基于金纳米粒构建的比色生物传感器用于乳腺癌细胞中三磷酸腺苷的含量检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种基于AuNPs构建的比色传感器用于简便、迅速、灵敏性检测乳腺癌细胞中肿瘤标志物三磷酸腺苷的含量检测新方法。
【背景技术】
[0002]三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)是一种核苷酸[1]，又称腺嘌呤核苷三磷酸。ATP是体内组织细胞一切生命活动所需能量的直接来源，储存和传递化学能，参与蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成代谢，可促使机体各种细胞的修复和再生，增强细胞代谢活性，对治疗各种疾病均有较强的针对性。并且细胞中ATP的含量还和许多疾病如贫血、低血糖、心血管疾病以及癌症等有着密切的关系，因此发展一种高效灵敏的方法去检测ATP分子有着非常重要的意义。
[0003]传统的ATP检测方法有电泳法[2]、高效液相色谱法[3]和同位素示踪法[4]等。这些方法存在着操作过程复杂、试剂费用昂贵、不能定点实时迅速检测的问题，因此，构建一种准确、灵敏、简便价廉的ATP检测方法尤为必要。
[0004]比色法操作非常简单，而且结果可以用肉眼很容易观察到，大多数情况也不需要用到精密的仪器。AuNPs由于具有较高的吸光系数、小尺寸效应[5]等光性质可作为比色传感器的传感元件，表现为分散良好的AuNPs水溶液呈现酒红色，由于表面等离子体吸收波长变长，聚集的AuNPs呈现蓝色或紫色。
[0005]4_疏基苯硼酸(4-Mercaptophenylboronic acid，MPBA)含有一个疏基和一个连在对位的硼酸基团JPBA与双醇基特征反应表现为硼酸基团及其衍生物在pH值为6-10范围内可以与I，2_或I，3_戊二醇进行可逆的反应形成稳定的5元或6元环硼酸酯[6—7^ATP结构中具有I，2-双醇基，因此，硼酸与双醇的特征反应是一个可供选择的检测ATP的方法。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种基于金纳米粒构建的比色生物传感器用于乳腺癌细胞中三磷酸腺苷的灵敏检测的方法，该方法简便、迅速、灵敏性高。
[0007]该方法利用4-巯基苯硼酸(MPBA)的巯基与AuNPs通过Au-S键共价结合，在未加ATP时，硼酸基团作为交联剂发生自身三分子脱水缩合引起AuNPs团聚显蓝色;加入ATP，时，ATP分子中顺式邻二醇结构与硼酸基团发生特异酯化反应使AuNPs分散而显红色。
[0008]AuNPs的吸收峰在520nm，聚合物吸收峰在波长为683nm，以A52o/A683吸收比值与ATP浓度进行线性拟合，其线性范围为8.0-100μΜ，检测限为0.12μΜ。
[0009]我们基于AuNPs抗聚集特性首次建立了一种简便、快速、高选择性的ATP的比色传感新方法，并实现了 T47D乳腺癌细胞中ATP灵敏快速含量检测，在临床肿瘤诊疗方面有着潜在的应用价值。
[0010]本发明的目的是通过以下方式实现的:
[0011]—种基于金纳米粒(AuNPs)构建的比色传感器用于简便、迅速、灵敏性检测乳腺癌细胞中肿瘤标志物三磷酸腺苷的含量检测方法，该方法包括以下步骤:
[0012]吸取AuNPs至离心管中，加入用PKS缓冲液稀释40-60倍ATP乳腺癌细胞提取液，孵化3-7min得到混合物，加入4-巯基苯硼酸至混合物中，再加入PKS缓冲液反应10-15min，观察颜色变化，采用紫外分光光度计，以A52Q/A683吸收比值与ATP浓度进行线性拟合，外标法绘制标准曲线，再进行样品浓度的测定。
[00?3 ] AuNPs由梓檬酸还原法制备得到。AuNPs的具体制备步骤如下:取25mM氯金酸5mL，加入120mL双蒸水，120°C搅拌加热至沸腾，然后快速倾入12.5mL柠檬酸钠(38.8mM，I % )，继续搅拌反应3Omi η，得到的酒红色AuNP s，冷却至室温。AuNP s浓度可以为2.7nM，即吸取1.35mL 3nM AuNPs溶液，反应总体积为1.SmLJnM为AuNPs母液稀释4倍。
[0014]MPBA作为AuNPs交联剂，MPBA的浓度为3-7μΜ，即吸取6yL ImM MPBA溶液，反应总体积为1.5mL。
[0015]本发明中，MPBA硼酸基团识别ATP顺式双醇，反应生成硼酸酯结构，ATP发挥AuNPs抗聚集特性。加入MPBA之后，反应10分钟观察颜色变化并进行紫外检测。MPBA的作用为ATP识别分子
[0016]比色反应体系为KH2PO4-NaOH(PKS)缓冲盐;PKS缓冲液离子强度范围为75-125mM，PKS缓冲体系pH范围为6.5-7.5;反应温度范围为0_25°C。
[0017]ATP浓度可以为ΙΟΟμΜ，即吸取10yL 1.5mM ATP溶液，反应总体积为1.5mL。未加入MPBA之前，ATP孵化时间为5分钟。
[0018]ATP乳腺癌细胞提取液的制备步骤如下:T47D细胞经过细胞计数板计数，每3mL的T47D细胞样品中含细胞数8.3 X 16个，取3mL含细胞的培养液，在3000转/分钟的转速下离心7分钟，用磷酸盐缓冲溶液洗涤离心所得细胞，并将其重新分散于200yL的PKS缓冲溶液中，然后，将细胞放在O °C的冰水混合物中超声2 O m i η，以使细胞破碎，然后再在4 °C，18000rpm条件下超滤离心20min，移去细胞碎片匀浆，取清液，并重新悬浮在200yL PKS缓冲液中得到ATP乳腺癌细胞提取液。
[0019]使用Amicon Ultra-0.5超滤离心管进行离心。为了避免细胞中蛋白质的干扰，Amicon Ultra-0.5超滤离心管被用于ATP提取液的离心以去除蛋白质。
[0020]T47D乳腺癌细胞培养步骤如下:T47D乳腺癌细胞培养中细胞培养在含有10%的胎牛血清(FBS)和100IU/mL的青霉素-链霉素的DMEM培养液，孵化器条件为5%C02，37°C。
[0021]本发明癌细胞提取液中ATP浓度检测步骤可以具体如下:吸取1.35mL稀释4倍的AuNPs至2mL离心管中，加入稀释50倍ATP细胞提取液10yL孵化5min。之后加入6yL MPBA(ImM)至混合物中，再加入44yLPKS缓冲液(10mM，pH 7.5)至1.5mL，反应lOmin。
[0022]上述步骤中，在ATP不存在的情况下，MPBA的巯基与AuNPs通过Au-S键共价结合，并且三分子的硼酸基团自身缩合脱去三分子水形成硼氧六圆环，PKS缓冲介质中AuNPs发生明显的聚集而显蓝色，确定MPBA团聚饱和浓度；
[0023]首先加入ATP，ATP结构中的磷酸盐骨架携带负电荷，增加了AuNPs悬浮液中的静电斥力，并不使AuNPs发生聚集;随后加入已确定浓度的MPBA，通过硼酸基团与双醇的反应优先与顺式-2，3-核糖ATP反应生成硼酸酯，保护AuNPs不通过自身脱水缩合发生聚集。
[0024]AuNPs比色生物传感表征中UV-Vis表征利用Shimadzu UV-2450型紫外分光光度计(日本岛津公司)测定，光谱扫描范围400nm-800nm，步长0.Inm; TEM表征将三种样品分别滴在包覆碳膜的铜网上，在空气中自然晾干。用FEI透射电镜(Tecnai G12 Spirit B1 TWIN)测定，加速电压200V;DLS表征将三种样品分别用Zetasizer Nano ZS粒度测量仪(英国Malvern公司)测定颗粒水合平均粒径，设定温度为25°C。
[0025]AuNPs抗聚集比色传感器用于ATP标准曲线与检测限检测步骤如下:在1.35mL八11肥8中加入10(^1^不同浓度为0.014]\1、0.14]\1、14]\1、1(^]\1、10(^]\1、11111的厶了？溶液孵化 5min，再加入6yL MPBA(ImM)并用PKS缓冲溶液(1001^4!17.5)定容到1.51^，反应101^11。肉眼可见随着ATP浓度的增加体系溶液的颜色从紫色逐渐变成红色。根据A520/A683吸收比值与ATP的浓度建立标准曲线，线性范围为8μΜ-100μΜ，检测限为0.12μΜ。
[0026]上述方法中ATP的含量为51.30± 1.2μΜ(η = 3)，加样回收率在99.5%?102.3%之间，RSD小于4.2%。
[0027]与现有技术比较本发明的有益效果:
[0028]I)首次利用ATP双羟基与MPBA硼酸基成酯的特异反应阻碍MPBA自缩合，发挥ATP的AuNPs抗聚集特性，以AuNPs作为比色探针实现了 ATP的肉眼可见的快速分析，操作简单，成本低廉，便于定点实时检测。
[0029]2)本方法成功用于乳腺癌T47D细胞中ATP的灵敏快速检测，回收率高，实验误差小。
[0030]3)基于AuNPs构建的比色生物传感器检测ATP为生物分子的分析研究提供了新思路，在临床疾病诊疗方面有着潜在的应用价值。
【附图说明】
[0031]图1为AuNPs抗聚集检测ATP原理示意图
[0032]图2为实施例1中比色传感检测原理的UV-Vis表征(a.AuNPs b.AuNPs/MPBAc.AuNPs/ATP/MPBA)。溶液中处于良好分散状态的AuNPs呈酒红色，在520nm处有较强的吸收峰(曲线a)。当AuNPs中未加入ATP时，溶液的颜色从红色变成蓝色，可见520nm处的吸收强度降低，在6 8 3nm处出现新的聚合物的吸收峰(曲线b )，表明MPBA使AuNP s发生了聚集。当加入ATP之后，溶液颜色从红色变为紫红色，可见聚合物的吸收峰消失(曲线c)，证明ATP具有抗聚集作用。
[0033]图3为实施例1中比色传感检测原理的透射电镜和动态光扫描表征(a,d.AuNPsb,e.AuNPs/MPBA c，f.AuNPs/ATP/MPBA)。图a透射电镜可见AuNPs粒径均匀并且处于较好分散状态，图d动态光散射证明平均粒径为25nm，证明AuNPs已经生成。未加ATP时，图b可见AuNPs发生明显团聚成块，图e动态光散射显示平均粒径增加到255nm，证明MPBA使AuNPs团聚。加入ATP时，图c可见AuNPs较少聚集，图f证明平均粒径减少为40nm。透射电镜与动态光扫描结果一致，结合紫外图谱(图2)证明ATP起到了抗聚集的作用。
[0034]图4为实施例1中比色传感检测原理的拉曼光谱表征(a.AuNPs b.AuNPs/MPBAc.AuNPs/ATP/MPBA)。分散的AuNPs几乎无拉曼信号，AuNPs作为衬底对含有巯基的化合物具有很强的表面光增强拉曼效应(SERS)，因此结合了MPBA引起AuNPs团聚之后则可以看到很强的拉曼吸收峰，这是由于表面等离子激元耦合形成拉曼热点，极大的增强拉曼散射强度。其中MPBA固体中1335cm—\2555cm—\3045cm—1处的B-O键、S-H键、-OH的拉曼吸收峰消失(曲线a)，在457cm—1和1473cm—1附近出现氧桥B-O-B的拉曼吸收特征峰(曲线b)，表明MPBA成功组装到AuNPs表面并发生了脱水缩合形成B-O-B的六圆环结构。加入了目标物ATP之后(曲线c)，溶液呈分散状态，拉曼信号极大减弱，进一步说明了ATP的抗聚集作用。
[0035]图5为实施例2中构建的比色生物传感器对ATP检测的标准曲线图，从左到右，ATP浓度分别为8,10,12,20,40,60,80, ΙΟΟμΜ，横坐标为ATP浓度，纵坐标为吸光度比值。吸收比(Α683/Α520)随ATP浓度的增加而逐渐增强。在8μΜ-100μΜ内，AuNPs的吸收比值与ATP的浓度呈线性关系，线性回归方程为7 = 0.12321+2.9024，1? = 0.9902。用30法可计算出4了？的检测限为 0.12μΜ。
[0036]图6为实施例3中构建的比色生物传感器对T47D乳腺癌细胞样品中ATP的检测与加样回收率考察。实际样品T47D乳腺癌细胞(?17个，稀释50