慢性乙型肝炎的免疫基因治疗药物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域中的基因治疗药物，特别是涉及一种慢性乙型肝炎的免 疫基因治疗药物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 慢性乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV)引起的严重传染 疾病。全球目前有20亿人感染过乙肝病毒，其中约4亿人为乙肝病毒慢性感染者，HBV的 持续感染会导致其中部分患者恶化为肝硬化甚至肝细胞癌，每年死于HBV引起的肝脏相关 疾病的人数达到一百万人。
[0003]目前，抗病毒治疗是临床上最有效的慢性乙型肝炎治疗手段，常用的乙肝抗病毒 治疗药物有干扰素和核苷类似物等，核苷类似物和干扰素通过抑制乙肝病毒的复制和合成 常被用于临床治疗，其中干扰素还具有一定的免疫调节作用。尽管这些抗病毒药物能够有 效降低患者体内的病毒数量，甚至有时可降至检测不到的水平，但停药后很快会出现病情 反复。核苷类似物（如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦等）可通过抑制DNA逆转录酶活性 而抑制乙肝病毒的复制，尽管其能够有效降低患者血清中病毒DNA拷贝数，甚至达到检测 不到的程度，但是不能抑制抗药病毒的产生，而且核苷类似物很少能够通过有效消除受感 染肝细胞中的残余病毒达到对HBV感染的长期免疫控制的目的，很难实现乙肝表面抗原 (HBsAg)和HBeAg的血清转阴或完全清除，因此，长期使用核苷类似物容易产生耐药性，停 药后易出现反弹。干扰素（interferon，IFN)具有直接抗病毒作用和免疫调节作用，可有效 提高机体免疫力，但只能注射给药，具有持续应答率低、副作用多、治疗疗程长、价格昂贵等 缺点。因此，探寻有效的新型治疗药物及方案是治疗慢性乙肝的当务之急。
[0004] 基因治疗（gene therapy)是一种通过向患者祀细胞导入正常基因或者治疗性基 因片段以替代患者体内致病基因可改变人体内遗传物质的新型治疗手段。将外源性抗病 毒因子导入靶细胞内，通过在不同水平细胞因子基因和共刺激分子基因的表达抑制病毒的 复制，有效诱导机体产生免疫应答，同时还能避免长期给药引发的耐药性和副作用。基因治 疗（gene therapy)作为一种结合了基因重组技术、靶向免疫治疗等多种技术的生物治疗方 法，逐渐被人们应用于治疗严重威胁人类健康的多种疾病，如乙型肝炎、恶性肿瘤、单基因 遗传病、心脑血管疾病和艾滋病等。
[0005] 抗乙肝病毒免疫基因治疗是将外源性的抗乙肝病毒因子导入靶细胞内，在不同水 平上通过细胞因子基因和共刺激分子基因的表达抑制乙肝病毒的复制，诱导机体产生免疫 应答，同时还可避免由于长期给药引发的耐药性和副作用。作为一种能有效避免引发耐药 性和副作用的全新治疗手段，基因治疗的应用前景显得尤为广阔。
[0006] 基因治疗导入机体的途径有两种，一种是体外基因治疗（ex vivo)途径，即取出患 者体内将要导入目的基因的靶细胞，在体外培养后将治疗基因转入靶细胞，再将携带有外 源基因的靶细胞回输到人体内，通过靶细胞内基因表达产物达到对机体进行免疫治疗的目 的。另一种是体内基因治疗（in vivo)，即将承载有治疗性基因片段的载体直接导入机体靶 细胞，使其在体内获得表达。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种免疫及治疗效果较好的且能够适应临床上对生物治疗 药物的实际需求，提高临床应用安全性的治疗慢性乙型肝炎的免疫基因治疗药物。
[0008] 本发明所提供的慢性乙型肝炎免疫基因治疗药物，其活性成分是以pSVK载 体为出发载体构建的携带融合基因dSFVa-IRES_hIL12的可复制型重组载体，命名为 pSVK-dSFV a -IRES-hIL-12 (简称 pSVK-HBVE)，所述融合基因 dSFV a -IRES_hIL12 是由融合 基因dSFV a和人白介素-12基因通过IRES序列相连，所述融合基因dSFV a包括人源化抗 HBsAg dsFv抗体基因和人干扰素a基因。
[0009] 所述可复制型重组载体pSVK-HBVE的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
[0010] 所述PSVK载体核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0011] 所述融合基因 dSFVa-IRES_hIL12 由命名为 pVAX-dSFVa-IRES-hIL_12(简称 pVAX-HBVE)的重组质粒双酶切得到，pVAX-HBVE核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0012] 其中pVAX-HBVE通过以下方法构建得到：
[0013]1)、构建pEE14. 1-dSFV a载体：将人源化抗HBsAgdsFv抗体基因与人干扰素a 基因导入载体PEE14. 1，获得携带有人源化抗HBsAgdsFv抗体基因与人干扰素a基因的重 组载体，命名为pEE14.1_dSFVa ;
[0014]2)、获得融合基因dSFV a:双酶切PEE14. 1-dSFV a载体得到人源化抗HBsAg dsFv 抗体和人干扰素a融合基因，命名为dSFVa ;
[0015]3)、构建pVAX-IRES-hIL-12载体：将人白介素12(IL-12)基因导入载 体pVAX-IRES，获得携带IRES序列与人白介素12(IL-12)基因的重组载体，命名为 pVAX-IRES-hIL-12 ；
[0016] 4)、获得 pVAX-IRES-hIL-12 载体片段：双酶切 pVAX-IRES-hIL-12 载体得到 pVAX-IRES-hIL-12载体的Nhe I和EcoR I双酶切片段；
[0017] 5)、dSFVa融合基因与pVAX-IRES-hIL-12载体片段的连接：将步骤2)获得的 dSFVa融合基因与步骤4)获得的pVAX-IRES-hIL-12载体片段进行连接得到连接物；
[0018] 6)、连接产物的转化：将连接产物向感受态大肠杆菌E.coli.trans5a中转 化，阳性克隆质粒即为携带dSFVa融合基因和人白介素-12基因的重组质粒，命名为 pVAX-dSFV a -IRES-hIL-12 (简称 pVAX-HBVE)。
[0019] 本发明还提供一种构建如上所述pSVK-HBVE的方法，包括以下步骤：
[0020] 1)构建携带dSFVa-IRES_hIL12融合基因的重组质粒 pVAX-dSFV a -IRES-hIL-12 (简称pVAX-HBVE)，其核苷酸序列如序列表中序列1所示；
[0021] 2)双酶切重组质粒pVAX-HBVE，获得融合基因dSFV a -IRES_hIL12;
[0022] 3)单酶切可复制型载体pSVK，使其线性化得到pSVK载体片段；
[0023] 4)将dSFVa -IRES_hIL12融合基因与pSVK载体片段进行连接，得到可复制型重组 载体 pSVK-dSFV a -IRES-hIL-12 (简称 pSVK-HBVE)。
[0024] 步骤1)所述pVAX-HBVE核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0025] 可复制型载体pSVK核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0026] 步骤1)所述重组质粒pVAX-HBVE的构建过程为：
[0027] 1)、构建pEE14. 1-dSFV a载体：将人源化抗HBsAg dsFv抗体基因与人干扰素a 基因导入载体PEE14. 1，获得携带有人源化抗HBsAg dsFv抗体基因与人干扰素a基因的重 组载体，命名为pEE14.1_dSFVa ;
[0028]2)、获得融合基因dSFV a :双酶切PEE14. 1-dSFV a载体得到人源化抗HBsAg dsFv 抗体和人干扰素a融合基因，命名为dSFV a ;
[0029] 3)、构建pVAX-IRES-hIL-12载体：将人白介素12(IL-12)基因导入载 体pVAX-IRES，获得携带IRES序列与人白介素12(IL-12)基因的重组载体，命名为 pVAX-IRES-hIL-12 ；
[0030] 4)、获得 pVAX-IRES-hIL-12 载体片段：双酶切 pVAX-IRES-hIL-12 载体得到 pVAX-IRES-hIL-12载体的Nhe I和EcoR I双酶切片段；
[0031] 5)、dSFVa融合基因与pVAX-IRES-hIL-12载体片段的连接：将步骤2)获得的 dSFVa融合基因与步骤4)获得的pVAX-IRES-hIL-12载体片段进行连接得到连接物；
[0032] 6)、连接产物的转化：将连接产物向感受态大肠杆菌E.coli.trans5a中转 化，阳性克隆质粒即为携带dSFVa融合基因和人白介素-12基因的重组质粒，命名为 pVAX-dSFV a -IRES-hIL-12(简称pVAX-HBVE)。
[0033] 本发明还提供所述可复制型重组载体pSVK-HBVE在制备慢性乙型肝炎免疫基因 治疗药物中的应用。所述免疫基因治疗可为电穿孔肌肉内注射免疫，其过程为：肌内注射 药物进行免疫，免疫后均接受60V电压的电穿孔刺激，电穿孔其它条件：电容：8F，频率： 0. 75Hz，脉冲次数：6次，脉冲时间：50ms。
[0034] 本发明将抗体靶向干扰素a和人IL-12共同表达于可复制型载体pSVK 中，构建出人源化抗HBsAg dsFv抗体与人干扰素a和白介素-12的融合表达质粒 pSVK-dSFV a -IRES-hIL-12,并在真核细胞及体外均获得高效表达，人IL-12与人IFN- a的 联合应用将在肿瘤控制过程中起到重要的协同作用，本发明为慢性乙型肝炎的基因治疗提 供了一种安全高效的免疫基因治疗药物。
[0035] 本发明的实施例构建了可融合表达人干扰素a和人白细胞介素12的pVAX载体 免疫基因治疗质粒pVAX-HBVE和可复制型免疫基因治疗质粒pSVK-HBVE，并利用转基因小 鼠模型对可复制型免疫基因治疗质粒pSVK-HBVE进行了初步免疫功能验证，并对其免疫机 制进行深入探讨，为pSVK-HBVE免疫功能的全面验证奠定了基础，结果汇总如下：
[0036] 1.实施例1构建了可融合表达人干扰素a和人白细胞介素12的免疫基因治疗 质粒pVAX-HBVE，酶切和测序鉴定显示质粒成功构建，在相应细胞系中获得分泌表达，通过 ELISA检测质粒的表达效率，结果pVAX-HBVE可大量表达免疫有关的细胞因子人IFN- a和 hIL-12,参与调节机体对乙肝病毒的免疫应答。
[0037] 2.实施例2构建了可在体内高效复制的免疫基因治疗质粒pSVK-HBVE，酶切和测 序鉴定显示质粒成功构建，在相应细胞系中获得分泌表达，通过ELISA检测质粒的表达效 率，结果pSVK-HBVE可大量表达免疫有关的细胞因子人IFN- a和hIL-12,参与调节机体对 乙肝病毒的免疫应答。pSVK-HBVE是以实施例1构建的含有IRES序列可使其上游和下游基 因同时表达的pVAX-HBVE载体为基础，通过将目的基因HBVE导入到可进行自主复制的修饰 后的塞姆利基森林病毒（semLiki forest virus，SFV)载体pSVK所构建的。这种可复制型 载体具有RNA复制酶编码基因和启动子元件，可同时表达上游和下游的不同目的基因，并 且在细胞内进行自我复制，从而高效表达外源目的基因。因此，复制型质粒PSVK-HBVE可在 宿主细胞内高效表达天然形式的外源蛋白，并可能诱导机体产生强烈的细胞免疫反应和宿 主细胞的凋亡。此外，复制型质粒PSVK-HBVE在宿主细胞核外完成复制、转录、翻译等过程， 降低了将外源基因整合到宿主的基因组中的风险，具有较好的安全性。
[0038] 3.转基因小鼠模型动物实验显示：可复制型免疫基因治疗质粒pSVK-HBVE配合高 效的活体电穿孔递送技术使得较少的质粒用量即可发挥强有力的抗病毒效果，具体表现为 质粒免疫治疗的小鼠血