专利名称：一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecoli-SL26的构建方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecol1-SL26的构建方法。
背景技术：
核苷酸作为重要的食品添加剂和药物中间体而被业界广泛关注并研发，其中 5' -肌苷酸钠(5' -1MP)和5' -鸟苷酸钠(5' -GMP)具有浓烈的鲜味，是新一代鸡精调味品的主要原料，而3'-肌苷酸钠和2'-肌苷酸钠鲜味则基本没有鲜味(周秀芹，2010)。当前， 以肌苷和鸟苷为原料加上合适磷酸供体，采用化学法和酶法催化都可以获得5'-肌苷酸和 5'_鸟苷酸，然而由于酶法具有催化条件温和、专一性较强、对环境友好、特异性高等特点 (Asano 和 MIhara 等，1999;崔桂友，2003 ;宋勇波和储炬等，2003 ；Kuninaka, 1960 )，而受到国内外科研人员和产业界的广泛关注，发展迅速。其中，日本味之素公司已采用酶催化技术生产呈味核苷酸，韩国希杰则利用发酵直接产肌苷酸和鸟苷酸。希望能够充分利用酸性磷酸酶这一催化特性(ZHANG Chong和XING Xinhui等，2005)，以期开发出高效生产呈味核苷酸的酶工程技术。
酸性磷酸化酶在大肠杆菌表达之后，催化过程会表现出一定程度降解肌苷成次黄嘌呤，影响了肌苷的转化率，对后续的提取过程中肌苷的套用增加了难度。发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecol1-SL26的构建方法，用于阻断肌苷转变为次黄嘌呤。
嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)是嘌呤补救合成途径的关键酶之一，广泛存在于原核和真核生物中(Bzowska和Kulikowska等,2000 )。该是一种戍糖基转移酶,催化嘌呤核苷与正磷酸作用生成自由嘌呤及核糖-5-磷酸的反应。
为了实现上述目的，本发明提供一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecol1-SL26的构建方法，为敲除其嘌呤核苷磷酸化酶基因(purine nucleoside phosphorylase,简称PNP),本发明利用Red/ET系统同源重组,在四环素(Tet)和卡那霉素 (Kam)双重抗性下筛选嘌呤核苷磷酸化酶基因成功敲除的大肠杆菌Ecol1-SL26，沉默肌苷水解为次黄嘌呤的途径，提高磷酸转移酶的转化率。
一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecol1-SL26的构建方法，包括如下步骤
(I)通过NCBI查找大肠杆菌PNP基因，设计引物PCR扩增得到同源重组缺失的嘌呤磷酸化酶基因，以验证宿主中PNP的存在；
所述引物为PNP-upper:5’ -TTTTGATGCCAGGCGACCCG-3’ ；
PNP-1ower: 5， -CGGATGTGGTCAGATACGGT-3，；
(2)通过NCBI查找大肠杆菌PNP基因及其上下游基因的同源性情况，根据 K006-Ecol1-Gene Deletion Kit要求，合成可行的同源臂引物PCR，扩增得到在Red/ET系统同源重组中的功能片段；
所述功能段扩征的引物为
deoD_FRT_f
5’-CTGATGGATTTGGGCGGAGCGTTGACTCCGCCTTTGTTATGTCACAAAAAGGATAAAACAAATTAA CCCTCACTAAAGGGCG ；
deoD-FRT-r
5’-AAAGCCGGAGCAGTCTCCCGCTCCGGCTTCACAAGGCAATCGCCTTGCAGCGAAACACAATAATAC GACTCACTATAGGGCTC ；
(3)制备宿主的感受态细胞，电转质粒pRedET，帮助功能片段同源重组
(4)阿拉伯糖诱导含有pRedET的感受态宿主后，电转化线性的功能片段；
(5)在pRedET质粒的帮助下，功能片段与染色体基因组上的PNP进行同源重组
(6)电转化表达质粒706-F1P，帮助消除同源整合到染色体上的抗性标记
(7)通过温度变化，消除抗性标记以及丢失表达质粒706-F1P。
在上述构建方法中，在该方法中用于重组和缺失抗性标记的两个质粒pRedET和 706-FLP 均为 K006-Ecol1-Gene Deletion Kit 提供。
在上述构建方法中，步骤(3)是采用Eppendorf_Electroporator2510电转仪,在 1350V下进行电转。
在上述构建方法中，构建过程所用的培养基均为LB，培养温度在30_37°C，pH在 6. 0_7· O ο
与现有技术相比，本发明具有以下有益的效果
1、本发明通过Red/ET系统同源重组的方式成功敲除了 PNP基因，提高了酶催化的转化率和5' -磷酸化肌苷的纯度，降低了肌苷的损耗和生产成本，有利于后续5' -磷酸化肌苷的提取和残余肌苷的套用，该发明对酶催化肌苷5'-磷酸化产业化进程的推进具有重要意义。
2、本发明运用Red/ET系统同源重组缺失PNP，该方法可以完全镂掉PNP基因，在基因组中不会残留抗性标记，与传统意义的插入失活具有本质的不同。
3、经改造后的工程菌，其催化反应液在后续的提取更加简单，有利于肌苷的回收套用。
4、经改造后的工程菌，简化了提取工艺，更进一步的推进了酶法肌苷磷酸化的产业化进程。
图1 为 PNP 的 PCR 图2为含有同源的功能片段的PCR图3为敲除后的催化液体的高效液相色谱图。
具体的实施方式
实施例1 验证表达磷酸转移酶大肠杆菌是否含有磷酸化转移酶
以大肠杆菌菌悬液为模板，利用以下引物进行菌落PCR初步验证PNP的存在
PNP-upper: 5’ -TTTTGATGCCAGGCGACCCG-3’
PNP-1ower: 5’ -CGGATGTGGTCAGATACGGT-3’
PCR 反应条件为变性 940C，2min ;解链 94°C，Imin ;退火 63 °C，Imin ;延伸 72 °C， lmin30s ;进行30个循环扩增,扩增后72°C延伸lOmin。
实施例2同源重组缺失嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)基因
1、扩增含有同源臂的功能PCR片段，利用引物
deoD--f
5’-CTGATGGATTTGGGCGGAGCGTTGACTCCGCCTTTGTTATGTCACAAAAAGGATAAAAC A j^f^ACCCTCACTAAAGGGCG|
deoD- (FRlj ~r 5’-AAAGCCGGAGCAGTCTCCCGCTCCGGCTTCACAAGGCAATCGCCTTGCAGCGAAACACAA | Α ATA C G AC TC A CTATA GGGCTC
如图1所示。
PCR 反应条件为变性 940C，2min ;解链 94°C，Imin ;退火 65 °C，Imin ;延伸 72 °C， 2min50s ;进行30个循环扩增,扩增后72°C延伸lOmin。
2、缺失嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)的目标菌株筛选
I)感受态制备，转化pRedET。挑取单克隆，过夜培养后，在2°C，IlOOOrpm下离心l-3min,去上清,用Iml预冷的ddH20重悬沉淀,重复以上步骤一次,去上清,残余的20_30μ1 溶解沉淀即为制备好的感受态细胞，加入 μ PRedET质粒到菌体中，小心混匀后将菌体转移至预冷的电转杯中，在1350v进行电转，30°C培养2-3h后涂平板，至含Tet抗性(终浓度 3 Pg/ml)的LB培养液(lml)，30°C过夜培养。筛选含有pRedET质粒的大肠杆菌。
2)制备含有pRedET质粒宿主的感受态细胞，转化功能PCR片段进行同源重组。按同样的方法准备感受态细胞，相同的电转条件下电转，37°C恢复培养3hr。涂布于Km (15 Kg/ml)抗性平板，37°C过夜培养。
3)制备同源重组成功的感受态细胞，转化700-FLP质粒把插入的抗性标记消掉。 挑取同源重组成功的单菌落到Iml LB (Km终浓度5(^g/ml)，37°C过夜培养。按相同的方法制备感受态细胞以及转化700-FLP，30°C培养70min (lOOOrpm)。涂布于Tet (3 μδ/πι1) +Km(15 Pg/ml)双重抗性的平板，30°C培养24hr。如图2为电转质粒pRedET帮助功能片段同源重组示意4)验证长出来的菌落是阳性克隆。涂布LB平板(确保出单菌落)，37°C过夜培养。 第二条PCR验证抗生素去除效果，也可以分别涂布含Km抗性的LB板，以及不含任何抗生素的LB板进行双重验证。从图3可以看出，基本检测不到次黄嘌呤。
权利要求
1.一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecol1-SL26的构建方法，其特征在于包括如下步骤 (1)通过NCBI查找大肠杆菌PNP基因，设计引物PCR扩增得到同源重组缺失的嘌呤磷酸化酶基因，以验证宿主中PNP的存在； 所述引物为PNP-upper: 5’ -TTTTGATGCCAGGCGACCCG-3’ ；PNP-1ower: 5’ -CGGATGTGGTCAGATACGGT-3’ ； (2)通过NCBI查找大肠杆菌PNP基因及其上下游基因的同源性情况，根据K006-Ecol1-Gene Deletion Kit要求，合成可行的同源臂引物PCR，扩增得到在Red/ET系统同源重组中的功能片段； 所述功能段扩征的引物为deoD-FRT-f 5’-CTGATGGATTTGGGCGGAGCGTTGACTCCGCCTTTGTTATGTCACAAAAAGGATAAAACAAATTAACCCTCACTAAAGGGCG ；deoD-FRT-r 5’-AAAGCCGGAGCAGTCTCCCGCTCCGGCTTCACAAGGCAATCGCCTTGCAGCGAAACACAATAATACGACTCACTATAGGGCTC ； (3)制备宿主的感受态细胞，电转质粒PRedET，帮助功能片段同源重组 (4)阿拉伯糖诱导含有pRedET的感受态宿主后，电转化线性的功能片段； (5)在pRedET质粒的帮助下，功能片段与染色体基因组上的PNP进行同源重组 (6)电转化表达质粒706-F1P，帮助消除同源整合到染色体上的抗性标记 (7)通过温度变化，消除抗性标记以及丢失表达质粒706-F1P。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在该方法中用于重组和缺失抗性标记 的两个质粒PRedET和706-FLP均为敲除试剂盒提供。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)是采用Eppendorf-Electroporator2510 电转仪，在 1350V 下进行电转。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，构建过程所用的培养基均为LB，培养温度在 30-37°C，pH 在 6. 0-7. O。
全文摘要
本发明公开了一种嘌呤核苷磷酸化酶基因敲除的大肠杆菌Ecoli-SL26的构建方法，本方法采用Red/ET系统同源重组敲除嘌呤核苷磷酸化酶基因，在四环素(Tet)和卡那霉素(Kam)双重抗性下筛选到了嘌呤核苷磷酸化酶基因成功敲除的菌株Eocli-SL26。本发明成功沉默了肌苷水解为次黄嘌呤的途径，提高了酶催化的转化率和5`-磷酸化肌苷的纯度，降低了肌苷的损耗和生产成本，有利于后续5`-磷酸化肌苷的提取和残余肌苷的套用，该发明对酶催化肌苷5`-磷酸化的产业化进程具有重要意义。
文档编号C12N1/21GK102994537SQ20121047611
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者蔡友华, 郑明英, 严杰能, 陆最青 申请人:广东肇庆星湖生物科技股份有限公司