养细m细鹏中对PCNATAI、 野^MPCNA启动子的-300^f61区(P300)、 ~600~+61区(P600)及PCNATAI g^t原型PCNA 启动子-788~+61区的,效率进行定'慰见察。分别将PCNA启动子-300~+61区、>600~+61区、 -788^+61区及PCNATAI启动子插入质粒载体pEGFP-l (美国Clontech公司)，构，^M粒 p300^EGFP、 p600-EGFP、 pPCNA-EGFP及pPCNATAI-EGFP。用四个重,粒分别转染体外原代 培养大鼠跡^M细胞、Affi肾7乂生化HEK293细胞系、恶't^M瘤细ISmTJ905及U251，继续 i:^72小时后在荧光倒置显微镜下观察EGFP的^&瞎况。结果显示PCNA启动子300^1区 及-600~+61区在各细胞系中,效WS低。在不同体外培养细m细胞系中PCNATAI启动子 及PCNA启动子-788^f61区启动报导基因EGFP表达的效率并不相同，在增殖不活跃的体外原代 培养大鼠,皿细胞中PCNATAI及PCNA启动子-788^61区对EGFP的启动效^J^低，而 在增歹餅常活跃的恶til^瘤细m^TJ905及U251中，PCNATAI及PCNA启动子-78^+61区对 EGFP的启动效率,高，而在增殖活性较活跃的永生^lffl^m HEK293中，PCNATAI及PCNA 启动子-788~+61区对EGFP的启动效率低于其在U251及TJ905细Bfi^、中对EGFP的启动效率， 但高于^S体外i^大鼠原ftM^，细胞中对EGFP的启动效率,证实PCNATAI启动子保留了 PCNA启动子-788^1区转录启动的增殖特异性(部分实验结果见附件图1)。
实施例4:
在不同体外,细J3^B皿中定量检测PCNATAI的^^效率
利用美国Promega公司开发的荧光素謝艮导系统在不同体外培养细胞及细胞系中对PCNATAI 及其,原型PCNA启动子-788^1区检测的,活fKft行定量检测。分另iJ将PCNATAI及PCNA 启动子-788^f61区插入质粒载体pGL3-Basic及pGL3-enhancer ，构建成重组质粒 pGL3-PCNATAI-Basic、 pGL3-PCNA-Basic、 pGL3- PCNATAI-enhancer及pGL3- PCNA"enhancer。 将JdM乡I^粒分别转染体外原代培养大鼠星形,细胞、人胚肾永生化HEK293细鹏及恶性 胶 细皿U251，并以双荧光素酶检测试剂^量检测PCNATAI及PCNA启动子-78"61区 的^活'I4S SV40增强子对J^两启动子增殖特异性的影响和,活性的增强作用。结果显示: 在U251恶14ISM瘤细胞中PCNATAI ,导基因的启动效率为PCNA启动子-78841区的1.6倍，
9际PCNATAI的改3g31程有 娥高了启动子娜导基因表达的启动效率；在U251恶性胶质瘤细 胞中PCNATAI及PCNA启动子-788~+61区M导基因的启动效率分别是，HEK293细胞中对 报导基因启动效率的2.85倍和2.17倍，而在体外培养大鼠跡臓细胞中，PCNATAI及PCNA 启动子-788^1区的,效^J^^低于MI^^瘤细胞系U251及HEK293细胞中的皿效率， 提g^t后，PCNATAI启动子不仅保留了 PCNA启动子-788^1区的增殖特异性，且其增殖 特异性有了进一步提高。财卜，在SV40增强子的作用下，^5i仑PCNA启动子-788^f61区还是 PCNATAI， ^^效,U251及HEK293细胞中均大幅提高，但在体外培养大鼠, 细胞 中无明显变化，^ SV40可与PCNATAI启动子有效协同，既提高了其在增殖细胞中的,效率， 又可鹏其增殖特异性(部分实麟果见附件图1)。
实施例5:
利用PCNATAI-LoxP-StopL(wP^^统介，导基因EGFP在恶m^i细胞中的特异性
駄
将PCNATAI-LoxP-Stop"LoxP操l^^t入EGFP ^f亥^iiM粒pEGFP-l ，构^gfi组, ^M粒pPCNATAI-LoxP-Sto{>LoxP-EGFP。将GFAP启动子与Cre重会lH^r^i码区串联后插 AW除EGFP编码区的^t亥^iiM粒pEGFP-l ，构建成由GFAP介导Cre重组^ii的^t亥, 质粒pGFAP-Cre。利用pPCNATAI-LoxP-Stop"LoxP-EGFP转染HEK293、 TJ905及U87MG细lfi^ 和体外原代培养大鼠跡胶质细胞，转染后72小时在荧光倒iM微镜下观察无乡絶荧光蛋白鋭。 利用pPCNATAI-LoxP-Stop-LoxP-EGFP和pGFAP-Cre g^转^h^三个细胞系和体外i歸大鼠星 形驗细胞，转染后72小时发现在U87MG及TJ905恶| ^瘤细鹏中有EGFP较高7R平的表 达，而在HEK293细l^及体外原代i^^大鼠M^^M细胞中EGFP无駄。证实利用^M细胞 及恶'I4I^瘤细胞特异'性启动子GFAP启动Cre重组酶的泰邸卩可在恶'SI^质瘤细胞中实JJ^卜源 性报导基因的细胞和增殖特异性皿(部分实验结果见附件图2)。
实施例6:
在不同体外J^细J3a^皿中定量检测PCNATAI-LoxP-stop-LoxP的,效率 禾,荧光素llffi导系统在不同体外培养细lM细皿中对PCNATAI-LoxP-stop-LoxP的, 效率进行定量检测。将PCNATAI-LoxP-stop"LoxP操纵系统分别插入质粒载体pGL3-Basic及 pGL3《nhancer，构建成重组质粒pGL3-PCNATAI-LoxP-stop"LoxP-Basic及pGL3-PCNATAI-LoxP-stoivLoxP~enhancer。将上述重纟IM粒分别^^虫或与重组GFAP《re质粒l^转染体外原代培 养大鼠娜l^^细胞、AK肾永生化HEK293细鹏及恶'(4^质瘤细Mf、U251，并以双荧光素酶 检测J试剂盒定量检测PCNATAI-LoxP-stop"LoxP鄉系^ 导基因的緑效率及SV40增强子对,的增强作用。结果显示无论有无SV40增强子的增强作用，在H^K293细M体外i^大 鼠跡^M细胞中，PCNATAI-LoxP-stop-LoxP操 统的録效糊极低(仅有漏出性就)。 在U251恶'im^瘤细胞系中，在无GFAP-Cre以肿瘤细胞特异'贩式提供的Cre重组酶的作用下， PCNArAI-LoxP-stop~LoxP操,^1 导基因的,效 极低，^fi，体外培养大鼠，胶 质细M HEK293细胞系中的转^7K平；而当GFAP-Cre以肿瘤细胞特异性M反式,Cre重 组酶时，PCNATAI-LoxP-stop-LoxPmiR^^U251亚'&^M瘤细I&^中的,效率明显提高至 无Crc重组酶时的约4,5倍，同时，SV40增强子可进一步提^^7jC平至无Cre重组酶时的约 30倍，提示PCNATAI-LoxP-stop"LoxP操 ^ 导基因的緑具有鹏的增殖和肿瘤细舰 重特异性，而SV40增强子可在不被PCNATAI-LoxP-stopioxP ^^^异性的11^下进 一步提高^$ 效率(部分实麟果见附件图2)。
以上实验结果充分说明该套基因皿操a^统B&至隨粗中瘤基因治疗所要求的启动效率 高、特异性安全断的要求。
参考文献 Cuitin JF， CandolfiPuntelet al. Regulated e q)ression of adenoviral vectors-based gene therapies: therapeutic
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出船i2002.靜该SEQUENCE LISTING
<110>天津医科大学总医院
<12 0>用于恶ffl中瘤基因治疗的增殖和肿瘤细胞特异性基因^^
<160> 4
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 839
<212> DNA
<213> Al/P歹!j (Artificial Sequence) <220>
<223>鹏自人增歹飾ffit亥SJ^PCNA启軒-778至+61区，用麟毒E1B TATA盒 蹄^ff^!jAGGGTATATAATG取^J^有的—29—21位^^,列，用HM緑 起始元件lnr丰^W^lJ CCATTCC取概有的-2~+5傲雜,列。
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(839) <220>
<221> CAAT一signal
<222> (634) "(638) <220>
<221> GC一signal
<222> (651>..(656) <220>
<221> TATA—signal
<222> (752)..(757)
<400> 1
3ttgcct33gtgctcs3sggtgtttgtsgtg3g3ttgat333tt3tgtt360
t3t3C3tgtgstgct3tgtttt333gaggt3ctg3tstgs3cgtggc3ts120
ssattsaatgt3Cttt3tt3sgt3cttttccsagtgtttacgg33tgsgtgcstttttg3180
gtgtsttcg33Ctttt33333gCttt3t3C240
tgagtgattataagagctggcgggggaatgttaagaggattaagtttaac300
agaacaattacctctttstcttgtgacacct3cg3gcgc3tc3sttctgt360
taa3gtgc3tstttgcsgc3gctgtactctcttcsggctgC33ggsggcttttcctcccg420
gtaggcttgstttgcatttcsctttcactttcgtggctgg333CtttCt3cccscgt3gt480gggsggctg3ggagccaccst333gctggggcttgscgsgccgggaccgggscccg3tct540
CC3C3t3tgCccggscttgttctgcggccgggttcaggagggggsgscct600
gcgcgscgctgccccgccctgcgcccgcttcctccs3tgt3tgctctsgggggcgggcct660
cgcggggsgcttggccctsasgtcttccccgcs3ggccgtgggctgg3c3720
gcgtggtgscgtcgcsscgcggcgcsgggt3t3ts3tggcgcttgcggscgcggcgccst780
tccgcggttgcsggcgtsgc3g3gtggtcgttgtctttctsggtctcagccggtcgtcg839
<210> 2
<211> 1323
<212> DNA
<213> AIJWU (Artificial Sequence) <220>
<223>離自人增殖细胞+^If、 PCNA启动子-778至+61区，用B^i毒E1BTATA
,列AGGGTATATAATG取^i^有的-2 9—21位蹄,列，用典型^^i台元 件lnr TOlim列CCATTCC取ft!^有的-2 +5位蹄^ff列。
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(1323) <220>
<221> CAAT—signal
<222> (1118)..(1122) <220>
<221> GC—signal
<222> (1135)..(1140) <220>
<221> TATA—signal
<222> (1236)--(1241)
<■> 2
tgctgscc333g33gtggtg60
tgtccstcctgt33C33ttg3333tttCtggctgggcgtggtggctc3cg120
cctgta3tcccsgcsctttgagaggccgaggcsggtggstcacctcaggtC3ggtgttcs180
sgacc3gcctggccaacatggtg333ccccgtctctsct3240
agccgggggtggtggt3ggcscctgtaatcCC3g3t3CtCgggaggctga300
ggcaggsgsctc3cttgsscctgggsggcggsggttgcaatg3gctg3gatcgcgccsct360gtsctccsgcctggatg3C3gagcaggsct420
stgtgtscgctctttgsctc3gctgtstt3cttcaaggag ttgatatcsc柳
C3333ttgCCt33gtgctc33sggtgtttgt3gtt333C3 3csggsg3tt g3t333tt3t540
gtt3tatscatgtg3tgct3tgttttaaagaggtactgatatgataasag 3tgtacgtgg600
3stgt3ctttattaagtacttttcc33gtgtttacggaat gagtgcattt660
tcgaactttttasaagcttt stacaatgaa720
cgsttgsgtgctggcggggg33tgttssg3ggstgstsgg gsgct3sgtt780
attacctctttatcttgtgacacctacgag cgcatcaatt ctgtaattga,
gcatstttgcsgcsgctgt3ctctcttcsg gctgc33ggs ggcttttcct900
cccggtaggcttgatttgcatttcsctttcactttcgtggctggaaactt tctacccacg960
tsgtgggsggctgaggsgcctggggcttgscgagccggga ccgggacccg1020
atctccscatatgcccggacttgttctgcggccgggttcaggsgtcsasg aggcggggsg1080
3cctgcgcgscgctgccccgccctgcgcccgcttcctccsatgtatgctc tagggggcgg1140
gcctcgcggggagcstggscscgsttggccct33sgtcttccccgcaagg ccgtgggctg1200
gscsgcgtggtgscgtcgcs3cgcggcgc3gggtatataa tggcgcttgc ggacgcggcg1260
ccsttccgcggttgcsggcgtagcagagtggtcgttgtctttctsggtct csgccggtcg1320
tcg1323
<210> 3
<211> 2280
<212> DNA
<213> AX^歹lJ (Artificial Sequence) <220>
<223>由鹏自人增翻胞核繊PCNA启动子-778至+61区的PCNATA工启动子、来自 pi nfM体的Cre !^的两^tiR&j位点LoxP及两个iRSU位点间的^^ih^列 Stop纟诚。
<220>
<221> promoteir
<222> (1)..(839)
<223>麟自人增殖细l&t亥K^ PCNA启动子的增殖特异'腿动子PCNATAI。 <220>
<221> CAAT—signal
<222> (634)..(638) <220><221> GC—signal
<222> (651)..(656) <220>
<221> TATA一signal
<222> (752)..(757) <220>
<221> misc一feature
<222> (858)..(891)
<223> Pl離体的I继石扑异构酶Cre ^iil的特异鹏U亂 <220>
<221> misc—feature
<222> (892) "(2240)
<223〉 ff^游列。 <220>
<221> polyA—signal
<222> (1056).， (1061) <220>
<221> misc—feature
<222> (2241)..(2274)
<223> Pl Ut^体的I型拓扑异构酶Cre ^BII的特异性i顿股点。
<400> 3
sttgcct33gtgctcs33ggtgtttgtsgtgsg3ttg3ts33tt3tgtts60
tatac3tgtgstgct3tgtttt333g3ggt3ctg3t3tgs3cgtggc3t3120
七3Cttt3tt3agtscttttcC33gtgtttscggs3tgsgtgc3tttttg3180
gtgtsttcga3Ctttt333333gCttt333sgctttst3C240
tgaigtg3ttataagagctggcgggggsstgtt3sgsggstgstsgggsgctssgtttsac300
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gtsggcttgatttgcstttc3CtttC3Ctttcgtggctgg333CtttCt3ccc3cgt3gt480
gggsggctgsggsgccaccst333gctggggcttgaicgsgccgggsccggg3cccg3tct540
CC3C3t3tgCccggacttgttctgcggccgggttcsggsgtcs3sg3ggcggggsgacct600
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cgcgggg3gc3tggsc3cg3ttggccctss3gtcttccccgcssggccgtgggctgg3c3720
gcgtggtgscgtcgc33cgcggcgcsgggtgcttgcggacgcggcgccst780tccgcggttgcaggcgtagc3gagtggtcgttgtctttctsggtctcagccggtcgtcgg840
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cgacctgcagcccs3gctt3ctt3cc3tgtt3c3ttg3tg960
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3tgctsttgctttatttgta3CC3tt3t331080
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ttCCtt3tt33CCCCttt3CC3C33tttttgsgcstsgtt1260
3tt33t3gC3g3C3CtC七3tgcctgtgtgg1320
sctgtt3tgcsggtt3C3gs3t3tttttCC3t33ttttcttgtstsgcsg1380
tgcagctttttcctttgtggtgtsastsgc3g3gttctatt3Ct333C3C1440
agcatgactcgc33ttctg3sggaaagtccttggggtcttCt3CCtttCt1500
cttcttttttgg3gg3gt3g33tgttg3g3gtcagc3gt3gcctc3tcstcactagstgg1560
cstttcttctggttttcctcttCC3CC3Ctgctcccsttc1620
3tcsgttcc3taggttgg33gttt33C3C31680
tt3t3C3Cttt3ttt3CCttsg3gcttt33stctctgtaggtsgtttgtc1740
C33tt3tgtCsgt33ggttccttcsc33sgstccctcgsg1800
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ttaagcatcacgagsatggttstgttcctcctcacttaagaggaaaacca1980
scggcggct3cs3cggtggc2040
cgtggcggtggcsgcttcttcgtcgtggtggtt3cggc33cggtggtttc2100
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gaggstccgg33CCCtt33t3tsscttcgt3taatgtstgct3t3cgssgtt3t3ccggt2280
<210> 4 <211> 2758 <212> DNA
<213> AU 歹!J (Artificial Sequence) <220>
<223>由離自^rK:人增歹飾胞核KJi PCNA启动子的PCNATAI启动子、来自Pl麟 体的Cre重IMI的两个i咽lj位点LoxP及两^HRSlJ位点间的^^lhff'列Stop 舰。<220><221> promoter<222> (1)..(1321)<220><221> CAAT一signal<222> (1118).. (1122) <220><221> GC—signal<222> (1135).. (1140) <220><221> TATA—signal<222> (1236)..(1241) <220><221> misc一feature<222> (1342). . (1375)<223> Pl ISK体的I型拓扑异构酶Cre ^ffil的特异性i，股点。 <220><221> misc—feature<222> (1376).. (2724)<223> $^^游列。 <220><221> polyA—signal <222> (1540).. (1545) <220><221> misc—feature <222> (2725).. (2758)<223> Pl Bta体的I型拓扑异构酶Cre Sl鹏附寺异性i别啦点。<400> 4tgctg3CC333g33gtggtg60tgtccstcct gtsscwttg3333tttCtggctgggcgtggtggctcscg120cctgtsatcccsgcactttgsgsggccgsggcsggtggstc3cctc3ggtC3ggtgttc3180sgsccsgcctggccsscstggtgss3ccccgtctct3cts240sgccgggggtggtggtsggc3cctgtaatcCC3g3t3CtCgggsggctgs300ggcaggagactC3Cttg33Cgaggttgcaatgsgctgsgstcgcgccsct360g七3Ctcc3gcctggstg3C3g3gc3ggsctCC3tCtC333420atgtgtacgctctttgactcsgctgt3ttscttc33gg3gttgst3tc3c480t33gtgctcsaaggtgtttgt3gtt333C33C3gg3gstt540tgtgstgct3tgttttaaag3ggtsctgstatgataaaagatgtacgtgg600aatgtactttattsagtacttttccssgtgtttacggaatgagtgcattt660tcgaactttttaasagcttt720cgattgagtgctggcg,gaatgttaagaggatgatagggsgct33gtt7803ttscctctttatcttgtgacscctacgagcgcatcaattctgtaattga840gcststttgc3gcsgctgt3ctctcttcsggctgc33gg3ggcttttcct900cccggtsggcttgstttgcstttcsctttcsctttcgtggctgg333Ctttct3ccc3cg960tagtgggaggctgsggsgcc3CC3t333gCtggggcttgscgagccgggaccgggscccg1020atCtCC3C3tatgcccggscttgttctgcggccgggttcaggagtcaaagaggcggggsg1080acctgcgcgscgctgccccgccctgcgcccgcttcctcc3atgtatgctctagggggcgg1140gcctcgcggggsgc3tgg3cacgsttggccct33sgtcttccccgcaaggccgtgggctg1200gscagcgtggtgscgtcgc33cgcggcgcstggcgcttgcggscgcggcg1260ccattccgcggttgcaggcgt3gc3g3gtggtcgttgtctttctsggtctcsgccggtcg1320tcgggatcc3ctagtccgcggst33Cttcgt3tsatgt3tgctst3cgs3gttsttsggt1380ccctcgacctgc3gccc33gCtt3Ctt3CC3tgtcsgstccagacatgat3agst3C3tt1440gatgsgtttgg3C333CC3C33ctsgsatgsstgctttatttgtg333tt1500tgtgstgct3ttgctttstttgt33CC3tt3t33gctgc33t333C33gt1560asttgc3ttcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaat5Lgc33g1620taaaacctcttstggctg3ttstgaitctctagtcaaggca1680aat3ttcctt3tt33CCCCtggt3C3C33tttttg3gcst1740agttsttaat3gcsgsc3ctct3tgcctgtgtggsgtssgatgtt3tg3t1800tataactgtt3tgcctactt3t33sggttscsgaststttttccataattttcttgtst31860gcagtgcsgctttttcctttgtggtgta3a3gc33g3gttCt3tt3Ct331920cttsgcasttgtccttggggtcttctscct1980ttctcttcttttttggsggsgtsg33tgttgsgsgtcsgc3gt3gcctc3tcatcactag2040attggc3tttcttctgagc3333caggttttCCtC3tt333ggcsttccaccaLCtgctccc2100attc3tc3gttccstaggtt2160C3C3ttat3Cttt3t3ttt3ccttsgsgcttt333tCtctgtaggtagtt2220tgtcc33ttstgtC3C3CC3gttccttc3C333g3tCCCt2280gttsgttgtggtgataggtggc33gtggts2340ttccgt3sg3aagcatttcat3ttstggctg33ctg3gcg240019atcaacgacatggttatgttcctcctcsct24603C3tg3gC33Ct3C33t33Cascaacggcggctacsacgg2520tggccgtggcggtggcagcttctttsgc33C33ccgtcgtggtggttscggcascggtgg2580tttcttcggtgtggc3gcsgatctaacggccgttctggtggtagatggat2640cg3tggc333catgtcccsgcgsssaggccgsgstcgccststttggtgt2700ccccgsggstccggsacccttcgtat33tgt3tgctat3cgaagttat2758
权利要求
1、一种高度增殖特异性真核细胞启动子PCNATAI，其核苷酸序列如序列表1或序列表2所示。
2、 一,利要求1所述的高度增殖特异性皿细胞启动子PCNATAI的获得方法，，征在于所述的启动子PCNATAI是以AK^^增殖细胞核抗原PCNA启动子区^^778^61位*核苷,列为原型，并对其进《亍下列两个片段的g(^得到第一、用腺病毒E1B TATA盒核苷,列AGGGTATATAATG取代PCNA启动子区原有的-29 21位核苷,列；第二、用典型$^^始元件Inr核苷 列CCAITCC取代PCNA启动子区原有的-2一5位核苷^^列，同时在其下游形成一个限制性内切酶&cn的识别位点。
3、 一种含有权利要求1所述的启动子PCNATAI，并由Cre重组酶^:活、以高度增殖特异性模式调控下、 瘤或自皿因皿的,细胞基因操 统PCNATAI-LoxP-stop-LoxP， ^t亥苷酸序列如序列表3辦列表4戶标。
4、 一,利要求3所述的真核细胞基因操纵系统PCNATAI-LoxP-stopioxP的获得方法，其特征在预方雜括第一、以权利要求l 0M的启动子PCNATAI作为i^M^^a动外源性治疗基因,的核心启动元件；第二、在启动子PCNATAI下游端插入pBS302质粒的"LoxP-StoivLoxP"序列作为该操纵系统的,KI元件，其中Stop为,终ih^列，LoxP为Cre重组酶的特异性识别序列。
5、 一种权利要求3戶/M的^t亥细胞基因操iim统PCNArAI-LoxP-sto!vLoxP自于操l^卜源性抑瘤或自絲因在恶倒中瘤细胞中的高效特异性敏，即在恶t^中瘤细胞中ffiil肿瘤细胞特异性^IM莫式反^^ crc重,，使;tffla同源重组机制删除Kt寺异性识别位点之间的^c终膀列Stop，从而解除Stop序列对PCNATAI启动的f^l程的阻遏作用，最终使下微卜源性抑瘤或自,因在PCNATAI的启动下在恶翻中瘤细胞中以肿瘤细胞特异14S增殖特异I4^S特异性模式高效敏。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一种高度增殖特异性重组真核细胞启动子PCNATAI；一种以PCNATAI为核心转录启动元件、以LoxP-stop-LoxP为转录阻遏元件的真核细胞操纵系统PCNATAI-LoxP-stop-LoxP；一套通过以肿瘤细胞特异性依赖模式反式提供的Cre重组酶解除LoxP-stop-LoxP对PCNATAI启动的转录过程的阻遏效应，使下游外源性抑瘤基因或自杀基因在恶性肿瘤细胞中以肿瘤细胞特异性及增殖特异性双重特异性模式高效、特异性表达的整体方案。该方案既可显著提高恶性肿瘤基因治疗过程中抑瘤或自杀基因在恶性肿瘤细胞中的表达效率，又可确保基因治疗的安全性。
文档编号C12N15/11GK101671666SQ20091007057
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月25日 优先权日2009年9月25日
发明者于士柱, 孙翠云, 安同岭, 虔 王 申请人:天津医科大学总医院