专利名称：细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法
技术领域：
本发明涉及自动化显微注射领域，尤其涉及一种细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法。
背景技术：
显微注射(microinjection)技术是在显微镜下操作的微量注射技术。可将细胞的某一部分(如细胞核、细胞质或细胞器)或外源物质(如外源基因、DNA片段、信使核糖核酸、蛋白质、药物等)通过玻璃毛细管拉成的细针，注射到细胞质或细胞核内。显微注射技术是研究各种生物分子的作用、制作转基因动物、克隆动物等的重要技术。显微注射技术的应用范围非常广泛，从辅助(体外)细胞受精技术至分子和细胞基本组分的转运等都需使用这一技术。传统的显微注射技术为手工操作，技术复杂、难度大，需要长时间的练习，才能掌握。手工操作精确度、稳定性较差。工作效率低，工作人员劳动强度高，每次注射的细胞数目有限，不能保证获得大量的注射细胞，依靠人眼识别和手工操作无法保证细胞的重复注射。在传统显微注射技术的基础上发展而来的机械化显微注射系统，利用可控视觉系统与机械操作手系统极大的克服了传统手工的缺点，很大程度上提高了操作精度与稳定性，也进一步提高了工作效率，可以称为半自动化的显微注射技术。虽然机械化显微注射系统是显微注射技术的一个重要突破点，但是也存在了一些重要的缺陷查找注射的细胞依然是通过人工操作，实验人员通过在计算机上控制平台的移动观察细胞培养皿，选择感兴趣注射的细胞进行注射，待注射结束后只要细胞培养皿有微小偏移或者取下细胞培养皿再次安装到载物台，就很难找到注射过的细胞，并且，通过人工的查找需要花费大量的时间。所以说，机械化显微注射系统离真正的自动化显微注射技术还相差甚远。因此，针对上述技术问题，有必要提供一种具有改良结构的基于显微注射的细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法，以克服现有技术中存在的缺陷。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法，极大的简化了对被注射细胞的扫描、查询与定位操作，为显微注射技术提供了更加便捷的操作方法，加深了自动化操作程度，进一步提高了工作效率，是自动化显微注射技术的一个重要组成部分。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案一种细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法，所述方法基于细胞注射平台系统，运用到显微视觉反馈系统与X/Y精密载物台系统，所述显微视觉反馈系统包括倒置生物显微镜、CXD摄像头、计算机，所述CXD摄像头连接计算机与倒置生物显微镜，在显微镜下的操作均在计算机上观察与实行，通过CCD摄像头将显微镜下的操作反馈到计算机屏幕上CCD摄像头显示区域上，通过计算机执行区域化扫描、扫描过程中的感兴趣点记录以及扫描完毕后兴趣点的追踪定位，所述X/Y精密载物台系统设有与计算机连接的X/Y精密载物平台，所述X/Y精密载物平台装载用于显微注射的细胞培养皿，所述方法具体包括如下步骤( I)将细胞培养皿置于X/Y精密载物平台上，设置一个坐标原点；(2)设置细胞培养皿逐巾贞扫描的扫描范围；(3)自动扫描开始，如有感兴趣点则暂停扫描，在该帧图像上选择感兴趣点并且记录于文件，并且对保存的感兴趣点的位置自动编号，该帧图像上的感兴趣点选择完毕后继续执行扫描，如没有感兴趣点，则计算机自动执行下一帧图像的扫描；(4)重复步骤(3)的操作直至整个扫描过程结束或者人工直接结束扫描；(5)执行上述步骤(I) (4)后，若细胞培养皿未被移动过，则操作者直接录入步 骤(3)中保存的感兴趣点的位置编号，便能执行追踪定位到该些感兴趣点，若细胞培养皿被移动过，则操作人员先通过计算机控制X/Y精密载物平台移动使得平台回归到扫描开始设置的坐标原点处，根据坐标原点以及保存的感兴趣点文件，录入保存的感兴趣点编号便能执打追S示定位到感兴趣点；(6)感兴趣点追S示定似结束。优选的，在上述细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法中，所述步骤(I)中所述的坐标原点的确定具体包括步骤在细胞培养皿的中心做好微型标记；计算机控制X/Y精密载物平台移动，使得细胞培养皿中心的微型标记“+s与计算机屏幕上CXD摄像头显示区域中心的标记重合，所述两个字标记重合的地方即为坐标原点。优选的，在上述细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法中，所述步骤(3)中扫描的相邻两帧图像之间的停顿时间为2 3秒，此停顿时间便于操作人员观察该帧图像上是否有感兴趣点。优选的，在上述细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法中，所述X/Y精密载物平台的移动精度为微米级，其移动范围覆盖整个细胞培养皿。从上述技术方案可以看出，本发明实施例的方法克服了传统的人工繁琐、无规则以及无记忆功能的缺陷，极大的简化了对被注射细胞的扫描、查询与定位操作，为显微注射技术提供了更加便捷的操作方法，加深了自动化操作程度，进一步提高了工作效率。与现有技术相比，本发明的有益效果是( I)带记忆性、可编辑性、重复性操作。(2)能够实现对组织切片，病理切片等的数字自动化扫描。(3)克服了传统的在显微镜下无规则的人工操作。(4)结合自动化微纳操作技术，提高了在显微镜下的工作效率。(5)能够实现对扫描过的组织切片，病理切片等局部的准确定位，快速定位于标记处，方便实验人员观察。(6)能够实现对培养皿中细胞的准确定位，有利于快速的进行细胞筛选，并且能够很好的结合自动化显微注射技术。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的有关本发明的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图I是本发明细胞培养皿的扫描以及感兴趣点的记录流程图；图2是本发明兴趣点的追踪定位流程图；图3是本发明具体实施例中定义扫描范围进行逐帧扫描与兴趣点的保存示意图；
图4是本发明具体实施例中最终得到的整个自定义扫描范围的全景图像；图5是本发明细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法的流程图。
具体实施例方式本发明公开了一种细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法，该方法克服了传统的人工繁琐、无规则以及无记忆功能的缺陷，极大的简化了对被注射细胞的扫描、查询与定位操作，为显微注射技术提供了更加便捷的操作方法，加深了自动化操作程度，进一步提高了工作效率，是自动化显微注射技术的一个重要组成部分。该细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法基于细胞注射平台系统，运用到显微视觉反馈系统与X/Y精密载物台系统，所述显微视觉反馈系统包括倒置生物显微镜、CCD摄像头、计算机，所述CCD摄像头连接计算机与倒置生物显微镜，在显微镜下的操作均在计算机上观察与实行，通过CCD摄像头将显微镜下的操作反馈到计算机屏幕上CCD摄像头显示区域上，通过计算机执行区域化扫描、扫描过程中的感兴趣点记录以及扫描完毕后兴趣点的追踪定位，所述X/Y精密载物台系统设有与计算机连接的X/Y精密载物平台，所述X/Y精密载物平台装载用于显微注射的细胞培养皿，所述方法具体包括如下步骤( I)将细胞培养皿置于X/Y精密载物平台上，设置一个坐标原点；(2)设置细胞培养皿逐巾贞扫描的扫描范围；(3)自动扫描开始，如有感兴趣点则暂停扫描，在该帧图像上选择感兴趣点并且记录于文件，并且对保存的感兴趣点的位置自动编号，该帧图像上的感兴趣点选择完毕后继续执行扫描，如没有感兴趣点，则计算机自动执行下一帧图像的扫描；(4)重复步骤(3)的操作直至整个扫描过程结束或者人工直接结束扫描；(5)执行上述步骤(I) (4)后，若细胞培养皿未被移动过，则操作者直接录入步骤(3)中保存的感兴趣点的位置编号，便能执行追踪定位到该些感兴趣点，若细胞培养皿被移动过，则操作人员先通过计算机控制X/Y精密载物平台移动使得平台回归到扫描开始设置的坐标原点处，根据坐标原点以及保存的感兴趣点文件，录入保存的感兴趣点编号便能执打追S示定位到感兴趣点；(6)感兴趣点追S示定似结束。所述步骤(I)中所述的坐标原点的确定具体包括步骤在细胞培养皿的中心做好微型标记；计算机控制X/Y精密载物平台移动，使得细胞培养皿中心的微型标记“+”与计算机屏幕上CXD摄像头显示区域中心的标记“+”重合，所述两个“~p5字标记重合的地方即为坐标原点。所述步骤(3)中扫描的相邻两帧图像之间的停顿时间为2 3秒，此停顿时间便于操作人员观察该帧图像上是否有感兴趣点。所述X/Y精密载物平台的移动精度为微米级，其移动范围覆盖整个细胞培养皿。下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。请参阅图I、图2及图5所示,本发明细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法的关键所在为选取细胞培养皿上的一个点作为基准点，通过计算机辅助设计，能够精确获取细胞培养皿上的任何点的位置，并且能够准确的定位于感兴趣点，以及能够 自动化逐帧扫描整个细胞培养皿，达到图像的无缝拼接。本发明也可用于病理切片的自动化扫描，将整个载玻片全方位信息快速的扫描，整个扫描过程全自动化，突破了传统的在显微镜下人工的扫描模式，使医生脱离在显微镜下繁琐的人工观察过程，扫描的图片存储为数字化信息，免去了切片在运输过程中易碎的特点，便于医生之间、医生与病人之间的远程交流。本发明主要涉及两个功能，分别为I.用户可选区域的细胞培养皿自动化逐帧扫描以及扫描过程中的感兴趣点(即感兴趣细胞的位置)的记录；2.扫描结束后，感兴趣点精确的追踪定位。本发明基于细胞注射平台系统，运用到视觉系统与精密载物台系统，视觉系统为由C⑶摄像头分别连接显微镜与计算机而组成，精密载物台系统为X/Y 二维精密载物平台，通过CXD摄像头反馈显微镜下的操作于计算机屏幕上CXD摄像头显示区域，通过计算机执行区域化扫描，扫描过程中的感兴趣点记录以及扫描完毕后兴趣点的追踪定位。如图I及图5所示，功能I的具体要素与实现方式X/Y精密载物平台装载用于显微注射的细胞培养皿，其移动精度为O. 01微米，其移动范围覆盖整个细胞培养皿。细胞培养皿自动扫描过程分为设置坐标原点、开始扫描、暂停/继续扫描、结束扫描。其中，坐标原点的设置为通过在计算机上操作与观察X/Y精密载物平台的移动，当事先在细胞培养皿上做好的微型标记“+” (可用显微切割等方法)与计算机屏幕上CXD摄像头显示区域的标记重合的时候，两个字标记重合的位置即为坐标原点(0，O)。设置完毕坐标原点后，操作人员设置扫描范围，扫描过程为逐帧扫描，不存在重复扫描，每一帧图像拼合即为设置的扫描范围。扫描的相邻两帧图像之间的停顿为2 3秒，此停顿时间便于操作人员观察该帧图像上是否有感兴趣点如有感兴趣点则暂停扫描，在该帧图像上选择感兴趣点并且记录于文件，并且对保存的感兴趣点自动编号，该帧图像上的感兴趣点选择完毕后继续执行扫描，如没有感兴趣点，则待暂停时间经过后，计算机自动执行下一帧图像的扫描，重复以上的操作直至整个扫描过程结束或者人工直接结束扫描。图I为具体的图像的逐帧扫描以及兴趣点的记录操作流程图。如图2及图5所示，功能2的具体要素与实现方式
在细胞培养皿扫描过程中保存的兴趣点，计算机对这些保存的点的位置自动编号，操作者录入点的编号，便能执行追踪定位到该点，本发明能够精确的定位到任意保存过的感兴趣点。鉴于在细胞培养皿上有做好的微型标记以及计算机屏幕上C⑶摄像头显示区域的标记，扫描结束后无论操作者如何移动培养皿，操作人员通过计算机移动X/Y精密载物平台使得上述的两个重合，使得平台回归到扫描开始设置的坐标原点处，根据坐标原点以及保存的感兴趣点文件，录入保存的感兴趣点编号便能定位到该点于计算机屏幕上CXD摄像头显示区域的“+”标记处，而且无论显微镜在何种放大倍数下切换(特定观察需要)，不影响细胞定位的准确性。图2为追踪定位保存过的感兴趣点的具体操作流程图。下面结合具体的实施例对本发明的方法进行具体的阐述。步骤一自定义扫描范围，扫描过程中保存每一帧图像，扫描过程中遇到感兴趣点暂停扫 描，保存感兴趣点。首先，放置样品于X/Y精密载物平台，对齐样品中心的微型标记“+”与计算机上摄像头显示区域中心“+”，使两个微型标记中心重合，并且保持两个之间无夹角，固定好样品防止扫描过程中的松动；然后，定义中心重合的两个“+”为坐标原点。具体扫描方向如图3所示，定义扫描范围为3X3，也即一共9帧图像，开始扫描，任意两帧图像之间预留2_3秒时间为实验人员提供观察时间，观察该幅图像是有感兴趣点，如果有感兴趣点则暂停扫描，选取感兴趣点(一幅图像可以选取多个点)，选取结束后继续扫描下一帧图像。该实施例中在每一副图像中选取任意一点作为兴趣点。在选取完第九点以后，扫描结束。扫描过程中对保存的每帧图像自动编号，依据扫描范围顺序拼接每一帧图像，最终得到整个自定义扫描范围的全景图像，如图4所示，图4即为最终得到整个自定义扫描范围的全景图像。另外，在扫描过程中选取兴趣点的同时，已经自动保存选取的兴趣点的位置信息。步骤二对于在步骤一中扫描过的样品，在后续的实验中有可能已经从载物台取下该样品，或者样品已经脱离了原来的位置，现对保存的感兴趣点回归定位。首先，依然对齐样品中心的微型标记“+”与计算机上摄像头显示区域中心使两个微型标记“+”中心重合，并且保持两个“+”之间无夹角，固定好样品防止扫描过程中的松动；然后，定义中心重合的两个为坐标原点，录入步骤一中保存的兴趣点的位置信息；最后，输入要定位的点的序号，载物台自动移动使得选取的点定位于计算机摄像头显示区域的“+”字标记处，完成定位。本发明实施例的方法克服了传统的人工繁琐、无规则以及无记忆功能的缺陷，极大的简化了对被注射细胞的扫描、查询与定位操作，为显微注射技术提供了更加便捷的操作方法，加深了自动化操作程度，进一步提高了工作效率。与现有技术相比，本发明的有益效果是( I)带记忆性、可编辑性、重复性操作。(2)能够实现对组织切片，病理切片等的数字自动化扫描。(3)克服了传统的在显微镜下无规则的人工操作。
(4)结合自动化微纳操作技术，提高了在显微镜下的工作效率。(5)能够实现对扫描过的组织切片，病理切片等局部的准确定位，快速定位于标记处，方便实验人员观察。(6)能够实现对培养皿中细胞的准确定位，有利于快速的进行细胞筛选，并且能够很好的结合自动化显微注射技术。对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包 含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
权利要求
1.一种细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法，其特征在于所述方法基于细胞注射平台系统，运用到显微视觉反馈系统与X/Y精密载物台系统，所述显微视觉反馈系统包括倒置生物显微镜、CXD摄像头、计算机，所述CXD摄像头连接计算机与倒置生物显微镜，在显微镜下的操作均在计算机上观察与实行，通过CXD摄像头将显微镜下的操作反馈到计算机屏幕上CCD摄像头显示区域上，通过计算机执行区域化扫描、扫描过程中的感兴趣点记录以及扫描完毕后兴趣点的追S示定位，所述X/Y精S载物台系统设有与计算机连接的X/Y精密载物平台，所述X/Y精密载物平台装载用于显微注射的细胞培养皿，所述方法具体包括如下步骤 (1)将细胞培养皿置于X/Y精密载物平台上，设置一个坐标原点； (2)设置细胞培养皿逐帧扫描的扫描范围； (3)自动扫描开始，如有感兴趣点则暂停扫描，在该帧图像上选择感兴趣点并且记录于文件，并且对保存的感兴趣点的位置自动编号，该帧图像上的感兴趣点选择完毕后继续执行扫描，如没有感兴趣点，则计算机自动执行下一帧图像的扫描； (4)重复步骤(3)的操作直至整个扫描过程结束或者人工直接结束扫描； (5)执行上述步骤(I) (4)后，若细胞培养皿未被移动过，则操作者直接录入步骤(3)中保存的感兴趣点的位置编号，便能执行追踪定位到该些感兴趣点，若细胞培养皿被移动过，则操作人员先通过计算机控制X/Y精密载物平台移动使得平台回归到扫描开始设置的坐标原点处，根据坐标原点以及保存的感兴趣点文件，录入保存的感兴趣点编号便能执行追足示定位到感兴趣点； (6)感兴趣点追踪定位结束。
2.根据权利要求I所述细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法，其特征在于步骤(I)中所述的坐标原点的确定具体包括步骤 在细胞培养皿的中心做好微型标记； 计算机控制X/Y精密载物平台移动，使得细胞培养皿中心的微型标记与计算机屏幕上CXD摄像头显示区域中心的标记重合，所述两个字标记重合的地方即为坐标原点。
3.根据权利要求I所述细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法，其特征在于所述步骤(3)中扫描的相邻两帧图像之间的停顿时间为2 3秒，此停顿时间便于操作人员观察该帧图像上是否有感兴趣点。
4.根据权利要求I所述细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法，其特征在于所述X/Y精密载物平台的移动精度为微米级，其移动范围覆盖整个细胞培养皿。
全文摘要
一种细胞培养皿自动化扫描记录与兴趣细胞跟踪定位的方法，该方法基于细胞注射平台系统，通过计算机执行区域化扫描、扫描过程中的感兴趣点记录以及扫描完毕后兴趣点的追踪定位，该方法选取细胞培养皿上的一个点作为基准点，通过计算机辅助设计，能够精确获取细胞培养皿上的任何点的位置，并且能够准确的定位于感兴趣点，以及能够自动化逐帧扫描整个细胞培养皿，达到图像的无缝拼接，该方法克服了传统的人工繁琐、无规则以及无记忆功能的缺陷，极大的简化了对被注射细胞的扫描、查询与定位操作，为显微注射技术提供了更加便捷的操作方法，加深了自动化操作程度，进一步提高了工作效率。
文档编号C12N15/89GK102965395SQ20121047600
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月21日 优先权日2012年11月21日
发明者汝长海, 陈瑞华, 钱驰 申请人:苏州大学