一种骨质疏松相关基因及其编码蛋白和用途的制作方法

专利名称：一种骨质疏松相关基因及其编码蛋白和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种骨质疏松相关的人类新基因及其编码蛋白，蛋白的抗体。本发明还涉及这种新的基因及其编码蛋白在在制备预防和/或治疗骨质疏松症、与人体细胞转录因子AP-1有关的疾病的药物中的用途，或在制备调节细胞增殖、凋亡、存活、分化、癌变等的药物或试剂中的用途。本发明还涉及该基因在宿主细胞中外源表达会抑制AP-1的活化。
背景技术：
骨质疏松症是一个骨骼系统的疾病，以骨强度下降，骨折风险增加为特征。对于妇女绝经后的5-10年内还有一个松质骨丢失的加速过程。骨质疏松症后果严重，是老年人群致死、致残的常见原因，预计到2050年，全世界髋骨骨折人数将由1990年的170万人增至630万人，骨质疏松症医疗费用高，由其引起的骨折导致巨大的医疗资源占用，给社会带来沉重负担。
骨质疏松症重在预防。目前，可以用于治疗骨质疏松症的药物有二膦酸盐、降钙素等，但都为治疗药物，不适用于预防，并且价格昂贵；雌激素对于骨质疏松症的预防、治疗效果确切，但作用范围广泛，作用不仅限于骨骼。因此，有必要寻找新的药物治疗靶点，发明新的副作用小、具有预防和治疗效果的药物。
信号通路是目前研究热点。通过规模化的筛选影响信号通路的基因是研究新功能基因、发现新药物靶点的有效方法。激活蛋白-1(AP-1)是最早被鉴定的细胞转录因子，是多种细胞信号传导通路在细胞核内的交汇点(Karin etal.，1997)。AP-1属于碱性亮氨酸拉链类超家族成员，由bZIP类蛋白组成异源或同源二聚体发挥功能。在哺乳动物中，这类bZIP蛋白主要包括Jun、Fos、Maf和ATF四类亚家族。AP-1通常是由fos和jun互相结合形成异二聚体。AP-1识别TPA应答元件(TRE)或cAMP应答元件(CRE)。TPA是一个强的肿瘤启动子，可通过活化PKC而诱导AP-1并与AP-1结合位点结合。
AP-1活性受到严谨、动态的调控，多种生理刺激、环境因素和胞内的调节蛋白都可以调控AP-1的活性。包括血清、生长因子、佛波醇酯和癌基因、细胞因子、神经递质、多肽激素、细胞-基质相互作用、细菌和病毒感染以及许多物理和化学应激都可诱导AP-1的活性。这些刺激可以激活MAPK级联反应，进而通过磷酸化特异亚基来激活AP-1的转录活性。另外，基因抑制也可调节AP-1的一些生物效应。
AP-1是人体最重要的转录因子之一，作为细胞内信号转导途径的枢纽，它参与了人体多种生理与病理过程，如凋亡，学习过程，胚胎发育，药物引发的行为反应，骨的生长与分化。它参与诱导多种多样的细胞及病毒化基因的表达，在多种类型细胞的基因表达调节中起多效性作用，特别对于增殖和细胞周期中多种基因的表达都起作用。这些基因对细胞增殖、凋亡、存活、分化、癌变信号进行应答而被激活，其中包括许多细胞因子、生长因子、神经递质、多肽激素等。
AP-1参与了肿瘤侵袭/转移的多个环节。多种癌基因如Ras，通过活化AP-1而参与肿瘤的转化和转移。AP-1也能与其他转移因子协同参与转移，研究发现AP-1家族成员与ATF/CREB家族成员的bZIP基序结合，形成杂合二聚体，在人黑色素瘤细胞转移中起重要作用[Xie S，Price J E，Luca M，et al.Oncogene，1997，15(17)2069-2075]；AP-1还可影响瘤细胞运动，如用JNk显性负性突变体阻断AP-1活化，能显著抑制细胞迁移能力；AP-1也与粘附分子表达密切相关；AP-1的活化参与血管生成介质的异常表达。基于AP-1在转移相关基因表达调控中的重要正性作用，抑制AP-1可能有防治肿瘤转移的意义如肝素能抑制AP-1相关的转移通路而抑制血管生成，抑制MMPs等多种基质降解酶的激活。
另外，AP-1对于病毒性肝炎的发病机制研究有重要意义，病毒性肝炎的病毒蛋白通过与AP-1的相互作用可以部分解释病毒感染发病的分子生物学机制。Lee et al研究发现乙型肝炎病毒(HBV)基因增强子1(EnhI)上有特异的AP-1结合位点。病毒蛋白和一些其他的激活因子可通过与AP-1结合位点的作用调控HBV的转录与表达。与Jun和Fos家族的相互作用也是影响AP-1功能的重要方式；Tsutsumi et al研究发现在HCV感染相关HCC中，c-Jun氨基末端激酶，AP-1的活性及下游的效应因子活性均升高，因此，体内细胞因子的表达伴随AP-1的激活和核心蛋白的表达可能在持续HCV感染的肝细胞恶性转化中有重要作用。
此外，AP-1在心肌纤维化过程中起了重要作用，慢性酗酒者中常存在维生素A不平衡，并可引起肝视黄酸水平下降，阻碍视黄醇信号的传递，增强AP-1，故可引起肝星状细胞的增殖和活化；AP-1也可以促使激活的HSC产生更多的基质金属蛋白酶抑制剂-1，抑制胶原分解，诱导并加剧肝纤维化的产生。还有，诱导细胞凋亡或抗滑膜增生的AP-1、增生细胞核抗原(PCNA)等又是类风湿关节炎基因治疗的靶基因。而最近日本国立遗传学研究所和捷克南波希米亚大学的研究人员发现了AP-1蛋白可调控生物体的防御系统，并受MBF1蛋白而免于被氧化。常染色体显性遗传多囊性肾病(ADP-KD发病至少与PKD1、PKD2和PKD3三个基因有关。PKD1和PKD2基因突变导致AP-1活化障碍，肾小管上皮细胞不能发育成熟，从而形成ADPKD[Amuld T，Sellin L，Benzing T，et al.Mol Cell Biol，1999；1946(8)]。感觉神经释放的神经肽(P物质)对伤口愈合的质量和速度有重要影响，原癌基因c-fos、c-jun可能是P物质调控内源性生长因子表达的又一核转录因子。AP-1调控NFAT介导的IL-2基因启动子转录活性对于阐明引起脓毒症免疫功能障碍的详细发病机制，明确机体所处的免疫状态提供新思路。Vallian等发现早幼粒细胞白血病PML的转录调节活性与AP-1复合体有关。PML生长抑制作用可能是通过作用于AP-1的组成成分或调控生长的相关因子激活AP-1所致。而AP-1在药物产生渴求效应中也有一定作用。
研究表明，AP-1在骨骼发育、骨量维持中发挥重要作用。过表达C-Fos的转基因小鼠和嵌合体小鼠的骨、软骨及造血细胞的发育会受到明显影响，发生骨肉瘤。纯合子的C-Fos基因敲除小鼠生长迟滞、缺少破骨细胞、骨重建缺如、发生骨质疏松。因此，c-Fos是巨噬细胞/破骨细胞系及骨重建的重要调节因子。过表达Fra-1或FosB使骨形成增加，转基因小鼠出现骨硬化症。FosB是Fos缺少羧基端的剪切体，能与其他AP-1如JunD形成异源二聚体而影响转录。对改变Fra-2表达的基因工程小鼠的研究表明，Fra-2对成骨细胞和破骨细胞的发育均有重要作用。Fra-2基因敲除小鼠骨量减少，破骨细胞数目明显升高。JunB基因缺失小鼠骨量减少，骨转换明显升高。JunD在骨中的作用尚不清楚，JunD基因敲除小鼠出生后生长受抑，但并未发现骨表型的改变。JunD和Fra-2主要表达于分化过程中的成骨细胞。Menin基因可以通过拮抗JunD而抑制成骨细胞发育。
随着研究的深入，目前发现很多调节骨量、影响骨发育的激素都与AP-1之间存在着联系。所有核受体可以抑制AP-1调控基因的转录，如包括糖皮质激素受体、雌激素受体、甲状腺素受体等。AP-1与核受体之间存在着复杂的相互作用，从而调控核受体发挥转录激活或转录抑制作用。老年性骨质疏松是一种常见的疾病，除于雌激素水平不足有关外，成骨细胞功能受损也参与骨质疏松的发病机理，Tohjima等人报道AP-1活性下降可能与老化的成骨细胞功能受损有关系。

发明内容
针对现有技术及现有药物或试剂的不足，本发明的目的是提供一种骨质疏松相关的人类新基因GMSS555，该基因的表达受雌激素抑制，另外，该基因在宿主细胞中外源表达具有抑制AP-1活化的作用，且抑制AP-1活化的作用明显、稳定。
本发明的另一目的是提供上述基因所编码的蛋白质。
本发明的另一目的是提供含有上述基因的载体，和该基因及其载体转化或转导的宿主细胞。
本发明的另一目的是提供上述基因所编码的蛋白质的抗体和用于检测的核酸分子。
本发明的另一目的是提供上述基因及其编码多肽的用途。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案在本发明的第一方面，提供了一种骨质疏松相关的新基因，该基因的核苷酸序列选自(a)SEQ ID NO1的编码序列或全长序列；(b)编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)与(a)或(b)限定的核苷酸序列具有至少90％相似性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(d)在高严谨条件下可与(a)或(b)或(c)限定的多核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
上述高“严谨条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好的是在97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与本发明所述的多肽有相同的生物学功能和活性。
在本发明的第二方面，提供了骨质疏松相关的新基因GMSS555编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列选自(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少90％相似性的氨基酸序列；(c)将SEQ ID NO2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加衍生的氨基酸序列。
在本发明的第三方面，提供了含有新基因GMSS555或其片段的载体，还提供了该基因或该载体转化或转导的宿主细胞。
本发明中的基因可以插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒，如腺病毒、逆转录病毒，或者其他载体。在本发明中适用的载体可以是原核表达载体，也可以是真核表达载体，如在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)，在哺乳动物细胞中高表达的真核表达载体pcDNATM3.1/myc-hisB(-)(Invitrogen)。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以应用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。用本领域的技术人员熟知的方法来构建含有本发明所述多核苷酸序列和转录/翻译控制信号的表达载体即可。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组DNA技术等(Sambrook，et al.MolecularCloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。
本发明的多核苷酸序列可有效地连接到表达载体中的适当的启动子上来指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选的包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性、或真核细胞培养用的绿色荧光蛋白(GFP)、新霉素抗性及二氢叶酸还原酶。
本发明还涉及用上述载体或者本发明的多核苷酸经基因工程产生的宿主细胞。本发明的载体和多核苷酸可以用于转化适当的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞； 293T、Hela细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常有10-300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。例子有在复制起始点下游的100-270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点下游的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域的普通技术人员都知道如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主细胞为原核细胞如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收集，用CaCl2法处理，所用步骤是本领域众所周知的。可供选择的是MgCl2处理，也可用电穿孔的方法处理。当宿主是真核细胞时，可选择以下转染方法磷酸钙共沉淀法、常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，来表达本发明的多核苷酸所编码的多肽。根据所选的宿主细胞选择合适的常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法如温度转化或化学诱导，来诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
上述方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其他特性通过各种分离方法分离和纯化重组多肽。这些方法是本领域技术人员所熟知的，如常规的复性处理，用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析和其它各种液相层析技术或这些方法的结合。
在本发明的第四方面，提供了与GMSS555基因所编码的蛋白质特异性结合的抗体，还提供了用于检测的核酸分子，它含有权利要求1所述基因的核苷酸序列中的8-100连续的核苷酸。
本发明的多肽及其片段、衍生物、类似物或表达它们的细胞可以作为抗原来生产抗体。这些抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的抗体。本发明的多肽的抗体可用本领域公知的抗体制备方法来生产。例子有单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)。多克隆抗体的生产可用本发明的多肽免疫动物，如家兔、小鼠、大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术产生(Morrison et al.PNAS，1985，816851)。单链抗体也可用已有的技术生产(U.S.Pat No.4946778)。
本发明还涉及与本发明多核苷酸的任何一部分同源的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含有15个核苷酸，较好的是至少30个核苷酸，更好的是至少50个核苷酸，最好的是至少100个核苷酸。此核酸片段通常是在本发明的核苷酸序列信息的基础上化学合成的DNA序列。上述核酸片段可以用于PCR扩增技术(如作为引物)以确定和/或分离编码具有诱导人体细胞凋亡功能的多核苷酸；也可以作为杂交所用的探针。也可以用于RNA干扰技术。本发明的多核苷酸的一部分或全部也可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达和基因诊断。探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在本发明的第五方面，提供了基因GMSS555在宿主细胞中外源表达会抑制AP-1活化的应用，还提供了GMSS555基因或其编码多肽在制备预防和/或治疗骨质疏松症或与人体转录因子AP-1有关的疾病的药物中的用途。
雌激素干预可以影响本发明基因的表达水平。雌激素对于骨质疏松症的预防、治疗效果确切，但作用范围广泛，不仅限于骨骼。
本发明的基因在宿主细胞中外源表达还可以抑制人体转录因子AP-1的活化。人体细胞转录因子AP-1活化与炎症、肿瘤等多种疾病相关，尤其与细胞增殖、凋亡、存活、分化、癌变等密切相关。
本发明的多肽可以单独或与合适的药用载体组合使用。这种组合物可以包含治疗有效量的多肽或拮抗剂以及药学可接受的载体或赋型剂，这样的载体包括但不限于盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘醇，乙醇，或混合物，这些制剂应适合给药方式。
本发明的药物组合物可以以适当的方式给药，如通过局部、静脉内、腹腔内、肌内、皮下等途径给药。给药于患者的用量取决于许多因素，如给药方式，待治疗者的身体条件和诊断医生的判断。
本发明的多肽也可以通过在活体表达这些多肽来使用。例如患者的细胞可以通过在体外用编码本发明多肽的基因进行基因工程操作，然后将工程细胞提供给患者，使工程细胞在体内高表达这种多肽，从而达到治疗的目的。
在本发明的第六方面，提供了一种骨质疏松症或炎症或肿瘤的体外检测方法，利用上述核酸片段或抗体来检测宿主样品中的蛋白质的存在或水平。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域技术人员而言是显而易见的。
本发明为进一步研究雌激素或人体转录因子与本发明中的基因的调控关系，以及开发治疗骨质疏松症、炎症、和肿瘤以及调节细胞增殖、凋亡、存活、分化、癌变等的新药物，为开创新的临床诊断、疗效评价及预后指标奠定必要的基础。


图1表达载体pDrive-GMSS555的构建示意图。
图2GMSS555的表达受雌激素抑制的RT-PCR鉴定。第一泳道为标准品；第二泳道为未加雌激素时GMSS555表达；第三泳道为雌激素作用七天时GMSS555表达；第四泳道为未加雌激素时内参照β-actin表达；第五泳道为雌激素作用七天内参照β-actin表达。
图3真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B-GMSS555的构建示意4pX-luc荧光素酶基因报告质粒的结构图(X为NF-κB、NFAT、AP-1、CRE、STAT1其中之一)。
图5GMSS555外源表达抑制PMA和离子霉素对AP-1的活化。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(2002年第三版[美]萨姆布鲁克等箸，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、雌激素作用前后骨外膜细胞差异表达基因文库的构建、测序及验证采用胰酶、胶原酶两步消化法分离人原代骨膜组织；1×105/孔的密度接种于6孔培养板，含有1nM 17-βE2(Sigma)及对照(等体积无水乙醇)的无酚红的成骨诱导培养液，每三天更换1次培养液，共培养七天；采用RNeasyMini Kit试剂盒(QIAGEN，74104)提取细胞总RNA，OligotexmRNA Mini Kit试剂盒(QIAGEN，70022)纯化mRNA；PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit(Clontech，K1804-1)获得雌激素作用骨外膜细胞中特异性表达的cDNA和雌激素未作用细胞中特异表达的cDNA；纯化PCR产物，去除引物、单核苷酸和盐类杂质；使用PCR Cloning Kit(QIAGEN，231122)，将差异DNA连接到pDrive克隆载体上，如图1所示；将连接产物在2.0Kv，200Ω，25μF条件下进行电转入DH5α感受态细胞中。
将转化后菌液涂布含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB固体培养基上，并进行蓝白斑选择，挑取白色菌落，常规扩增、提取质粒、测序。
根据测序结果，Cross-match程序去除载体、宿主菌序列，以Phrap程序进行聚类、拼接，根据Genbank数据库将每条序列进行注释，选择其中未报道功能的基因，进一步对差减库结果进行RT-PCR验证。
验证细胞培养采用建库时相同的方法，提取RNA，逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)按照SuperScript II Reverse Transcriptase(Invitrogen，18064-014)试剂盒说明书进行。经反转录后，以β-actin作为内参照，引物序列为GMSS555正向引物AGGTGTATCTGCGCTGTGCG反向引物AGGCTCGTGGGTAACTTGCTGβ-actin正向引物GGCGGCACCACCATGTACCCT反向引物AGGGGCCGGACTCGTCATACT反应条件如下25μl PCR体系，其中含有10×TaqDNA聚合酶缓冲液2.5μl
dNTP 2μl 终浓度各200μM逆转录cDNA模板1μl (200ng)GMSS555引物 2μl 各1μMβ-actin引物 2μl 各1μMTaq DNA聚合酶 2.5U用双蒸水补足至25μl按94℃ 5分钟一个循环，94℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 1分钟25个循环，72℃ 10分钟一个循环进行PCR扩增；PCR结束后取8微升进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果以天能凝胶成像系统(天能GIS-2016)进行图像分析。
结果如图2所示第一泳道为标准品；第二泳道为未加雌激素时GMSS555表达；第三泳道为雌激素作用七天时GMSS555表达；第四泳道为未加雌激素时内参照β-actin表达；第五泳道为雌激素作用七天内参照β-actin表达。经图像分析软件分析表明雌激素干预前后GMSS555表达差异具有显著性。
实施例2、从骨膜组织中PCR获得目的基因实施例1中得到的基因GMSS555的序列为序列表中的序列1，根据该序列设计全长阅读框架的特异性引物正向引物5‘GAGCCGGCGCCAGAGCATG 3’反向引物5‘GGAGTCAGTCCGTGCCAACCT 3’取胎儿骨膜组织，用Trizol试剂(invitrogen)按厂方说明书提取总RNA，SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System(Invitrogen，18064-014)获得的骨膜cDNA做为模板进行PCR扩增反应，反应条件如下反应体积50μl，其中含有骨膜cDNA模板 1μl(200ng)引物 正向引物、反向引物终浓度各0.4μMdNTP 终浓度各200μMTakara LA Taq DNA聚合酶2.5U2×GC缓冲液25μl用双蒸水补足至50μl体积按94℃ 5分钟一个循环，94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 2分钟35个循环，72℃ 10分钟一个循环进行PCR扩增，获得含完整开放阅读框序列的基因扩增产物，扩增产物进行测序验证。随后将目标PCR产物纯化，与pDrive-T载体连接，测序，结果即为序列1；再以常规技术构建pcDNA3.1/mycHis(-)B为载体的真核表达质粒。
实施例3、双荧光素酶报告基因法测定GMSS555对PMA+离子霉素诱导AP-1活化的抑制作用。
本发明采用双荧光素酶报告基因法检测GMSS555基因对AP-1活化的抑制功能，该方法采用的是体内信号转导途径顺式报导系统，其中所用的报告质粒载有萤火虫荧光素酶基因，该基因的表达由合成的启动子所调控，其中包含基本的启动子元件(TATA box)，以及转录因子的结合位点，报告质粒的结构图如图4所示。当细胞内的转录因子通过某种信号转导途径而被活化时，转录因子便会结合于报告质粒的增强子元件，从而启动报告基因萤火虫荧光素酶基因的转录，进一步胞内翻译成荧光素酶，导致细胞内荧光素酶数量增加，活性增强；相反，当细胞内的转录因子活化受到抑制的时候，荧光素酶的表达量及活性就低。所以，通过检测荧光素酶的活性，便可以反映不同刺激物以及共转染的目的基因对细胞内转录因子是否具有活化或者抑制活化的功能。pRL-TK报告质粒载有水母荧光素酶基因，该基因的表达由猿猴病毒40(SV40)增强子/启动子所调控，转染哺乳动物细胞后可以产生较强的基本水平的水母荧光素酶的表达，且表达的活性不受CRE活化与否的调节，所以在实验中用作内对照报告基因。
用目的基因pcDNA3.1/mycHis(-)B-GMSS555和报告基因pAP-1-luc，pRL-TK共转染人胚胎肾293T细胞，通过分别检测两种荧光素酶活性来测定AP-1的活性。共转染的方法为阳离子非脂性转染法，采用vigofect(威格拉斯生物技术(北京)有限公司)，按产品说明书所述进行。
转染操作步骤如下(1)细胞培养将293T细胞(ATCC NumberCRL-11268)(2.0×104)用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养基(Hyclone，SH0022.02)铺在96孔细胞培养板(Costar，3599)上，接种密度1.2万/孔，培养基体积100ul/孔，在5％CO2，37℃的培养箱中培养18-24小时。
(2)制备转染复合物取2.5ul生理盐水稀释40ng报告基因pCRE-luc，4ng pRL-TK和50ng目的质粒pcDNA3.1/mycHis(-)B-GMSS555，缓慢混合均匀；同样用2.5μl生理盐水稀释适当量的vigofect(一般为0.04ul/孔)，缓慢混合均匀，在室温下放置5分钟，与稀释的DNA缓慢混合，室温放置15分钟，以形成转染复合物。
(3)转染将转染复合物缓慢滴入细胞培养板(5μl/孔)，轻微摇匀。5％CO2，37℃的培养箱中培养18-24小时。
转染18-24小时后用PMA(十四酸佛波酯，Calbiochem，524400，终浓度50ng/ml)+离子霉素(Calbiochem，407950，终浓度1uM)刺激细胞，37℃孵箱培养。6-8小时后弃去培养液，加入Passive Lysis Buffer(Promega，E1960)，放入-80℃冰箱。检测时，取出细胞板，室温下自然解冻，使细胞完全裂解，10μl细胞裂解液移至白色荧光板，加入Dual-luciferase双报告系统检测底物，通过tecan微孔板酶标仪(Genios Pro，Tecan)检测萤光素酶活性。
实施例4、双荧光素酶报告基因法测定GMSS555对PMA+离子霉素诱导NFAT活化的抑制作用。
报告基因为pNFAT-luc，其余与实施例3相同。
实施例5、双荧光素酶报告基因法测定GMSS555对毛猴素(Forskolin)诱导CRE活化的抑制作用。
报告基因为pCRE-luc，刺激物为毛猴素，其余与实施例3相同。
实施例6、双荧光素酶报告基因法测定BPY2IP1对PMA+离子霉素诱导NF-κB活化的抑制作用。
报告基因为pNF-κB-luc，其余与实施例3相同。
实施例7、双荧光素酶报告基因法测定BPY2IP1对γ-干扰素诱导STAT1活化的抑制作用。
报告基因为pSTAT1-luc，刺激物为γ-干扰素，其余与实施例3相同。
设定转染pcDNA3.1/mycHis(-)B空载体、不加刺激物时细胞内的荧光素酶活性比值(萤火虫荧光素酶荧光强度/水母荧光素酶荧光强度表示)为1，其他条件下细胞内的荧光素酶活性比值以此为标准，用相对值表示。
结果参照图5，用pcDNA3.1/mycHis(-)B-GMSS555和报告质粒共转染293T细胞，未用刺激物时，在各个信号通路中293T细胞中荧光素酶的活性均有所下降；经过不同刺激物刺激后，AP-1信号传导通路中的293T细胞中荧光素酶的活性明显地下降，而在其他信号传导通路中看不到荧光素酶的活性明显下降，表明GMSS555基因在293T细胞中的表达产物对PMA+离子霉素诱导AP-1活化有强的抑制作用。因此，本发明可以用于阐明GMSS555基因的生物学功能及其在炎症、肿瘤发生中的作用，从而明确相关疾病的发生机制，为疾病的治疗和药物开发提供靶向位点。
实施例8、抗体制备抗原选用原核细胞或真核细胞表达的GMSS555蛋白全长或部分肽段，也可以合成多肽作为抗原。
多克隆抗体的制备免疫动物选用成年雄性新西兰兔或BALb/c小鼠，初次免疫用200ug(新西兰兔)或20ug(BALb/c小鼠)抗原与等体积弗氏完全佐剂(FCA)充分乳化后，于背部皮下多点注射。初次免疫后21、42、63天，用弗氏不完全佐剂(FIA)完全乳化的抗原蛋白，各加强免疫1次，用量同前。每次免疫后7~10天，ELISA方法检测血清效价，达到1×10-4时，放血分离血清.Western blot鉴定抗体特异性。单克隆抗体制备免疫BALb/c小鼠同前，取脾脏制成B细胞悬液，与对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0融合，通过HAT(H，次黄嘌呤；A，氨基喋呤；T，胸腺嘧啶核苷)选择性培养，获得杂交细胞系，再通过ELISA方法检测抗体效价，筛选出特定的杂交瘤细胞系，并得到单克隆抗体。
序列表<110>中国医学科学院北京协和医院北京诺赛基因组研究中心有限公司<120>一种骨质疏松相关基因及其编码蛋白和用途<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>947<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(247)..(936)<400>1ttacgggcct ctagactcga gcggccgcca ctgtgctgga tatctgcaga attcgattga 60gccggcgcca gagcatgcgg ggcgctcccg ctgctgctcc tgctcctggc cgggctgctg 120ggcggcgcgg gcgcgcagta ctccagcgac cggtgcagct ggaaggggag cgggctgacg 180
cacgaggcac acaggaagga ggtggagcag gtgtatctgc gctgtgcggc gggtgccgtg 240gagtgg atg tac cca aca ggt gct ctc atc gtt aac ctg cgg ccc aac288Met Tyr Pro Thr Gly Ala Leu Ile Val Asn Leu Arg Pro Asn1 5 10acc ttc tcg cct gcc cgg cac ctg acc gtg tgc atc agg tcc ttc acg 336Thr Phe Ser Pro Ala Arg His Leu Thr Val Cys Ile Arg Ser Phe Thr15 20 25 30gac tcc tcg ggg gcc aat att tat ttg gaa aaa act gga gaa ctg aga 384Asp Sec Ser Gly Ala Asn Ile Tyr Leu Glu Lys Thr Gly Glu Leu Arg35 40 45ctg ctg gta ccg gac ggg gac ggc agg ccc ggc cgg gtg cag tgt ttt 432Leu Leu Val Pro Asp Gly Asp Gly Arg Pro Gly Arg Val Gln Cys Phe50 55 60ggc ctg gag cag ggc ggc ctg ttc gtg gag gcc acg ccg cag cag gat 480Gly Leu Glu Gln Gly Gly Leu Phe Val Glu Ala Thr Pro Gln Gln Asp65 70 75atc ggc cgg agg acc aca ggc ttc cag tac gag ctg gtt agg agg cac 528Ile Gly Arg Arg Thr Thr Gly Phe Gln Tyr Glu Leu Val Arg Arg His80 85 90agg gcg tcg gac ctg cac gag ctg tct gcg ccg tgc cgt ccc tgc agt 576Arg Ala Ser Asp Leu His Glu Leu Ser Ala Pro Cys Arg Pro Cys Ser95 100 105 110
gac acc gag gtg ctc cta gcc gtc tgc acc agc gac ttc gcc gtt cga 624Asp Thr Glu Val Leu Leu Ala Val Cys Thr Ser Asp Phe Ala Val Arg115 120 125ggc tcc atc cag caa gtt acc cac gag cct gag cgg cag gac tca gcc 672Gly Ser Ile Gln Gln Val Thr His Glu Pro Glu Arg Gln Asp Ser Ala130 135 140atc cac cgg cgc gtg agc aga ctc tat cgg cag aaa agc agg gtc ttc 720Ile His Arg Arg Val Ser Arg Leu Tyr Arg Gln Lys Ser Arg Val Phe145 150 155gag ccg gtg ccc gag ggt gac ggc cac tgg cag ggg cgc gtc agg acg 768Glu Pro Val Pro Glu Gly Asp Gly His Trp Gln Gly Arg Val Arg Thr160 165 170ctg ctg gag tgt ggc gtg cgg ccg ggg cat ggc gac ttc ctc ttc act 816Leu Leu Glu Cys Gly Val Arg Pro Gly His Gly Asp Phe Leu Phe Thr175 180 185 190ggc cac atg cac ttc ggg gag gcg cgg ctc ggc tgt gcc cca cgc ttc 864Gly His Met His Phe Gly Glu Ala Arg Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe195 200 205aag gac ttc cag agg atg tac agg gat gcc cag gag ggg ggg ctg aac 912Lys Asp Phe Gln Arg Met Tyr Arg Asp Ala Gln Glu Gly Gly Leu Asn210 215 220cct tgt gag gtt ggc acg gac tga ctccaatcaa g 947Pro Cys Glu Val Gly Thr Asp
225<210>2<211>229<212>PRT<213>人<400>2Met Tyr Pro Thr Gly Ala Leu Ile Val Asn Leu Arg Pro Asn Thr Phe1 5 10 15Ser Pro Ala Arg His Leu Thr Val Cys Ile Arg Ser Phe Thr Asp Ser20 25 30Ser Gly Ala Asn Ile Tyr Leu Glu Lys Thr Gly Glu Leu Arg Leu Leu35 40 45Val Pro Asp Gly Asp Gly Arg Pro Gly Arg Val Gln Cys Phe Gly Leu50 55 60Glu Gln Gly Gly Leu Phe Val Glu Ala Thr Pro Gln Gln Asp Ile Gly65 70 75 80
Arg Arg Thr Thr Gly Phe Gln Tyr Glu Leu Val Arg Arg His Arg Ala85 90 95Ser Asp Leu His Glu Leu Ser Ala Pro Cys Arg Pro Cys Ser Asp Thr100 105 110Glu Val Leu Leu Ala Val Cys Thr Ser Asp Phe Ala Val Arg Gly Ser115 120 125Ile Gln Gln Val Thr His Glu Pro Glu Arg Gln Asp Ser Ala Ile His130 135 140Arg Arg Val Ser Arg Leu Tyr Arg Gln Lys Ser Arg Val Phe Glu Pro145 150 155 160Val Pro Glu Gly Asp Gly His Trp Gln Gly Arg Val Arg Thr Leu Leu165 170 175Glu Cys Gly Val Arg Pro Gly His Gly Asp Phe Leu Phe Thr Gly His180 185 190Met His Phe Gly Glu Ala Arg Leu Gly Cys Ala Pro Arg Phe Lys Asp195 200 205
Phe Gln Arg Met Tyr Arg Asp Ala Gln Glu Gly Gly Leu Asn Pro Cys210 215 220Glu Val Gly Thr Asp22权利要求
1.一种骨质疏松相关的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列选自(a)SEQ ID NO1的编码序列或全长序列；(b)编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)与(a)或(b)限定的核苷酸序列具有至少90％相似性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(d)在高严谨条件下可与(a)或(b)或(c)限定的多核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
2.权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列选自(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少90％相似性的氨基酸序列；(c)将SEQ ID NO2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加衍生的氨基酸序列。
3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的基因。
4.一种遗传工程宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自(a)用权利要求3所述的载体转化或转导的宿主细胞；(b)用权利要求1所述的基因转化或转导的宿主细胞。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体是能与权利要求2所述的蛋白质特异性结合的抗体。
6.一种核酸片段，其特征在于，所述核酸片段含有权利要求1所述的任一基因中8-100个连续的核苷酸。
7.权利要求1所述的骨质疏松相关基因或权利要求2所述的蛋白质在制备预防和/或治疗骨质疏松症的药物中的应用。
8.权利要求1所述的基因在抑制AP-1活化中的应用，其特征在于所述基因在宿主细胞中外源表达会抑制AP-1的活化。
9.权利要求1所述的骨质疏松相关基因或权利要求2所述的蛋白质在制备预防和/或治疗与人体细胞转录因子AP-1有关的疾病的药物中的用途，或在制备调节细胞增殖、凋亡、存活、分化、癌变等的药物或试剂中的用途。
10.一种骨质疏松症或炎症或肿瘤的体外检测方法，其特征在于，利用权利要求5所述的抗体或权力要求6所述的核酸片段来检测宿主样品中的多肽的存在或水平。
全文摘要
本发明公开了一种骨质疏松相关的人类新基因及其编码蛋白和用途。该基因的核苷酸序列选自(a)SEQ ID NO1的编码序列或全长序列；(b)编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的核苷酸序列；(c)与(a)或(b)限定的核苷酸序列具有至少90％相似性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(d)在高严谨条件下可与(a)或(b)或(c)限定的多核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本发明为进一步研究雌激素或人体转录因子与本发明中的基因的调控关系，以及开发治疗骨质疏松症、炎症、和肿瘤以及调节细胞增殖、凋亡、存活、分化、癌变等的新药物，为开创新的临床诊断、疗效评价及预后指标奠定必要的基础。
文档编号A61K38/17GK1982454SQ200510134520
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月15日 优先权日2005年12月15日
发明者林守清, 宫伟雁, 刘勇, 黄曼婷, 邓唯唯, 石太平, 马大龙 申请人:中国医学科学院北京协和医院, 北京诺赛基因组研究中心有限公司