专利名称：增强cik细胞增殖能力及提高杀死肿瘤细胞的方法
技术领域：
本发明涉及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)的培养方法。
背景技术：
肿瘤是危害人类生命和健康的一大疾病，目前已列人群疾病死亡病因的第二位。 据世界卫生组织统计，全世界每年有900万新发癌症，500万人死亡。目前肿瘤的治疗方法主要是手术、放疗和化疗。其中，外科手术治疗只适用于早期肿瘤，而放化疗毒副作用较大。 因此，开发安全有效的新一代抗肿瘤生物疗法将有着极其重要的社会效益和经济效益。
美国Stanford大学首先报道了一类由多种细胞因子诱导的杀伤细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(cy to kine-induced killer cells, CIK),是目前所知杀伤活性最强的一种免疫效应细胞。CIK免疫细胞在骨髓净化和肿瘤过继免疫治疗中的作用已在动物实验中得到证实，CIK免疫细胞的临床实验也已开始进行。(Ortaldo J R, Winkler-Pickett R T，Yagita H，et al. Comparat ive studies of CD3+and CD3+CD56+cells:Exam_ination of morphology,functions, T cellreceptor rearrangement, and por e-forming protein expression. Cell Immunol, 1991, 136:486-495. ) ；(S chmidt-WolfI G，Negrin R Sj Kiem H P，et al. Us e ofa SCIDm ou se/human I ymphoma model t o evalu at e cyt okine-in duced killer cells with pot ent ant itumor cell act ivit y[J]. J E xp Medj 1991，174(1) :139-149.)
然而就目前培养CIK免疫细胞的方法所得到的CIK细胞的数量和活性较低，因此对肿瘤细胞的杀伤率低，治疗效果较差。发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题是提供一种增强CIK细胞增殖能力及细胞毒作用的方法。
于是，本发明提供了增强CIK细胞增殖能力及细胞毒作用的方法，包括无菌采集并分离健康人外周血单个核细胞，将得到的单个核细胞用Q007培养基重悬细胞，加入 24-26ug/ml的PHA-L型植物血凝素，并在培养基中至少培养15天。
优选地，PHA-L型植物血凝素的用量为25ug/ml。
优选地，用Q007培养基重悬细胞后调整细胞密度在(2-3) *106个/ml。
具体地，所述培养基为含有重组人IFN- Y、重组人IL-I以及重组人IL_2的培养基，其培养方法为，在第O天加入250IU/ml的重组人IFN-Y，在第I天加入25ug/ml的 PHA-L型植物血凝素和2. 5ng/ml的重组人IL-1，在第2天加入1000IU/ml的重组人IL-2 进行培养。
优选地，在培养过程中每隔2-3天加入一次1000IU/ml的新鲜重组人IL-2。
优选地，将得到的单个核细胞经洗涤后用Q007培养基重悬细胞。
本发明的有益效果是
I、通过在CIK细胞的培养过程中加入24-26ug/ml的PHA-L型植物血凝素，PHA-L 植物血凝素相对于其他类型的植物血凝素具有更高的促有丝分裂作用，刺激T细胞增殖分化产生大量效应T细胞和细胞毒T细胞；效应T细胞分泌产生大量细胞因子(如干扰素等) 杀伤肿瘤细胞；细胞毒T细胞可直接杀伤肿瘤细胞；PHA-L植物血凝素同时可刺激B细胞转化为浆母细胞然后增殖分化为浆细胞，浆细胞产生大量的非特异性抗体来中和肿瘤抗原， 从而极大地提高了 CIK细胞的增殖能力和细胞毒作用，经实验验证，本发明培养的CIK细胞增殖率达到140-150%ο
2、前期采用Q007培养基重悬细胞，其有益效果是更有利用CIK免疫细胞的分化及增加细胞毒作用
图I为实施例I中CIK细胞增生率的对比图2为实施例I中CIK细胞对体外培养癌症细胞(hela，h印g2，ovar3，K562)的杀伤率对比图；具体实施方式
下面，结合具体实施例对本发明进行详细描述。
首先，本发明在具体实施过程需要用到的试剂和耗材如下
表I主要试剂
权利要求
1.增强CIK细胞增殖能力及细胞毒作用的方法，包括无菌采集并分离健康人外周血单个核细胞，其特征在于将得到的单个核细胞用Q007培养基重悬细胞，加入24-26ug/ml的PHA-L型植物血凝素，并在培养基中至少培养15天。
2.根据权利要求I所述的增强CIK细胞增殖能力及细胞毒作用的方法，其特征在于，PHA-L型植物血凝素的用量为25ug/ml。
3.根据权利要求I所述的增强CIK细胞增殖能力及细胞毒作用的方法，其特征在于，用Q007培养基重悬细胞后调整细胞密度在(2-3) *106个/ml。
4.根据权利要求2所述的增强CIK细胞增殖能力及细胞毒作用的方法，其特征在于，所述培养基为含有重组人IFN-Y、重组人IL-I以及重组人IL-2的培养基，其培养方法为，在第O天加入250IU/ml的重组人IFN- Y，在第I天加入25ug/ml的PHA-L型植物血凝素和2. 5ng/ml的重组人IL-I，在第2天加入1000IU/ml的重组人IL-2进行培养。
5.根据权利要求4所述的增强CIK细胞增殖能力及细胞毒作用的方法，其特征在于，在培养过程中每隔2-3天加入一次1000IU/ml的新鲜重组人IL-2。
6.根据权利要求I所述的增强CIK细胞增殖能力及细胞毒作用的方法，其特征在于，将得到的单个核细胞经洗涤后用Q007培养基重悬细胞。
全文摘要
本发明提供了增强CIK细胞增殖能力及杀死肿瘤细胞的方法，包括无菌采集并分离健康人外周血单个核细胞，将得到的单个核细胞用Q007培养基重悬细胞，加入24-26ug/ml的PHA-L型植物血凝素，并在培养基中至少培养15天。其有益效果是通过在CIK细胞的培养过程中加入24-26ug/ml的PHA-L型植物血凝素，增强CIK细胞增殖能力及细胞毒作用，进而提高对肿瘤细胞的杀伤率和治疗效果。
文档编号C12N5/0783GK102978159SQ20121047704
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者李晓祥, 沈政, 黄谋珍 申请人:深圳市中美康士生物科技有限公司