倍)中ATP的含量为51.30 ± 1.2μΜ(η = 3)，加样回收率在99.5%?102.3%之间，RSD小于4.2%。
【具体实施方式】
[0037]以下通过实施例对本发明做进一步解释说明:
[0038]药品和试剂:ATP(Adenosine 5’-triphosphate，上海生工生物工程有限公司)、4_巯基苯硼酸(C6H7BO2S,萨恩化学技术(上海)有限公司)、氯金酸(HAuC14，国药集团化学试剂有限公司)、二水合柠檬酸三钠(C6H5NaO7.H20，广东华光化学厂有限公司)、三(羟甲基)氨基甲烷(C4HnNO3,国药集团化学试剂有限公司)、磷酸二氢钠(NaH2PO4,分析纯，南京化学试剂有限公司)、磷酸氢二钠(Na2HPO4,分析纯，上海凌峰化学有限公司)、磷酸二氢钾(KH2PO4,广东汕头市西陇化工厂)、磷酸氢二钾(K2HPO4,广东汕头市西陇化工厂)、氢氧化钠(NaOH，南京化学试剂有限公司)、盐酸(HC1，溧阳东方化学试剂有限公司)、实验用水均为超纯水。
[0039]仪器:精密万分之一电子天平:Shimadzu AUW220D，日本岛津公司；精密十万分之一电子天平:Shimadzu AUW220D，日本岛津公司；紫外-可见光谱仪:Shimadzu UV-2450，日本岛津公司；PHS-3C精密PH计:上海日岛科学仪器有限公司；纳米粒度仪:ZS90，英国Malvern公司；透射电子显微镜:FEI(Tecnai G12 Spirit B1 TWIN);拉曼光谱仪:DXRSmart，美国赛默飞世尔科技公司。
[0040]实施例1
[0041 ] AuNPs的制备方法如下:所有试验用到的的玻璃容器全部用新制备的HNO3-HCl(1:3，V/V)溶液浸泡过夜，再用二次水润洗，在空气中干燥备用。取25mM氯金酸(HAuCl4) 5mL于250mL圆底烧瓶中，加入120mL双蒸水，通过水浴恒温磁力搅拌器120°C加热至沸腾，然后快速倾入12.5mL柠檬酸钠(38.8mM,l% )，继续搅拌反应30min，得到的酒红色AuNPs自然冷却至室温后放入冰箱(4°C )中保存。制备的AuNPs的粒径为13nm，在520nm处有最大吸收峰，紫外测定的浓度为UnM13AuNPs呈较好的单分散状态是由于表面的柠檬酸根的静电排斥力作用反抗AuNPs间的范德华力，使得表面等离子体共振吸收峰在520nm处而显酒红色。
[0042]在ATP不存在的情况下，ΜΡΒΑ(4μΜ)的巯基与AuNPs通过Au-S键共价结合，并且三分子的硼酸基团自身缩合脱去三分子水形成硼氧六圆环，使AuNPs发生明显的聚集显蓝色。当ΑΤΡ(ΙΟΟμΜ)存在时，ATP结构中的磷酸盐骨架携带负电荷，增加了 AuNPs悬浮液中的静电斥力。通过硼酸基团与双醇的反应优先与顺式-2，3-核糖ATP反应生成硼酸酯，保护AuNPs不通过自身脱水缩合发生聚集，使AuNPs分散显红色。
[0043]实施例2
[0044]ATP的标准曲线:吸取1.35mL AuNPs至2mL离心管中，加入不同浓度的体积为10yLATP(提取液)孵化5min。之后加入6yL MPBA( ImM)至混合物中，再加入44yLPKS缓冲液(10mM,pH 7.5)，反应1min观察颜色变化并进行紫外分光光度计测定。
[0045]ATP的选择性:吸取 1.35mL AuNPs至2mL离心管中，加入ΙΟΟμΜ GTP110yM UTP, 100μΜ CTP，三种ATP类似物与ΙΟΟμΜ ATP孵化5min，之后加入6yL MPBA(ImM)至混合物中，再加入44yLPKS缓冲液(100mM，pH 7.5)，反应1min观察颜色变化并进行紫外分光光度计测定。
[0046]通过以下方法对本发明AuNPs比色生物传感器进行检测:
[0047]颜色变化:反应1min后利用Nikon D3100相机拍摄观察。
[0048]紫外可见分光光度仪:检测光谱扫描范围400nm-800nm，步长0.lnm。
[0049]实施例2中构建的比色生物传感器对ATP的选择性:考察ΙΟΟμΜ GTP, ΙΟΟμΜ UTP,ΙΟΟμΜ CTP，三种ATP类似物与ΙΟΟμΜ ATP对MI3BA-AuNPs的抗聚集效应，加入三种类似物后AuNPs溶液迅速变蓝，出现聚合物的吸收峰，表明三种类似物不具有抗聚集作用。而加入相同浓度的ATP后，AuNPs溶液呈分散状态显红色，且Α520/Α683吸收比值显著高于三种类似物，结果表明该方法对ATP的检测具有较高的特异性。
[0050]实施例3
[0051 ]细胞培养:T47D乳腺癌肿瘤细胞细胞株是由美国模式培养物集存库提供，然后放入细胞培养瓶中培养，细胞在含有10%的胎牛血清(FBS)和100IU/mL的青霉素-链霉素的DMEM培养液中培养，孵化器条件为5 % CO2，37 °C。
[0052] 癌细胞中三磷酸腺苷ATP的提取:T47D细胞经过细胞计数板计数后(每3mL的T47D细胞样品中含细胞数大约8.3 X 16个)，取一定体积的含细胞的培养液，在3000转每分的转速下离心7分钟，用磷酸盐缓冲溶液洗涤离心所得细胞，并将其重新分散于一定体积的PKS缓冲溶液中。然后，将细胞放在冰水混合物(0°C中超声20min，以使细胞破碎。然后再离心(18000rpm，20min，4°C )以移去细胞碎片匀浆，留下清液，并重新悬浮在200yL PKS缓冲液中。为了避免细胞中蛋白质的干扰，Ami con Ultra-0.5超滤离心管被用于ATP提取液的离心以去除蛋白质。
[0053 ] 超滤离心后的ATP提取液用PKS缓冲液稀释50倍。
[0054]ATP的样品检测:吸取1.35mL AuNPs至2mL离心管中，加入上述用PKS缓冲液稀释50倍的ATP提取液10yL，孵化5min得到混合物，之后加入6yL MPBA(ImM)至混合物中，再加入44yLPKS缓冲液(100mM，pH 7.5)，反应lOmin，观察颜色变化并进行紫外分光光度计测定，以A520/A683吸收比值与ATP浓度进行线性拟合，外标法绘制标准曲线，再进行样品浓度的测定。
[0055]参考文献
[0056][I Jffang ff.1sothermal amplified detect1n of ATP using Au nanocagescapped with a DNA molecular gate and its applicat1n in cell lysates[J].Analyst,2015,140(5):1672-1677.
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【主权项】
1.一种基于金纳米粒构建的比色生物传感器用于乳腺癌细胞中三磷酸腺苷的含量检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤: 吸取AuNPs至离心管中，加入用PKS缓冲液稀释40-60倍ATP乳腺癌细胞提取液，孵化3-7min得到混合物，加入4-巯基苯硼酸至混合物中，再加入PKS缓冲液反应10_15min，观察颜色变化，采用紫外分光光度计，以A52Q/A683吸收比值与ATP浓度进行线性拟合，外标法绘制标准曲线，再进行样品浓度的测定。2.根据权利要求1所述的含量检测方法，其特征在于AuNPs由柠檬酸还原法制备得到。3.根据权利要求1所述的含量检测方法，其特征在于MPBA的浓度范围为3-7μΜ。4.根据权利要求1所述的含量检测方法，其特征在于PKS缓冲液离子强度范围为75-125mM，PKS缓冲体系pH范围为6.5_7.5;反应温度范围为0_25 °C。5.根据权利要求1所述的含量检测方法，其特征在于AuNPs的制备步骤如下:取25mM氯金酸5mL，加入120mL双蒸水，120 °C搅拌加热至沸腾，然后快速倾入12.5mL柠檬酸钠，继续搅拌反应30min，得到的酒红色AuNPs，冷却至室温。6.根据权利要求1所述的含量检测方法，其特征在于乳腺癌细胞为乳腺癌细胞T47D。7.根据权利要求1所述的含量检测方法，其特征在于ATP乳腺癌细胞提取液的制备步骤如下:取3mL含细胞的培养液，在3000转/分钟的转速下离心7分钟，用磷酸盐缓冲溶液洗涤离心所得细胞，并将其重新分散于200yL的PKS缓冲溶液中，然后，将细胞放在(TC的冰水混合物中超声20min，然后再在4°C，18000rpm条件下超滤离心20min，取清液，并重新悬浮在200yL PKS缓冲液中得到ATP乳腺癌细胞提取液。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于使用AmiconUltra-0.5超滤离心管进行离心。
【专利摘要】本发明公开了一种基于金纳米粒构建的比色生物传感器用于乳腺癌细胞中三磷酸腺苷的含量检测方法，该方法包括以下步骤：吸取AuNPs至离心管中，加入用PKS缓冲液稀释40?60倍ATP乳腺癌细胞提取液，孵化3?7min得到混合物，加入4?巯基苯硼酸至混合物中，再加入PKS缓冲液反应10?15min，观察颜色变化，采用紫外分光光度计，以A520/A683吸收比值与ATP浓度进行线性拟合，外标法绘制标准曲线，再进行样品浓度的测定。本发明中构建了一种操作简便、价格低廉、响应灵敏检测乳腺癌细胞中ATP含量的比色生物传感分析新方法，对临床癌症的诊疗有重要意义。
【IPC分类】G01N33/574, G01N21/78
【公开号】CN105717103
【申请号】CN201610055701
【发明人】周学敏, 江郭一, 沈心, 徐磊, 李晓旭, 王芮, 刘春雨
【申请人】南京医科大学
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年1月27日