专利名称：花生种间杂交品种的获得、繁殖保存与分子细胞学鉴定方法
技术领域：
本发明涉及花生育种技术，特别是涉及花生种间杂交品种F1的获得、繁殖保存和分子细胞学鉴定方法。
背景技术：
栽培花生在驯化过程中遗传多样性不断降低，可利用的基因资源有限。特别是近年来集约化品种的选育和广泛应用，使得花生品种的遗传基础变得越来越狭窄，生产受到各种病虫害及逆境(旱、涝、盐碱、低温)的胁迫，造成花生品质的降低和产量下降。如何提高 花生对病虫和逆境的抗性及产量，已成为目前花生育种工作的主要目标。花生属包括大约80个种，为一年生或多年生物种，基于形态学、杂交亲和性等将花生属划分为9个区组，12个染色体组。这些野生物种由于经受各种环境的锻炼和考验，形成许多优异基因，而大量花生栽培品种在长期的人工驯化与栽培下已逐渐失去或不具备这些优异基因。利用祖先物种或外源遗传资源创制外源染色体小片段易位或外源等位基因渐渗，将花生野生种有利基因转移至栽培品种，可以增加栽培种资源的遗传多样性，对创制优良新种质和培育新品种具有重要意义。染色体带型技术和原位杂交技术为种间杂种鉴定提供了技术基础。栽培花生由A、B两个染色体组组成，A染色体组有一对特征小染色体。采用DAPI荧光染料对染色体进行荧光显带，可以区分染色体上不同类型的异染色质。经DAPI染色后，A染色体组染色体均有明亮的着丝粒带，B染色体组染色体没有明显的DAPI+带纹，可以初步将花生的A、B染色体组分开。核糖体RNA基因(rDNA)是高度保守的重复序列，成簇分布在一对或多对染色体上。利用45S、5S rDNA为探针进行原位杂交，能有效识别带有核仁组织区的随体染色体。受制于种间杂交不亲和性，花生属许多种之间杂交很难得到发育健全具有生活力的种子(胚珠)，而且种间杂种F1高度不育不实，无法延续世代；同时花生与野生种之间染色质异质性差，为种间杂种鉴定带来了困难。为开发和利用花生野生种的基因资源，申请人多年从事花生野生资源及其远缘杂交技术的研究，在克服花生远缘杂交不育不实和有效利用野生种质方面获得了较大突破，通过胚珠、幼胚离体培养及染色体倍性操作等技术，育成了一批优质、抗病性材料，已通过审定品种3个，其中远杂9102无论是产量、品质、抗性都优于目前推广的同类品种，已成为河南省的主导花生品种，也是我国目前唯一一个通过国家及多个省份审(认)定的推广范围最广、种植面积最大的花生种间杂交品种。
发明内容
本发明要解决的技术问题克服背景技术中的缺陷，提供一种花生种间杂种F1的培育、繁殖、保存和分子细胞学鉴定方法。通过胚珠、幼胚培养和其它组织培养，获得了种间杂种F1植株，解决了 F1植株繁衍和长期保存问题；并综合利用细胞学和分子标记技术对杂种匕的真实性实施鉴定，为转移和利用花生野生种的优良基因提供了技术保障。
本发明的技术方案
花生种间杂种F1的获得方法，是以栽培种白沙1016为母本，以野生种A macedoi为父本，进行人工杂交，经过胚珠和幼胚离体培养得到杂种F1，具体包括
Cl)人工杂交在白沙1016与A. macedoi的始花期，每天下午16:00-18:00，选取母本的花萼微裂花蕾，用镊子轻轻拨开花瓣，去除雄蕊，并在去除雄蕊花朵所在的节位上作标记；第二天上午收集父本花，取其 花粉，用镊子将花粉涂在所述去除雄蕊花朵的母本植株柱头上；经施肥、浇水，60-80天后收获荚果；
(2)胚珠与幼胚离体培养
将所得的荚果消毒处理，取其胚珠，将胚珠接种到由MS、0. 075mg/L ΙΑΑ、0. 01 mg/L Kn和5%鹿糖组成的固体培养基中，置于25°C恒温光照培养间培养；胚珠萌发后及时解剖出幼胚，并进行连续继代培养40-60天，待幼胚发育成F1幼苗；然后将F1幼苗移至由MS、0. 8ppmNAA和3%蔗糖组成的固体生根培养基中，在25°C恒温光照培养间中培养，最后形成根茎叶完整的F1植株。所述荚果消毒处理包括用清水将荚果表面冲洗干净，用5%的次氯酸钠将荚果表面消毒10-15分钟，然后在超净工作台下用无菌水漂洗荚果2-3次，每次5-8分钟；在灭菌纸上用镊子打开荚果果壳，测量并记录荚果、胚珠的长度和发育状况。花生种间杂种F1的繁殖和保存方法，包括如下步骤
(O从超净工作台下的培养基中取出F1幼苗，把幼苗切成2-3段，每段至少保留一片叶子，将幼苗顶芽区段置于由MS、0. 8 mg/L NAA和3%蔗糖组成的固体生根培养基中，培养15-30天，直至获得完整的植株；
(2)将幼苗除顶芽外的其它区段置于由MS、0. I mg/L ΝΑΑ、0· 4 mg/L 6-BA和3%蔗糖组成的固体培养基中，在25°C恒温光照培养间中诱导芽分化15-30天；然后接种到由MS、0. 8mg/L NAA和3%蔗糖组成的固体生根培养基中，培养15-30天，直至形成完整植株；
重复以上两个步骤，繁殖并长期保存杂种匕。花生种间杂种F1的分子细胞学鉴定方法，包括以下步骤
Cl)分别提取母本白沙1016、父本A macedoi和杂种F1植株的基因组DNA ；
(2)利用白沙1016和Amacedoi的特异标记E66进行PCR反应，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析；
进行PCR反应和PCR扩增，反应结束后向PCR扩增产物中加入2 μ 变性的LoadingBuffer，经8%的聚丙烯酰氨凝胶电泳l_2h，用硝酸银染色，在凝胶成像仪上照相观察；根据特异标记E66在杂种F1上是否有无亲本特异扩增条带，鉴定F1杂种的真实性；
所述特异标记E66包括SSR引物左侧序列和右侧序列，SSR引物左侧序列为TCCTTCCCACAATAACAATGAA，
SSR 引物右侧序列为GAGGAGAAAACATGGCCTAAAA ;
(3)父本、母本及F1染色体数目的确定及基因组原位杂交分析取父本、母本及组织培养的F1的健康根尖在有丝分裂中期制片，分别用突光素标记A acet/oi全基因组DNA和5SrDNA探针，用地高辛标记45S rDNA探针，对白沙1016、A macedoi和F1进行荧光原位杂交；用DAPI染色3-4 min，用荧光显微镜照相，根据荧光信号在染色体上的分布统计染色体的数目，进一步鉴定F1杂种的真实性。
所述PCR反应的体积为10 μι，成分包括25 ng/ml的基因组DNA模板0.9 μ 、10 μΜ的SSR引物右侧序列O. 2 μ1、10 μΜ的SSR引物左侧序列O. 2 μ1、 μ1的10XPCRbuffer,2. 5 mM 的 dNTP O. 9 μ1、25 mM 的 MgCl2 O. 8 μ1、0· 5U 的 Taqase O. I μ 和余量的ddH20 ；
所述PCR扩增的程序为94°C预变性3 min，94°C变性30 s，55°C退火45 s，72°C延伸I. 2 min, 33 个循环后 72°C延伸 10 min。所述荧光原位杂交的方法如下
先配制杂交液，杂交液成分为去离子甲酰胺7. 5Pl、20XSSC缓冲液I. 5μ1、50%的硫酸葡聚糖2 Pl、10mg/ml的鲑鱼精DNA O. 5 μ1、 ΝΑ探针2 μ1、100 mg/ml的白沙1016封阻DNA2 μ ，将杂交液混匀后，103°C变性13 min，然后将杂交液立即置于碎冰中冰浴10-15min，在有丝分裂中期制片，_70°C冰冻揭片，酒精脱水后在78°C、70%的甲酰胺中变性I min 10 s,立即置于-20°C 70%、95%、100%的酒精中梯度脱水各5 min，吹干载玻片；将所述杂交液滴到 载玻片上，盖上盖玻片，于37°C杂交6-8 h ；
所述荧光原位杂交方法还包括杂交后的洗涤步骤
室温下用2XSSC浸泡所述制片，使盖玻片和载玻片分离，然后按下列程序洗涤制片42°C条件下分别用2XSSC浸泡10 min、用50%的甲酰胺浸泡10 min、用2XSSC浸泡10 min，室温下用IXPBS浸泡5 min ;将制片浙干，放入37°C暗盒中室温培育30 min，用IXPBS室温洗涤制片3次，每次5 min，最后将制片吹干。本发明的积极有益效果
(O本发明的花生种间杂种F1获得方法中，以栽培种白沙1016为母本，以野生种Amacedoi为父本，进行人工杂交，经过胚珠和幼胚离体培养得到杂种F1。该方法为开发和利用花生野生种的基因资源，在克服花生远缘杂交不育不实和有效利用野生种质方面获得了较大突破。(2)本发明花生种间杂种F1的培育繁殖和保存方法，通过胚珠、幼胚培养和其它组织(器官，如茎段)培养，从行将败育的胚珠中获得种间杂种F1植株。该方法不但克服了种间杂交的不亲和性，而且使杂种F1得到繁殖和长期保存，为转移和利用花生野生种的优良基因提供了便利条件。(3)本发明的花生种间杂种F1的分子标记方法，明确了白沙1016和A macedoi的特异性标记，利用该分子标记结合花粉活力测定和细胞学技术成功鉴定了杂种匕。(4)本发明得到的杂种F1可作为遗传育种研究的材料，通过自交或与栽培种回交，创造染色体附加系、代换系或培育新种质，也可用来进行染色体组加倍获得新材料。(5)本发明形成了一套完整的花生种间杂种的培育、繁殖、保存和鉴定方法，对丰富花生品种的遗传基础，优化育种技术发挥将发挥重要的积极作用。
图I特异标记E66分别在母本白沙1016、父本A macedoi和杂种F1中的扩增结果O可看出，母本(白沙1016)在约170bp处有特异条带,父本(A acet/oi)在约130bp处有特异条带，而杂种F1在170bp、130bp处均有特异条带，说明杂种F1既有来自母本的染色质，又有来自父本的染色质。图2父本、母本及杂种F1的荧光原位杂交鉴定结果。图2a :白沙1016的DAPI+染色结果，可看出白沙1016为42条染色体(栽培花生一对大随体染色体，在细胞学制片中由于次缢痕通常被拉成丝状，一条染色体在影像上表现为4条，实为40条)，A组染色体有着丝粒带；
图2b :用绿色突光素标记A macedoi全基因组探针对白沙1016进行突光原位杂交，可看出A组染色体有杂交信号,表明A. macedoi与白沙1016的A组染色体亲缘关系近；图2c -J. macedoi的DAPI+染色结果,可看出A macedoi有染色体着丝粒带,有24条染色体(有2对随体染色体，在细胞学制片中由于次缢痕通常被拉成丝状，一条染色体在影像上表现为8条，实为20条)；
图2d:分别用地高辛和绿色荧光素标记45S rDNA和5S rDNA探针，用抗地高辛罗丹明检测信号对A fflacet/oi进行突光原位杂交,发现A acet/oi有两对随体染色体；
图2e :杂种F1的DAPI+染色结果，可看出杂交种F1有33条染色体(有3条随体染色体，在细胞学制片中由于次缢痕通常被拉成丝状，一条染色体在影像上表现为6条，实为30条)；
图2f :用绿色突光素标记A macedoi全基因组探针对杂种F1进行突光原位杂交,可看出A组染色体和来自A macedoi的外缘染色体有杂交信号，表明F1是母本(白沙1016)和父本(A macedoi )的杂种，为三单倍体。图3杂种F1减数分裂I期终变期染色体联会情况。可看出染色体有30条，出现了单价体、二价体和三价体，说明白沙1016和A染色体之间有染色体配对，两染色体之间存在同源或部分同源关系。
具体实施例方式以下实施例是为了进一步说明本发明，并不表示对本发明的任何限制。如没有特别说明，其中的百分比均为质量百分比。实施例I、花生种间杂种F1的获得方法
以栽培种白沙1016 (河南省农业科学院经济作物研究所保存)为母本，以野生种Amacedoi (由中国农业科学院油料作物研究所引进)为父本，进行人工杂交，经过胚珠和幼胚离体培养得到杂种F1，具体步骤如下
(I)人工杂交
在在白沙1016与A. macedoi的始花期，每天下午16 :00-18:00，选取母本的花萼微裂花蕾，用镊子轻轻拨开花瓣，去除雄蕊，并在去除雄蕊花朵所在的节位上作标记；第二天上午收集父本花，取其花粉，用镊子将花粉涂在去除雄蕊花朵的母本植株柱头上；经过常规施月巴、浇水，果针露出后固定枝条等措施，60-80天后收获，观察杂交花朵所结荚果。(2)胚珠与幼胚离体培养
杂交荚果收获后，将荚果用自来水洗干净，用5% (质量含量)的次氯酸钠对荚果进行表面消毒10-15分钟，然后在超净工作台下用无菌水洗荚果2-3次，每次5-8分钟；在灭菌纸上用镊子打开荚果果壳，测量并记录荚果、胚珠的长度和发育状况；
本例取七个荚果，平均果壳长17. 71mm，其中有11粒胚，平均胚株长6. 18mm (见表1)，均为未成熟胚珠。表I白沙1016与A macedoi杂种F1的荚果与胚珠长度(mm)
权利要求
1.花生种间杂种F1的获得方法，其特征在于，以栽培种白沙1016为母本，以野生种Amacedoi为父本，进行人工杂交，经过胚珠和幼胚离体培养得到杂种F1，具体包括 Cl)人工杂交在白沙1016与A. macedoi的始花期，每天下午16:00-18:00，选取母本的花萼微裂花蕾，用镊子轻轻拨开花瓣，去除雄蕊，并在去除雄蕊花朵所在的节位上作标记；第二天上午收集父本花，取其花粉，用镊子将花粉涂在所述去除雄蕊花朵的母本植株柱头上；经施肥、浇水，60-80天后收获荚果； (2)胚珠与幼胚离体培养 将所得的荚果消毒处理，取其胚珠，将胚珠接种到由MS、0. 075mg/L ΙΑΑ、0. 01 mg/L Kn和5%鹿糖组成的固体培养基中，置于25°C恒温光照培养间培养；胚珠萌发后及时解剖出幼胚，并进行连续继代培养40-60天，待幼胚发育成F1幼苗；然后将F1幼苗移至由MS、0. 8ppmNAA和3%蔗糖组成的固体生根培养基中，在25°C恒温光照培养间中培养，最后形成根茎叶完整的F1植株。
2.根据权利要求I所述的获得方法，其特征在于所述荚果消毒处理包括，用清水将荚果表面冲洗干净，用5%的次氯酸钠将荚果表面消毒10-15分钟，然后在超净工作台下用无菌水漂洗荚果2-3次，每次5-8分钟；在灭菌纸上用镊子打开荚果果壳，测量并记录荚果、胚珠的长度和发育状况。
3.—种权利要求I所述的花生种间杂种F1的繁殖和保存方法，其特征在于该方法包括如下步骤 (O从超净工作台下的培养基中取出F1幼苗，把幼苗切成2-3段，每段至少保留一片叶子，将幼苗顶芽区段置于由MS、0. 8 mg/L NAA和3%蔗糖组成的固体生根培养基中，培养15-30天，直至获得完整的植株； (2)将幼苗除顶芽外的其它区段置于由MS、0. I mg/L ΝΑΑ、0· 4 mg/L 6-BA和3%蔗糖组成的固体培养基中，在25°C恒温光照培养间中诱导芽分化15-30天；然后接种到由MS、0. 8mg/L NAA和3%蔗糖组成的固体生根培养基中，培养15-30天，直至形成完整植株； 重复以上两个步骤，繁殖并长期保存杂种匕。
4.花生种间杂种F1的分子细胞学鉴定方法，其特征在于该方法包括如下步骤 Cl)分别提取母本白沙1016、父本A macedoi和杂种F1植株的基因组DNA ； (2)利用白沙1016和Amacedoi的特异标记E66进行PCR反应，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析； 进行PCR反应和PCR扩增，反应结束后向PCR扩增产物中加入2 μ 变性的LoadingBuffer，经8%的聚丙烯酰氨凝胶电泳l_2h，用硝酸银染色，在凝胶成像仪上照相观察；根据特异标记E66在杂种F1上是否有无亲本特异扩增条带，鉴定F1杂种的真实性； 所述特异标记E66包括SSR引物左侧序列和右侧序列，SSR引物左侧序列为TCCTTCCCACAATAACAATGAA， SSR 引物右侧序列为GAGGAGAAAACATGGCCTAAAA ; (3)父本、母本及F1染色体数目的确定及基因组原位杂交分析取父本、母本及组织培养的F1的健康根尖在有丝分裂中期制片，分别用突光素标记A acet/oi全基因组DNA和5SrDNA探针，用地高辛标记45S rDNA探针，对白沙1016、A macedoi和F1进行荧光原位杂交；用DAPI染色3-4 min，用荧光显微镜照相，根据荧光信号在染色体上的分布统计染色体的数目，进一步鉴定F1杂种的真实性。
5.如权利要求4所述的分子细胞学鉴定方法，其特征是所述PCR反应的体积为10μ ，成分包括25 ng/ml的基因组DNA模板0.9 μ1、10 μΜ的SSR引物右侧序列O. 2 μ 、10 μΜ 的 SSR 引物左侧序列 O. 2 μ1、 μ1 的 10XPCR buffer、2. 5 mM 的 dNTP O. 9 μ1、25mM 的 MgCl2 O. 8 μ1、0· 5U 的 Taqase O. I μ 和余量的 ddH20 ； 所述PCR扩增的程序为94°C预变性3 min，94°C变性30 s，55°C退火45 s，72°C延伸I. 2 min, 33 个循环后 72°C延伸 10 min。
6.如权利要求4所述的分子细胞学鉴定方法，其特征是所述荧光原位杂交的方法如下 先配制杂交液，杂交液成分为去离子甲酰胺7. 5Pl、20XSSC缓冲液I. 5μ1、50%的硫酸葡聚糖2 Pl、10mg/ml的鲑鱼精DNA O. 5 μ1、 ΝΑ探针2 μ1、100 mg/ml的白沙1016封阻DNA2μ ，将杂交液混匀后，103°C变性13 min，然后将杂交液立即置于碎冰中冰浴10-15min，在有丝分裂中期制片，_70°C冰冻揭片，酒精脱水后在78°C、70%的甲酰胺中变性I min 10 s,立即置于-20°C 70%、95%、100%的酒精中梯度脱水各5 min，吹干载玻片；将所述杂交液滴到载玻片上，盖上盖玻片，于37°C杂交6-8 h。
7.如利要求6述的分子细胞学鉴定方法，其特征是所述荧光原位杂交方法还包括杂交后的洗涤步骤 室温下用2XSSC浸泡所述制片，使盖玻片和载玻片分离，然后按下列程序洗涤制片,42°C条件下分别用2XSSC浸泡10 min、用50%的甲酰胺浸泡10 min、用2XSSC浸泡,10 min，室温下用IXPBS浸泡5 min ;将制片浙干，放入37°C暗盒中室温培育30 min，用IXPBS室温洗涤制片3次，每次5 min，最后将制片吹干。
全文摘要
本发明涉及花生种间杂交品种F1的获得、繁殖保存和分子细胞学鉴定方法。以栽培种白沙1016为母本、野生种A.macedoi为父本进行人工杂交，经胚珠和幼胚离体培养得到F1；繁殖时将幼苗顶芽区段置于固体生根培养基中，培养成完整植株；鉴定时分别提取母本、父本和杂种F1的基因组DNA，利用母本、父本的特异标记E66进行PCR反应，并进行凝胶电泳分析，鉴定杂种F1的真实性。本发明方法为开发和利用花生野生种基因资源方面获得较大突破，克服了种间杂交的不亲和性，使杂种F1得到繁殖和长期保存，为转移和利用花生野生种的优良基因提供了便利条件，利用特异性标记结合和细胞学技术成功鉴定了杂种F1，对丰富花生品种的遗传基础和优化育种技术将发挥重要的积极作用。
文档编号C12Q1/68GK102960237SQ20121047612
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者张新友, 杜培, 徐静, 秦利, 黄冰艳, 董文召 申请人:河南省农业科学院