专利名称：利用一种融合标签提高外源蛋白质的表达量的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌中提高外源蛋白质表达量的新方法。更特殊地涉及枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸(Hag50)作为融合标签来实现外源蛋白质的过量表达。
背景技术：
大肠杆菌一直是表达外源蛋白的首选表达系统.但由于外源蛋白在表达过程中容易被宿主细胞蛋白酶降解或者形成包涵体，而且大肠杆菌那样具有热源性脂多糖，其应用受到了限制.由于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的遗传学背景清楚，而且是一种食品级微生物，所以近年来枯草芽孢杆菌作为外源基因表达的宿主发展迅速并展现出良好的工业应用前景。虽然主要利用枯草芽孢杆菌实现外源蛋白质的分泌表达，但是在枯草芽孢杆菌中成功胞内表达的例子也很多(Zweers JC, Barak I, Dorte B, et al. Micro Cell Fact, 2008, 7 :10)。绿色突光蛋白质(Green Fluorescent Protein, GFP)广泛应用于报告蛋白、融合标记、蛋白质定位等领域。GFP作为一种新型的定量检测手段，已经广泛的应用到生物技术的各个方面。
蛋白质的表达量一直是科研工作者关心的重点。通过优化启动子和核糖体结合位点，共表达分子伴侣，降低蛋白酶表达量，优化编码基因的密码子等手段能明显的提高外源蛋白质的表达量。但是对于一些外源蛋白质，虽然通过以上优化表达量仍然很低或者达不到工业化生产的要求。所以，发现新的能提高外源蛋白质表达量的方法尤为重要。本发明是以GFP为报告蛋白质，通过N端融合Hag标签而·尝试提高GFP的表达量。发明内容
本发明的目的通过融合分子标签Hag50 (Hag的前50个氨基酸)，提高报告蛋白质 GFP的表达量。
本发明所采用的技术方案是
枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸(Hag50)作为融合标签提高外源蛋白质的表达量。具体的，是利用枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸(Hag50)编码基因hag50为分子标签，与外源目的蛋白基因的编码序列(GFP)进行融合，构建能够融合表达重组蛋白的质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，从而实现融合蛋白质的表达。本发明选择鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸(Genbank序列号M26948)作为融合标签，选择易检测和表达毒性低的GFP为外源基因，以具有转化能力且遗传学特性清楚的枯草芽孢杆菌菌株作为重组质粒的转化菌株，如Bacillus subtilis 168及其衍生菌株。
本发明涉及鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸(Hag50)，将该片段的编码基因与外源目的蛋白基因的编码序列融合后构建成重组质粒pMA5-Hag50-GFP，该质粒中含有强启动子 HpaII, Hag50的编码基因以及外源目的蛋白基因(GFP)，它可在枯草芽孢杆菌中表达融合蛋白。
本发明涉及的构建的融合表达重组蛋白的重组质粒转化枯草芽孢杆菌后得到的重组菌株，组成型的表达外源目的蛋白GFP，可通过荧光光谱仪检测重组蛋白GFP的荧光强弱。本发明中的空白对照是把GFP基因直接连接到质粒pMA5上，构成重组质粒pMA5-GFP。 荧光检测采用日立F-7000型荧光光谱仪，检测时的激发波长是488nm，发射波长是547nm。 荧光强弱用“相对荧光强度单位”表示。
本发明涉及鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸编码序列Hag50扩增的引物序列
hag-F AGTGCATATGAGAATTA ACCACA ATATTGC
hag50-R CTGGAATTCTTCAGAGATCGCAAGACCTG
与本领域已知的方法相比，本发明是利用鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸作为融合标签提高外源蛋白质在细胞内的表达水平。与对照相比，融合后的GFP表达量提高了 12倍。
图1融合表达Hag50_GFP重组质粒pMA5-Hag50_GFP构建流程图。Amp和bla表示氨苄青霉素抗性基因，用于筛选大肠杆菌转化子，并用来扩增质粒用。Hag50-GFP为鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸编码片段与绿色荧光蛋白GFP基因的融合片段，Promoter HpaII 是组成型强启动子HpaII ；ori为大肠杆菌复制子。
图2对照重组质粒pMA5-GFP构建示意图。直接把GFP基因连接到载体pMA5上而构成质粒PMA5-GFP。
图3重组菌株PG800和PHG800中GFP的相对荧光强度。重组菌株PG800表达不含分子标签Hag50的GFP蛋白质；重组菌株PHG800带有分子标签Hag50的Hag50_GFP融合蛋白质。
具体实施方式
1.枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸编码序列的获得
B. subtilis 168 的 hag 基因(Genbank 序列号M26948)全长为 915bp,是枯草芽孢杆菌中表达量最大的蛋白质之一。将培养好的B. subtilisl68菌液按照细菌基因组快速提取试剂盒说明书提取基因组DNA。根据NCBI发表的B. subtilisl68全基因组中hag基因序 列设计PCR引物hag-F和hag50-R，在上游和下游引物中分别引入NdeI和EcoRI酶切位点，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸编码序列，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，大小与预期相符。 扩增用的聚合酶是东洋纺(上海)生物科技有限公司的KOD plus。引物序列如下，其中下划线代表的是酶切位点。
hag-F AGTGCATATGAGAATTAACCACAATATTGC
hag50-R CTGGAATTCTTCAGAGATCGCAAGACCTG
克隆得到的PCR产物进行产物纯化，_20°C保存备用。
2.绿色荧光蛋白质基因gfp的扩增
根据NCBI发表的gfp基因(Genbank序列号U55762)序列设计PCR引物。利用引物GFP-f和GFP-R，以质粒pEGFP为模板，扩增出有EcoRI和BamHI酶切位点的gfp基因。以GFP-F和GFP-R为引物，以质粒pEGFP为模板，扩增出有NdeI和BamHI酶切位点的gfp基因。扩增用的聚合酶是东洋纺(上海)生物科技有限公司的KOD plus。经核酸电泳检测， 大小与预期相符。进一步产物纯化并-20°C保存备用。
GFP-F GGCGCATATGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC
GFP-f CCGGAATTCAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC
GFP-R GGCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA
3.质粒 pMA5-Hag50_GFP 的构建
构建流程如图1，首先是把利用KOD plus (平末端)扩增出带有EcoRI和BamHI酶切位点的gfp基因连接到经过EcoRV酶切的PUCX05，构成质粒pUCX_GFP。通过采用NdeI和 EcoRI双酶切PCR产物Hag50，经胶回收后克隆于经相同酶切的pUCX_GFP的质粒中，得到质粒 pUCX-Hag50-GFP。用 NdeI 和 BamHI 酶切质粒 pUCX-Hag50_GFP，并胶回收 Hag50_GFP 片段，连接到经相同酶切的PMA5质粒中，得到重组质粒pMA5-Hag50-GFP。
4.重组质粒pMA5-GFP的构建
采用NdeI和BamHI双酶切以GFP-F和GFP-R为引物扩增出的PCR产物gfp，经胶回收后克隆于PMA5的相应位点，得到整合型重组质粒pMA5-GFP(如图2)。
5.重组质粒转化枯草芽孢杆菌与转化子的筛选鉴定
采用电击法将重组质粒pMA5-Hag50_GFP和pMA5_GFP分别转化枯草芽孢杆菌 WB800 菌株中(2. Okv, Imm,电击 I 次，时间常数=4. 5 5. Oms, Gene Pulser Xcell),涂布含卡那霉素的LB平板。过夜培养后，从平板上挑取单菌落点接种至5mL含终浓度为50 μ g/ mL卡那霉素的LB液体培养基。收集菌体并按照细菌基因组快速提取试剂盒说明书提取基因组DNA，通过PCR验证重组质粒是否转化成功。鉴定为含有pMA5-Hag50-GFP菌株命名为 PHG800，含有pMA5-GFP的菌株命名为PG800。
6.枯草芽孢杆菌重组菌株中GFP的检测
把重组菌株PHG800和PG800分别接种于5ml的LB液体培养基中，37°C培养12h。 IOOOOrpm离心15min收集菌体，然后用PBS洗涤三次，并重悬于等体积的PBS重悬菌体。 然后加入终浓度为5mg/mL的溶菌酶，37°C水浴保温lh，利用超声波破碎菌体(2min，300W， Sonic, VCX500)。然后利用日立F-7000型荧光光谱仪检测破碎液中荧光的强弱，检测时的激发波长是488nm，发射波长是547nm。
本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌中提高外源蛋白质表达量的新方法。以枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸(Hag50)作为融合标签来实现外源蛋白质GFP时,可以提到提高GFP表达量达12倍。它的发现对于实现外源蛋白质在枯草芽孢杆菌中的过量表达提供了可能。
权利要求
1.利用鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸作为融合标签提高外源蛋白质在枯草芽孢杆菌中的表达量。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，利用枯草芽孢杆菌芽孢鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸作为融合标签，与外源目的蛋白基因融合，构建融合表达载体，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌，重组菌株能有效的提高外源蛋白质的表达水平。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，外源目的蛋白基因为编码具有生物活性的蛋白或酶。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的重组质粒是将枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白编码序列与外源目的蛋白基因融合得到的质粒，重组质粒中含Hag的前50个氨基酸编码片段、氨苄青霉素和卡那霉素的抗性选择标记基因、组成型强启动子HpaII和外源目的蛋白质的编码基因，构建的质粒转化枯草芽抱杆菌。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的重组枯草芽孢杆菌带有游离型质粒，含有融合标签的重组菌株的外源蛋白质的表达量明显提高。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，涉及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸的应用，提高外源蛋白质在枯草芽孢杆菌中表达量的新方法，具体是通过融合表达的方式提高外源蛋白质的表达量。融合标签Hag50编码序列与外源目的蛋白质的编码基因进行融合重组，构建融合表达的重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌。得到的重组菌已经能成功提高外源蛋白质的表达量。
文档编号C12N15/75GK103031328SQ20121047679
公开日2013年4月10日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者陈卫, 王光强, 宋元达, 陈海琴 申请人:江南大学