专利名称：抗癌药物增强剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及增强抗癌药物效果的增强剂，它是一种将增强剂与抗癌药物组合的药物组，等等。
背景技术：
癌症治疗主要可归类为以下几种治疗手术治疗、应用放射线等的放疗、和应用抗癌药物的化疗，通常综合应用两种或更多的治疗方法。
化疗主要通过给药抗癌药物进行。与涉及瘤形成、癌细胞增殖和肿瘤增生的多种药物和生理功能的研究进展相一致，应用多种功能的抗癌药物现已商业化。
通过拓扑异构酶抑制剂的例子举例说明这些药物。
拓扑异构酶是通过断裂和重接改变DNA构象的酶，并在多种生物种属中发现。已知两种类型的拓扑异构酶，即I型和II型。II型被分为α型和β型。该I型作用于DNA的单链，II型作用于DNA的双链。该拓扑异构酶是涉及DNA复制与转录的重要酶。如果该酶的活性的抑制能稳定在催化反应步骤中产生的DNA酶复合物，保持不变，会发生如DNA处于裂解状态的紊乱。因此，干扰细胞活性，使一些细胞死亡。拓扑异构酶抑制剂由于其抑制作用，被认为能产生抗癌药物的某些效果。
已知依托泊苷(VP-16)、喜树碱及其衍生物(例如CPT-11)等已作为具有拓扑异构酶抑制剂功能的抗癌药物。依托泊苷(VP-16)应用其拓扑异构酶II活性抑制剂的功能产生抗癌效果，现已作为睾丸肿瘤和小细胞肺癌的多种药物组合化疗的标准治疗药物。另外，其应用扩展到恶性淋巴瘤、急性白血病、非小细胞肺癌、膀胱癌、胃癌等。另一方面，CPT-11为喜树碱衍生物，应用其拓扑异构酶I活性抑制剂的功能产生抗癌效果。进行了单独应用CPT-11治疗多种癌症的II期临床实验，发现其对小细胞肺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、恶性淋巴瘤等有效。
另一方面，铂复合物如顺铂、烷化剂如丝裂霉素、博莱霉素类如博莱霉素被认为是直接对癌细胞的DNA作用，破坏DNA链以产生效果的抗癌药物。
应用抗癌药物的癌症治疗的一个主要问题是癌细胞获得抗癌药物的耐受，使抗癌药物的效果降低或消失。例如，癌细胞通过P-醣蛋白大量表达获得多种药物的耐受，是产生耐受的有代表性的例子。
对于应用上述拓扑异构酶活性抑制剂的抗癌药物，治疗根据癌症的种类，例如对多种实体癌产生抗肿瘤效果，但只有很少的几种癌症能达到治疗效果。即使对抗癌药物指示治疗的癌症，在治疗的最初阶段也通常是几乎没有效果。另外，尽管这些抗癌药物能用于相对宽的实体癌，但对未指示的多种癌没有治疗效果。换句话说，尽管这些抗癌药物对多种实体癌具有良好的抗肿瘤效果，但在许多病例情况下由于实体癌本身固有的药物耐受，不能获得足够的治疗效果。例如，已知有下列情况对小体积肿瘤的实体癌，该抗癌药物有效，但对于大肿瘤的实体癌，该抗癌药物的活性降低或作用消失。证明由于血管形成不足，实体癌内部产生的特定环境如葡萄糖饥饿(glucose starvation)和组织缺氧实体肿瘤对这些药物的耐受。
发明内容
本发明包括下列方面1.一种提高抗癌药物效果的抗癌药物增强剂，其特征在于其有效成分是抑制蛋白酶体活性的物质，它具有提高DNA链破坏(strand-damaging)型抗癌药物对癌细胞效果的功能。
2.按照上述方面1的抗癌药物增强剂，其特征在于上述DNA链破坏型抗癌药物是在蛋白酶体活性存在情况下其效果被抑制或减少的抗癌药物。
3.按照上述方面1的抗癌药物增强剂，其特征在于上述抗癌药物含有抑制拓扑异构酶活性的物质作为有效成分。
4.按照上述方面2的抗癌药物增强剂，其特征在于所述抗癌药物是抑制拓扑异构酶I活性的物质和拓扑异构酶II活性的物质中的至少一种。
5.按照上述方面1的抗癌药物增强剂，其特征在于上述DNA链破坏型抗癌药物是通过直接作用于DNA链而破坏DNA的抗癌药物。
6.按照上述方面1-5中任何一个的抗癌药物增强剂，其特征在于上述抑制蛋白酶体活性的物质为选择性蛋白酶体活性抑制剂。
7.按照上述方面1-5中任何一个的抗癌药物增强剂，其特征在于上述抑制蛋白酶体活性的物质为非肽醛(non-peptide aldehyde)蛋白酶体活性抑制剂。
8.按照上述方面1-7中任何一个的抗癌药物增强剂，其特征在于上述癌症为实体癌。
9.按照上述方面1-7中任何一个的抗癌药物增强剂，其特征在于上述癌症处于生理胁迫(physiological stress)状态。
10.按照上述方面9的抗癌药物增强剂，其特征在于上述生理胁迫状态为葡萄糖饥饿胁迫状态和组织缺氧胁迫状态。
11.一种抗癌药物和提高抗癌药物效果的增强剂的药物组，其特征在于上述增强剂为抑制蛋白酶体活性的物质，它通过抑制癌细胞中蛋白酶体的活性而具有提高上述抗癌药物效果的功能，并且上述抗癌药物为当蛋白酶体活性存在时其效果可以被抑制或减少的抗癌药物。
12.按照上述方面11的药物组，其特征在于上述抗癌药物含有抑制拓扑异构酶活性的物质作为有效成分。
13.按照上述方面12的药物组，其特征在于所述抗癌药物是抑制拓扑异构酶I活性的物质和拓扑异构酶II活性的物质中的至少一种。
14.按照上述方面11的药物组，其特征在于上述抑制拓扑异构酶活性的物质为lactacystin。
15.按照上述方面11-14中任何一个的药物组，为包括含有上述抗癌药物的制剂和含有其它上述抑制蛋白酶体活性的物质的制剂的两种制剂的药物组。
16.按照上述方面11-14中任何一个的药物组，为在同一制剂中含有上述抗癌药物和上述抑制蛋白酶体活性的物质的混合物形式。
17.按照上述方面11-16中任何一个的药物组，其特征在于上述癌症为实体癌。
18.按照上述方面11-16中任何一个的药物组，其特征在于上述癌症处于生理胁迫状态。
19.按照上述方面18的药物组，其特征在于上述生理胁迫状态为葡萄糖饥饿胁迫状态和组织缺氧胁迫状态。
20.一种通过直接作用于DNA而破坏DNA的抗癌药物和抑制蛋白酶体活性的药物的药物组。
21.按照上述方面20的药物组，其特征在于通过直接作用于DNA而破坏DNA的抗癌药物为铂复合物、烷化剂和博莱霉素类药物。
22.按照上述方面20的药物组，其特征在于抑制蛋白酶体活性的物质为选择性蛋白酶体活性抑制剂。
23.按照上述方面22的药物组，其特征在于所述选择性蛋白酶体活性抑制剂为lactacystin。
24.一种癌症治疗方法，其特征在于给药一种DNA链破坏型抗癌药物和一种抑制蛋白酶体活性的物质，这种抑制蛋白酶体活性的物质具有提高DNA链破坏性抗癌药物针对癌细胞的效应的功能。
25.抑制蛋白酶体活性和具有提高DNA链破坏型抗癌药物对癌细胞效果的功能的物质在制备提高抗癌药物效果的药物中的应用。
本发明的产生是通过考虑上述拓扑异构酶抑制剂作为抗癌药物的指示范围和对癌细胞特别是实体癌产生耐受性的问题而完成的。本发明的目的是通过增加拓扑异构酶抑制剂作为抗癌药物的指示范围并提高其效果而提供一种更有效预防和治疗癌症的技术，本发明的目的是提供一种抑制产生癌细胞耐受的技术，特别是对实体癌产生耐受，以产生拓扑异构酶抑制剂等更有效作为抗癌药物的效果。
按照本发明上述各个方面可以达到这些目的。
在按照本发明提高抗癌药物效果的药物与含有拓扑异构酶活性抑制剂作为有效成分的抗癌药物组合应用的情况下，是通过其对癌细胞的活性，例如在生理胁迫状态下，拓扑异构酶活性已被增加，足够大量的拓扑异构酶本身被癌细胞所保持，以抑制DNA由此断裂后的重接，导致对癌细胞不适当的DNA的断裂，降低细胞活性，杀死细胞，因此，通过应用有效的抗癌药物的治疗成为可能。
在按照本发明提高抗癌药物效果的药物与通过直接作用于DNA而破坏DNA链的抗癌药物组合应用的情况下，能表现出本发明的效果。目前，还未知通过直接作用于DNA而破坏DNA链的抗癌药物与蛋白酶体的相互作用，蛋白酶体抑制剂具有提高抗癌药物活性的作用，是意想不到的结果。
图1图示了在实施例1中所观察到的在葡萄糖饥饿条件下依托泊苷对癌细胞的敏感性以及PSI对其的影响；图2图示了在实施例1中所观察到的在葡萄糖饥饿条件下每种抑制剂对依托泊苷敏感性的影响；图3图示了在实施例1中所观察到的在癌细胞葡萄糖饥饿条件下lactacystin对依托泊苷敏感性的影响；图4图示了在实施例1中所观察到的在癌细胞葡萄糖饥饿条件下lactacystin对阿霉素敏感性的影响；图5图示了在实施例2中所观察到的确定拓扑异构酶IIα表达的western印迹的结果，(a)图示了在葡萄糖饥饿条件下PSI、MG132和MG115的影响，(b)图示了在葡萄糖饥饿条件下E64和ZLLal的影响，(c)图示了在葡萄糖饥饿条件下lactacystin的影响，(d)图示了在组织缺氧条件下PSI、MG132和MG115的影响，(e)图示了在组织缺氧条件下E64和ZLLal的影响；图6为替代描绘细胞的显微照片，图示了在实施例3中细胞染色的结果；图7图示了在实施例3中western印迹的结果，(a)和(b)分别图示了在葡萄糖饥饿条件下从细胞核和整个细胞中提取的溶液中P27和P32的结果，(c)和(d)分别图示了在组织缺氧条件下从细胞核和整个细胞中提取的溶液中P27和P32的结果；
图8图示了在实施例4中所观察到的在对照和葡萄糖饥饿条件下从细胞核提取的溶液中蛋白酶体活性的测定结果，(a)图示了当使用Z-LLL-MCA作为底物的结果，(b)图示了当使用Suc-LLVY-MCA作为底物的结果；图9图示了在实施例4中所观察到的在对照和组织缺氧条件下从细胞核提取的溶液中蛋白酶体活性的测定结果，(a)图示了当使用Z-LLL-MCA作为底物的结果，(b)图示了当使用Suc-LLVY-MCA作为底物的结果；图10图示了在实施例4中所观察到的每种抑制剂对抗从细胞核提取的溶液中蛋白酶体活性的作用；(a)图示了在对照和葡萄糖饥饿条件下从细胞核提取的溶液的结果，(b)图示了在对照和组织缺氧条件下从细胞核提取的溶液的结果；图11图示了在实施例5中所观察到的在小鼠移植癌细胞系组合应用lactacystin和依托泊苷作为抗癌药物的治疗结果；图12图示了在实施例6中所观察到的在小鼠移植癌细胞系组合应用lactacystin和依托泊苷作为抗癌药物的治疗结果；图13图示了在实施例7中所观察到的在小鼠移植癌细胞系组合应用lactacystin和阿霉素作为抗癌药物的治疗结果；图14图示了在实施例8中所观察到的组合应用lactacystin和靶向拓扑异构酶I的喜树碱杀细胞效应的变化；图15图示了在实施例8中所观察到的组合应用PSI和靶向拓扑异构酶I的喜树碱杀细胞效应的变化；图16图示了在实施例8中所观察到的组合应用MG132和靶向拓扑异构酶I的喜树碱杀细胞效应的变化；图17图示了在实施例8中western印迹的结果，(a)图示了在葡萄糖饥饿条件下拓扑异构酶I的表达，和clasto-lactacystin β内酯对其的影响，(b)图示了拓扑异构酶IIα的结果；图18图示了在实施例9中所观察到的组合应用lactacystin和顺铂杀细胞效应的变化；图19上部(a)图示了在实施例10中所观察到的组合应用脱羧基lactacystin和依托泊苷，一种靶向拓扑异构酶II的抗癌药物，的杀细胞效应的变化，下部(b)图示了在实施例10中western印迹的结果，还图示了在葡萄糖饥饿条件下拓扑异构酶IIα的表达，和脱羧基lactacystin对其的影响；图20图示了在实施例11中所观察到的组合应用脱羧基lactacystin和SN38，一种靶向拓扑异构酶I的抗癌药物，的杀细胞效应的变化；图21图示了在实施例12中所观察到的在培养细胞系中丝裂霉素C和博莱霉素与lactacystin组合应用杀细胞效应的变化；进行发明的最佳实施方式在有效成分为拓扑异构酶抑制剂的抗癌药物对抗癌细胞的效果与蛋白酶体活性抑制的相关性研究中，根据组合应用抑制蛋白酶体活性的物质和DNA链破坏型抗癌药物能提高抗癌药物活性的新发现，完成了本发明。
蛋白酶体是从细胞质部分发现的多功能高分子量蛋白质复合物，它具有蛋白质降解活性，其在细胞中的作用尚不十分清楚。进行了许多研究以揭示其的作用。作为蛋白酶体的功能，一种假设提出其涉及细胞的多种功能和作用，如细胞周期、凋亡、信号转导、代谢、免疫反应等。但是，该蛋白酶体不是简单的蛋白酶，而是具有多功能性，因此，当蛋白酶体活性特别是癌细胞活性受到抑制的情况下，结果细胞功能发生改变，在癌细胞中会出现什么现象，对抗癌药物的敏感性会发生什么改变，根据到目前为止进行的研究尚不能确定，因此，通过本发明中抗癌药物效果增强剂抑制蛋白酶体活性而产生抗癌药物效果的提高，从常规技术中还不能推导出来。
与本发明抗癌药物效果增强剂组合应用的抗癌药物的具体例子没有具体限定。
优选直接或间接破坏DNA链的DNA链破坏型抗癌药物。直接破坏DNA链的DNA链破坏型抗癌药物是被理解为通过直接作用于癌细胞DNA链而抑制DNA合成和随后的癌细胞分裂的抗癌药物，它们的例子有铂复合物、烷化剂、和博莱霉素类。铂复合物的例子有顺铂和卡铂。烷化剂的例子有丝裂霉素、环磷酰胺、异环磷酰胺、白消安、噻替派、美法仑等。博莱霉素类的例子有博莱霉素、培来霉素等。
间接破坏DNA链的DNA链破坏型抗癌药物不直接作用于DNA，但是抗癌药物通过涉及DNA的断裂和重接的酶具有间接破坏DNA链的活性。该抗癌药物的例子有拓扑异构酶抑制剂。该拓扑异构酶抑制剂具有涉及DNA的断裂和重接的拓扑异构酶活性抑制的作用，由此抑制DNA的断裂和重接，以引起细胞活性的紊乱，导致细胞死亡。
应用拓扑异构酶抑制剂的情况下被用作靶标的拓扑异构酶的例子有拓扑异构酶I和拓扑异构酶II(IIα和IIβ)。
拓扑异构酶I抑制剂的例子有喜树碱及其衍生物(例如Irinotecan(CPT-11)、托泊替堪、9-硝基喜树碱、9-氨基喜树碱、10，11-亚甲基二氧喜树碱、DX-8951F、GG-211等)等等。拓扑异构酶II抑制剂的例子有依托泊苷、阿霉素、鬼臼噻吩苷、柔红霉素、放射菌素D、米托蒽醌、m-AMSA、2-甲基-9-羟基-醋酸羟哔咔唑等。另外，通过下式结构表达的TAS-103可以作为同时抑制拓扑异构酶I和II的例子。 按照本发明的提高抗癌药物效果的药物可以优选用于其抗癌药物活性在蛋白酶体存在下受到抑制或被降低的抗癌药物，作为其中涉及蛋白酶体的抗性获得的靶标。并且，通过抑制蛋白酶体的活性，很有可能扩展其效果尚未得到证实的抗癌药物对新的癌种类的应用范围。
在拓扑异构酶抑制剂用作抗癌药物的情况下，该效果被认为是通过抑制蛋白酶体活性和提供拓扑异构酶抑制剂环境而产生抑制效果，即抗癌药物靶向的拓扑异构酶可以有效地作用于癌细胞。
作为按照本发明的提高抗癌药物效果的药物，优选对癌细胞特别是在生理胁迫条件下的癌细胞有效的那些，其中在细胞核内蛋白酶体的活性已提高到正常值的2或3倍。具体地，更优选在胁迫条件下实体癌的(实体肿瘤)的与血管有一定距离的内部癌细胞有效的那些。
按照本发明的提高抗癌药物效果的药物含有蛋白酶体抑制剂作为抑制蛋白酶体活性的有效成分。在胁迫条件下根据癌细胞核中蛋白酶体的累积量，该抑制蛋白酶体活性的物质可以是这样的物质它不被癌细胞清除，有可能到达细胞核的内部，有效抑制细胞核中蛋白酶体活性，并且是药理学可允许的。该物质例如可以是PSI(苄氧羰基-L-异亮氨酰基-γ-叔丁基-L-谷氨酰基-L-丙氨酰基-L-Leucinal(Peptide Institute，Inc.)、MG115(苄氧羰基-L-亮氨酰基-L-亮氨酰基-LeucinalPeptide Institute，Inc.)、lactacystin(The Kitasato Institute)。应用上述这些的一个或多个，可以制备出提高抗癌药物效果的药物。在它们当中，lactacystin为特异性抑制蛋白酶体活性的非肽型化合物，因此更加优选。
上述PSI、MG115和MG132对其它酶如钙蛋白酶也显示出活性，表现出作为蛋白酶体抑制剂的低选择性。另一方面，例如lactacystin对钙蛋白酶不显示出抑制活性，可以被认为是选择性蛋白酶体活性抑制剂。按照本发明考虑到动物的副作用和效果，更加优选选择性蛋白酶体活性抑制剂。与上述三种是肽并且具有醛基的化合物(PSI、MG115和MG132)相反，lactacystin不具有醛基，可以被称为非肽醛型蛋白酶体活性抑制剂。
作为参考，lactacystin已在日本专利公开号3-98594和8-231501中描述，还可以参见J.Antibiotics 19(44)113-116，1991。
此外，对于这些蛋白酶体抑制剂的衍生物，在通过蛋白酶体抑制效果保持作为提高抗癌药物效果的药物的功能的范围内，分子结构改变的衍生物如用取代基修饰可以优选用于本发明。例如，lactacystin的衍生物可以是去-N-乙酰氨基lactacystin(参照日本专利公开号8-321501)，其中下列结构式(1)中的R为-SCH2CH2COOH，和脱羧基lactacystin(参照J.Antibiotics48(4)747-748，1995)，其中R为-SCH2CH2NHCOCH3。 和下式结构的clasto-lactacystin β内酯等。 上述结构式(1)表示的两种衍生物已在上述的日本专利公开No.8-321501中公开。
当需要时，用于增强本发明抗癌药物的制剂，可以作为药物来制备，即当需要时，通过将具有上述特征的蛋白酶体活性抑制剂，与适合药用的载体和稀释剂共混来制备。
制剂的形式可以是固体形式，例如片剂，药丸，粉末，颗粒，胶囊，栓剂等；液体形式，例如注射液，悬浮液，糖浆，乳液等；半固体形式，例如膏药，以及按照这些剂量形式通过正确地选择载体，稀释剂，赋形剂和各种添加剂可以制得的药物制剂。在药物中的蛋白酶体活性抑制剂的量可以基于抗癌药物的剂量来正确选择，所述抗癌药物的剂量是按照依被治疗的病人的症状而定的治疗方案而定的。例如，一剂可以是约20～100g；然而，其不仅限于此。
可以基于按照治疗方案的抗癌药物的给药量来选择这种增强剂对患者的剂量。例如，每天约100～500mg是合理的；然而，其不仅限于此。另外，设定定时给药，使抗癌药物在癌细胞中的有效浓度控制在能有效地抑制蛋白酶体活性的水平。例如，当使用拓扑异构酶作为抗癌药物时，在拓扑异构酶被蛋白酶体降解被抑制的情况下，最好进行设定，以使抗癌药物在癌细胞中产生有效浓度。采用的给药形式可以是例如，一种典型的给药方法，其中在按照本发明间歇性服用抗癌药物时，用于增强抗癌药物效果的制剂在服用抗癌药物前合适的时间间隔内服用；一种给药方法，其中抗癌药物与增强抗癌药物效果的制剂同时服用，并且选择这些药剂的形式，以使病人在吸收药物的时间方面产生差别；或同时服用这些药剂，以使药物在病人体内的浓度保持在预定的浓度水平，等。
另一方面，作为抗癌药物，那些其作为抗癌药物的作用在蛋白酶体活性存在下受到影响，即受到抑制或降低的抗癌药物，可以与本发明的用于增强抗癌药物效果的制剂结合使用。
作为抗癌药物，至少使用一种在与本发明的用于增强抗癌药物效果的制剂结合使用时表现出效果的品种，并且当需要时，可以结合使用其它在结合使用时有效的抗癌药物。除这种形式外，所述抗癌药物可以是其效果可以用增强本发明的抗癌药物效果的制剂提高的抗癌药物，也可以是其效果未得到提高的抗癌药物。
在使用拓扑异构酶抑制剂的情况下，所述抗癌药物可以使用一个或多个品种作为有效组分来制备。在这种情况下，所述用于增强本发明的抗癌药物效果的制剂，可以提高作为抗癌药物的拓扑异构酶I抑制剂的效果和作为抗癌药物的拓扑异构酶II抑制剂的效果中至少之一；能够提高这两种抗癌药物的效果的制剂是优选的。
所述抗癌药物包括衍生物，该衍生物的分子结构由于通过取代基来进行改性而发生变化，但是该变化仍保持其作为抗癌药物的效果，并且保持在与蛋白酶体活性抑制剂结合使用时抗癌药物的效果得到提高的效果。
所述抗癌药物的形式，可以是能够应用上述用于提高抗癌药物效果的制剂，和市场销售的抗癌药物，及使用这些有效组分以药物形式制备的材料的任何形式。因此，结合进药物制剂中的有效组分的量可以如常规方式进行设定。与本发明的用于提高抗癌效果的制剂结合使用时，其效果得到提高，因此，在药物制剂中结合的量可以比不结合使用时更低。
另外，可以按照1所设定的方式，向治疗点提供所述抗癌药物和所述用于提高抗癌药物效果的制剂。在这种情况下，这些药物制剂可以分别作为单独的药物制剂来使用，并且也可以作为在同一药物制剂中含有这两种组分的混合物来使用。
例如，为了同时服用抗癌药物和所述用于提高抗癌药物效果的制剂，可以采用如下方法同时服用在不同药物制剂中的这些药物，和服用在一种药物制剂中含有的这些药物的混合物，并且这些有效组分是患者可以吸收的。或者，按照众所周知的技术，改变抗癌药物和用于提高抗癌药物效果的制剂的各自保护物，以使抗癌药物在包括例如胃，肠和结肠的消化系统内的分解时间，与提高抗癌药物效果的制剂的分解时间产生差异，从而造成吸收时间的不同。仅作为参考，给药方法不局限于此，并且可以改变以实现本发明的效果。
本发明的用于提高抗癌药物效果的制剂对于癌症是有效的，该癌症是可以使用这样的抗癌药物的癌症，所述抗癌药物的效果在蛋白酶体活性存在下会受到影响，即受到抑制或降低。另外，在当与本发明的用于提高抗癌药物效果的制剂结合使用时，抗癌药物的效果未得到证实的癌症中，如果该癌症表现出对蛋白酶体活性有抵抗作用，该癌症也是本发明的治疗目标。
在结合使用的抗癌药物的有效组分为拓扑异构酶活性抑制剂的情况下，例如，在治疗睾丸肿瘤，小细胞肺癌，恶性淋巴瘤，急性白血病，非小细胞肺癌，膀胱癌，胃癌，结肠癌，卵巢癌，颈癌等时，与抗癌药物结合使用是有效的。另一方面，它对于结合使用拓扑异构酶活性抑制剂和其它抗癌药物的癌症是有效的。另外，在有效组分为拓扑异构酶活性抑制剂的抗癌药物的效果较低的或未观察到的癌症中，在蛋白酶体活性抑制了抗癌药物的效果的情况下，本发明的用于提高抗癌药物的效果的制剂是有效的。换句话说，当其有效组分为拓扑异构酶活性抑制剂等的抗癌药物表现出其效果时，一种目标酶(或构成一种酶体系的酶)被蛋白酶体降解，从而失去抗癌药物等的效果，在这种或类似情况下，本发明的用于提高抗癌药物的效果的制剂是有效的。
另外，在生理胁迫，例如在葡萄糖饥饿和缺氧条件下的胁迫作用下的癌细胞，其核内蛋白酶体活性比通常条件下要高2～3倍，并且对拓扑异构酶等的降解作用增加，因此，本发明的用于提高抗癌药物的效果的制剂优选应用于这类癌症中。另一方面，对于实体肿瘤的瘤内部的细胞，例如，与肿瘤块内部的血管有一定距离的细胞，其距离随癌细胞的增殖而扩大，细胞增殖和维持所必须的营养物和氧组分将不能充分提供，将表现出这些组分的饥饿条件。相应地，对于在这种饥饿条件下的实体肿瘤，用于提高本发明抗癌药物的效果的制剂是非常有效的。对于其它癌症，当人为地在病人出现机能障碍的部位引发出现饥饿条件时，该制剂对这些癌症也是有效的。
另外，当下列物质与抗癌药物结合使用时，例如，有望对癌症有效的铂复合物，例如顺氯氨铂；烷基化试剂，例如丝裂霉素；博莱霉素，例如博莱霉素等，依据所使用的抗癌药物的种类，可对睾丸肿瘤，膀胱癌，肾-输尿管的骨盆肿瘤，前列腺癌，卵巢癌，头颈癌，非小细胞癌，食道癌，颈癌，成神经细胞肿瘤，胃癌，淋巴细胞性白血病，锦葵紧张白血病，结肠直肠癌，肺癌，脾癌，肝癌，子宫体癌，乳癌，皮肤癌，恶性淋巴瘤，神经胶质瘤，甲状腺肿等的癌细胞的DNA直接作用，通过破坏DNA链来表达其效果。
至于培养介质，在正常状态下的培养条件中，使用加入5％FBS(胎牛血清)的RPMI 1640介质(Nissui Pharmaceutical Co.制备)，并在实体肿瘤中发现的葡萄糖饥饿状态下的培养条件中，使用缺少葡萄糖的加入5％FBS的RPMI 1640介质(Lifetech Oriental制备)。在5％CO2/95％空气和湿度为100％的条件下，使用CO2箱(Tabai Espec制造)进行培养。
为测试对抗癌药物的灵敏度，使用细胞循环同步培养的方法。使用Nocodazol(Sigma制备)去使细胞循环同步，用40ng/ml Nocodazol对处于对数增殖期的细胞处理9h，通过轻柔的移液操作来收集聚集在细胞分裂相(M相)中的细胞。用PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤通过这些步骤收集到的M相-同步的细胞，然后向12孔培养板的每个孔中接种1×105个细胞。
在正常条件下以及葡萄糖饥饿条件下培养的M相-同步的细胞，先后用蛋白酶体抑制剂和抗癌药物进行处理。对于在葡萄糖饥饿条件下的细胞，使用其中加入作为控制基团的蛋白酶体抑制剂和不抑制蛋白酶体的蛋白酶抑制剂的培养介质，以及其中不加入抑制剂的培养介质。对于在正常条件下的细胞，使用其中不加入任何抑制剂的培养介质。细胞接种完成后，在每种培养介质中进行培养13h。随后，向每种培养介质中加入吡喃葡糖苷(Bristol Myerss Squibb K.K.制备)和阿霉素(KyowaHakko制备)，它们是抗癌药物靶拓扑异构酶II，并将细胞再培养1h。
采用集落形成方法测定细胞对抗癌药物的灵敏度。如上所述，用PBS洗涤用蛋白酶体抑制剂和抗癌药物处理过的细胞，随后在胰岛素(LifetechOriental制备)溶液中浸泡，从培养皿中取出并悬浮在普通的培养介质中。这些细胞再次被接种，对于10cm的培养皿，接种的细胞数为500～5000，并培养10～12天以形成集落。该形成的集落用10％甲醛溶液固定，并用0.01％的龙胆紫(Wako Pure Chemicals制备)溶液染色。统计集落数，并假定未用抗癌药物处理的集落数目为1，计算细胞的存活率。
作为参考，下面是如上所述的所用的蛋白酶体抑制剂和不抑制蛋白酶体的蛋白酶抑制剂。(1)蛋白酶体抑制剂·PSI(苄氧羰基-L-异亮氨酰基-γ-叔丁基-L-谷氨酰基-L-丙氨酰基-L-亮氨醛)最终浓度为2.5μM(Peptide Institute Inc.制备)·MG115(苄氧羰基-L-亮氨酰基-L-亮氨酰基-L-正缬氨醛)最终浓度为2.5μM(Peptide Institute Inc.制备)·MG132(苄氧羰基-L-亮氨酰基-L-亮氨酰基-亮氨醛)最终浓度为2.5μM(PeptideInstitute Inc.制备)·乳胱氨酸(1actacystin)，最终浓度为10μM(The Kitasato Institute制造并友好供给)(2)不抑制蛋白酶体的蛋白酶抑制剂·E64，最终浓度为25μM(Peptide Institute Inc.制备)·ZLLal(苄氧羰基-L-亮氨酰基-L-亮氨醛)最终浓度为25μM(PeptideInstitute Inc.制备)得到的结果示于图1-4。从图1可以看出，在正常的培养条件下，当拓扑异构酶II抑制的抗癌药物一吡喃葡糖苷的浓度为5，10及15μg/ml时，几乎所有的HT29细胞都死亡，并且不能形成集落。而在实体肿瘤中发现的葡萄糖饥饿的条件下，细胞显示出可抵抗吡喃葡糖苷而存活。同时还可看出，如果在培养介质中存在蛋白酶体抑制剂PSI，即使在葡萄糖饥饿的条件下，细胞也显示对吡喃葡糖苷敏感。对于图2，类似地，可以看出，蛋白酶体抑制剂MG132和MG115可提高细胞对吡喃葡糖苷(10μg/ml)的灵敏度，而不抑制蛋白酶体的蛋白酶抑制剂E64和ZLLal，即使使用10倍的蛋白酶体抑制剂浓度，也极少改变对吡喃葡糖苷的灵敏度。对于图3，可以看出，蛋白酶体抑制剂乳胱氨酸，具有不同于上述能提高对吡喃葡糖苷灵敏度的抑制剂的作用机理。作为参考，蛋白酶体抑制剂的作用机理的不同在于，PSI，MG132和MG115对蛋白酶体的抑制是可逆的，而乳胱氨酸的抑制是不可逆的，它是通过与蛋白酶体的活性中心形成共价键来进行抑制的。换句话说，不管抑制方法的区别，可以看出蛋白酶体抑制剂可提高吡喃葡糖苷的灵敏度，所述吡喃葡糖苷是在葡萄糖饥饿条件下的癌细胞的拓扑异构酶II抑制的抗癌药物。另外，从图4可以看出，通过蛋白酶体抑制剂，不只对吡喃葡糖苷，对通过抑制拓扑异构酶II来表示抗癌作用的阿霉素的灵敏度都被提高了。
拓扑异构酶II抑制的抗癌药物可稳定一种复合物(可解离的复合物)，该复合物由DNA和拓扑异构酶IIα构成，其中的拓扑异构酶IIα是在用于引起DNA损伤的拓扑异构酶IIα的催化反应过程中产生的。因此，拓扑异构酶II抑制的抗癌药物杀死细胞的效果，取决于基本上用于形成可解离的复合物的拓扑异构酶IIα在细胞内表达量。因而，在实体肿瘤中发现的葡萄糖饥饿及低氧环境下，检测在培养的癌细胞中的拓扑异构酶IIα的表达量，以及蛋白酶体抑制剂对表达量的效果。
细胞的培养条件与实施例1中所述的条件相同，包括M相同步培养方法，并在葡萄糖饥饿的条件下进行培养。在实体肿瘤中发现的低氧条件下的培养类似于葡萄糖饥饿的条件，是在Gaspack 100缺氧体系(Becton Dickinson制造)中，于正常的条件下使用培养介质(通过向RPMI 1640培养介质中加入5％FBS而制备的)进行培养的。在葡萄糖饥饿的条件及低氧条件下进行培养14h。另一方面，向培养介质中加入蛋白酶体抑制剂和不抑制蛋白酶体的蛋白酶抑制剂，使最后的浓度分别为PSI5μM，MG1155μM，MG1325μM，乳胱氨酸10μM，E6450μM，和ZLLaI50μM.
为了制备一个完整细胞萃取溶液，将在上述条件下的细胞培养物用冰冷的PBS洗涤两次，然后通过使用细胞刮刀(Sumitomo Bakelite制造)从培养皿中取出细胞并收集。通过离心使收集到的细胞沉淀，然后将其溶解在SDS样品缓冲液中，从所有细胞中收集作为萃取溶液形式。作为参考，SDS样品缓冲液的组合物为10％v/v甘油，5％2-巯基乙醇，2％SDS(十二烷基磺酸钠)，和62.5mM三-盐酸(pH 6.8)。
采用蛋白质印迹法来测定在所有细胞的萃取溶液中的拓扑异构酶IIα的数量。将含有蛋白质总量为30μg的所有细胞的萃取溶液加到SDS聚丙烯酰胺凝胶(4-20 MultigelDaiichi Pure Chemicals K.K.制备)中，并在电泳缓冲液(25mM tris，192mM甘氨酸，和0.1％SDS)中，在40mA恒定的电流下进行电泳1h。随后，在4℃的印迹缓冲液(25mM tris，192mM甘氨酸，和20％甲醇)中，在50 V恒定电压下进行印迹12h，以将在SDS聚丙烯酰胺凝胶中分离出来的蛋白质转移到硝化纤维素膜上。该硝化纤维素膜在封闭缓冲液(0.1％Tween 20，4％脱脂乳加入的PBS)中浸泡1h以进行封闭。被封闭的硝化纤维素膜在溶液中浸泡1h，所述溶液是通过向封闭缓冲液中加入作为第一抗体的最终浓度为1μg/ml的抗拓扑异构酶IIα抗体(Cambridge Research Biochemicals Corp.制备)来制备的。该硝化纤维素膜用封闭缓冲液洗涤3次(5分钟一次)，然后在溶液中浸泡1h，所述溶液中1/1000(体积)的用辣根过氧化物酶标记的抗小鼠抗体作为第二抗体加入到封闭缓冲液中。该硝化纤维素膜用封闭缓冲液洗涤3次(5分钟一次)，然后用其中加了0.1％Tween 20的PBS洗涤3次(5分钟一次)。完成抗体反应并经洗涤后的硝化纤维素膜，按照操作手册用ECL试剂(Amersham Pharmacia Biotech制备)处理，并在X-OMATTMAR薄膜(Kodak制备)上检测拓扑异构酶IIα特定的信号。
得到的结果示于图5。如图5(a)-(c)的对照组所示，可以看出，与正常培养条件下的细胞相比，在葡萄糖饥饿条件下的细胞中的拓扑异构酶IIα的表达量急剧下降。如实施例1所示，这与在葡萄糖饥饿条件下存在较强的抵抗抗癌药物靶拓扑异构酶II的细胞相符合。另一方面，从图5可以看出，在蛋白酶体抑制剂PSI，MG132和MG115存在下，即使在葡萄糖饥饿条件下的细胞中，拓扑异构酶IIα的表达量也不降低。即使在最终浓度为2.5μM条件下，也不存在PSI，MG132和MG115抑制的拓扑异构酶IIα表达的类似降低的数据。另一方面，从图5还可以看出，蛋白酶体抑制剂乳胱氨酸，在葡萄糖饥饿条件下，可类似地抑制拓扑异构酶IIα表达的降低。然而，如图5(b)所示，在不抑制蛋白酶体的蛋白酶抑制剂(E64和ZLLal)情况下，拓扑异构酶IIα的表达量急剧降低。相对于被实施例1的蛋白酶体抑制剂提高的吡喃葡糖苷的效果，这些结果是很高的。另外，从图5(a)和(e)可以看出，在实体肿瘤中发现的缺氧条件下，并同时在葡萄糖饥饿条件下，蛋白酶体抑制剂优选抑制缺氧诱发的拓扑异构酶IIα的表达的降低，而不抑制蛋白酶体的蛋白酶抑制剂不存在这样的效果。上述结论表明，在实体肿瘤中发现的葡萄糖饥饿和缺氧环境下，拓扑异构酶IIα的表达量明显降低显示出对抗癌药物有抵抗性，该表达的降低是通过拓扑异构酶IIα的降解的提高以及在拓扑异构酶IIα的降解中所涉及的蛋白酶体引起的。实施例3(测定蛋白酶体在培养的细胞系中的表达)拓扑异构酶IIα是位于细胞核中的蛋白质。实施例2显示，在实体肿瘤中发现的胁迫环境下，拓扑异构酶被降解，并在该降解中涉及蛋白酶体。那么，不管蛋白酶体实际上是否存在于HT29细胞核内，并不管蛋白酶体在细胞核内的数量在胁迫环境下是否会改变，采用免疫染色法和蛋白质印迹法进行测试。
为培养HT29细胞，使用加入了5％FBS培养介质的缺少葡萄糖的普通RPMI 1640培养介质，而对照组是在葡萄糖饥饿条件下进行培养的，所用的是加入了5％FBS培养介质的普通RPMI 1640培养介质。为了在缺氧条件下进行培养，使用加入了5％FBS培养介质的RPMI 1640培养介质。将4×105个HT29细胞接种在10cm的培养皿中，并在普通的培养介质(加入了5％FBS培养介质的RPMI 1640培养介质)中培养2天，用PBS洗涤，然后用作为对照组的普通培养介质或缺少葡萄糖的培养介质替换。缺氧条件下的培养皿用普通的培养介质替换，然后移入实施例2描述的Gaspack 100缺氧体系中。随后，在普通条件，葡萄糖饥饿条件或缺氧条件下培养18h。
为了免疫染色，在上述条件下培养的HT29细胞，通过在其中加入了3.7％甲醛和0.2％triton X100的PBS中浸泡10分钟来固定。用PBS洗涤3次，然后在其中加了1％牛血清清蛋白的PBS中进行封闭。该细胞与抵抗蛋白酶体亚基P27的抗体(Progen Biotechnic制备)反应45分钟。用PBS洗涤后，它与结合在Oregon Green 488上的第二抗体(抗小鼠抗体；Molecular Probe Co.制备)反应30分钟。另外，用PBS洗涤后，将细胞浸泡在50μg/ml的碘化丙锭溶液(PISigma-Aldrich制备)中，以使细胞核内的DNA染色。用PBS洗涤后，通过使用共焦的激光显微镜(Leika制备)进行显微照相来观察被染色的细胞。上述反应都是在室温下进行的。
为制备在蛋白质印迹法中使用的细胞核萃取溶液，如实施例2所述用细胞刮刀刮掉在上述条件下培养的HT29细胞进行收集。该细胞用细胞核缓冲液(150mM氯化钠，1mM磷酸二氢钾，5mM氯化镁，1mMEGTA(乙二醇二(β-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸)，1mM二硫苏糖醇，1mM苯甲基磺酰氟，20μg/ml Aprotinin，和10％v/v甘油；pH6.4)洗涤1次，然后再次悬浮在其中加了0.3％triton X-100的细胞核缓冲液中，并置于冰上冷却10分钟。在4℃，450xg下离心10分钟收集细胞核。分离得到的细胞核用缺少Triton X-100的细胞核缓冲液洗涤1次后，再次悬浮在细胞核萃取缓冲液[20mM HEPES-氢氧化钾(pH7.5)，0.1％CHAPS，2mM EDTA，5mM二硫苏糖醇，400mM氯化钾，10μg/ml亮抑蛋白酶肽，20μg/ml胃酶抑制剂，10μg/ml Aprotinin，和1mM苯甲脒]中，并在4℃轻轻地旋转1h。在4℃，15000xg下离心10分钟以除去不溶的物质。上层清夜在4℃透过试验缓冲液[20mM HEPES-氢氧化钾(pH7.5)，5mM二硫苏糖醇，和10％v/v甘油]渗析2h。收集在4℃，15000xg下通过离心10分钟除去不溶物的作为细胞核萃取部分的上层清夜。将1/3体积的4x样品缓冲液加入到细胞核萃取部分中，在100℃处理5分钟。另一方面，通过实施例2所述的方法收集完整细胞的萃取溶液。如实施例2所述，使用细胞核萃取部分和完整细胞的萃取溶液来进行蛋白质印迹。仅作为参考，如用于电泳的SDS聚丙烯酰胺凝胶，使用的是10-20Multigel(Daiichi Pure Chemicals)，而第一抗体，所用的是抵抗蛋白酶体亚基P27和P32的抗体(Progen Biotechnic Corp.制备)。
所得结果示于图6和7中。从图6可以看出，在葡萄糖饥饿条件下的细胞中，在被免疫染色的细胞核中的荧光强度被抗P27抗原增加，并且细胞核内的蛋白酶体也被增加。仅作为参考，图6底部的图形显示在同一视界，以及如顶部图形所示的同一截面PI对DNA的染色结果，可以看出，对照组和葡萄糖饥饿条件下的染色结果类似。换句话说，该图所示的在顶部存在的荧光位于细胞核内。从图7(a)所示的蛋白质印迹分析中可发现，在线2的葡萄糖饥饿条件下细胞核部分内的蛋白酶体亚基P27的表达量增加，而与线1的对照组相反。另一方面，可以看出完整细胞萃取溶液的P27表达量，与线4的葡萄糖饥饿条件下的对照组相同，而与线3的对照组相反。类似地，从图7(b)可以看出，与在细胞核部分的线1的对照组相比，在线2的葡萄糖饥饿条件下，另一种蛋白酶体亚基P32的表达量也增加，而在完整细胞萃取溶液中则是相反的，在线3的对照组和线4的葡萄糖饥饿条件之问没有改变。
采用光密度分析法进行分析，发现在细胞核部分的P27和P32的表达量，在葡萄糖饥饿条件下增加约3倍。类似地，可以看出在缺氧条件下的细胞中，在细胞核部分的P27的表达量，与在图7(c)的线5的对照组相比，在线6的缺氧条件下是增加的，在细胞核部分的P32的表达量，与在图7(d)的线5的对照组相比，在线6的缺氧条件下是增加的。从光密度分析法分析的结果可以发现，这些增加约为2倍。从图7(c)和(d)中可以看出，线7和线8分别显示在对照组和缺氧条件下的完整细胞萃取溶液中的P27和P32表达量；然而，在对照组和缺氧条件下这二者都没有改变。相应地，这表明蛋白酶体存在于葡萄糖饥饿和缺氧条件下的细胞核中，并且与普通的培养条件相比，在细胞核中的表达量是增加的。在完整细胞萃取溶液中亚基的表达量不同于在普通培养条件下的细胞，因此，可以看出，在胁迫环境下蛋白酶体聚集在细胞核内。这与在实施例2中所示的胁迫环境下位于细胞核中的拓扑异构酶IIα的降解和增加中所涉及的蛋白酶体是不冲突的。另一方面，当在实施例2中比较葡萄糖饥饿与缺氧条件时，显示出拓扑异构酶IIα的表达在葡萄糖饥饿条件下降得更多。这一现象与葡萄糖饥饿条件下细胞核中蛋白酶体提高的量相吻合。
HT29细胞的培养以及细胞核抽提溶液的收集以实施例3描述的方式进行。使用荧光肽底物测定了细胞核抽提溶液中的蛋白酶体活性。将抽提到25微升的测试缓冲液[20mM HEPES-氢氧化钾(pH7.5)，5mM二硫苏糖醇，和10％v/v甘油]中的10-40微克的核蛋白与终浓度为20μM的荧光肽底物混合，在37℃反应1小时。将10微升的10％SDS加入该反应混合物中来终止反应。当测定蛋白酶体抑制剂和不抑制蛋白酶体的蛋白酶抑制剂的效果时，事先将核蛋白和抑制剂混合，在37℃反应10分钟，然后，将荧光肽底物加入反应溶液。在反应终止后，向反应混合物溶液中加入450微升的纯水，使用荧光光度计(日立公司产品)在激发波长为380nm下测定460nm的荧光强度。该荧光强度为确定为核抽提溶液中的蛋白酶体活性。
本实施例中所述的蛋白酶体抑制剂和不抑制蛋白酶体的蛋白酶抑制剂与实施例1中描述的相同。所使用的最终浓度对于蛋白酶体抑制剂PSI，MG115，和MG132来说为2.5μm，对于E64来说为5和10μm，以及对于ZLLa1来说为2.5和5μm。所使用的荧光肽底物如下所述。
Z-LLL-MCA(苄酯基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酸4-甲基-coumaryl-7-酰胺)PeptideInstitute Inc.产品。
Suc-LLVY-MCA(琥珀酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-缬氨酰-L-酪氨酸-4-甲基-coumaryl-7-酰胺)Peptide Institute Inc.产品。
所得到的结果示于图8至10。图8(a)和图8(b)显示分别使用Z-LLL-MCA作为底物和Suc-LLVY-MCA作为底物测定的核抽提溶液的蛋白酶体活性。可以看出，所使用的底物在加入反应溶液中加入的总核蛋白量上呈现成比例的蛋白酶体活性，并且在葡萄糖饥饿条件下的细胞在核抽提溶液中的蛋白酶体活性中较高。从图9可以看出，在缺氧细胞中核抽提溶液中的蛋白酶体活性较高。作为参考，图9(a)和图9(b)显示分别使用Z-LLL-MCA作为底物和Suc-LLVY-MCA作为底物测定的结果。具体来说，发现在葡萄糖饥饿中，Z-LLL-MCA显示高4.2倍，以及Suc-LLVY-MCA显示高3.7倍的结果，另一方面，在缺氧状态下，Z-LLL-MCA显示高2.4倍，以及Suc-LLVY-MCA显示高2.2倍的结果。这与实施例4的结果吻合，并且显示在胁迫条件下细胞核中蛋白酶体的积累与细胞核中蛋白酶体活性的提高直接相关。此外，从图10可以看出，在使用Z-LLL-MCA作为底物的情况下，蛋白酶体抑制剂(PSI，MG115，和MG132)几乎完全抑制核抽提溶液中的蛋白酶体活性。另一方面，不抑制蛋白酶体的蛋白酶抑制剂几乎不抑制蛋白酶体活性。作为参考，图10(a)显示使用对照组和葡萄糖饥饿条件下的细胞的核抽提溶液时所得到的结果，图10(b)显示使用对照组和缺氧条件下的细胞的核抽提溶液时所得到的结果。
使用8周龄雌性裸鼠BALB/cAnNCrj-nu/nu(Charles RiverLaboratories产品)作为实验动物。为了在裸鼠中形成肿瘤块，移植了1×107HT29细胞。在移植8至10天之后，HT29细胞的肿瘤块生长至100至150m3，并且在此时间点开始治疗。
所使用的依托泊苷和lactacystin是哪些被制成抗癌药物，用于提高抗癌药物的效果。换句话说，依托泊苷通过溶解在水中被制成注射液，它含有Japanese Pharmacopoeia Polysorbate 80(80mg/ml)，Macrogol 300(650 mg/ml，纯乙醇(适当量)，和Japanese Pharmacopoeia benzyl alcohol(30my/ml)作为添加剂，制成浓度为20mg/ml并且所使用的lactacystin通过溶解在盐水中，制成浓度为100mg/ml。
在治疗中，将HT29肿瘤移植的小鼠分成4组，每组4只动物，每4天腹膜内注射三次(1)对照组用盐水处理，(2)依托泊苷33mg/g，(3)lactacystin 40mg/kg，(4)lactacystin 40mg/kg和依托泊苷etoposide 33mg/kg。作为参考，在(4)中的综合施用lactacystin和依托泊苷的情况下，首先施用lactacystin，5个小时后施用依托泊苷。从治疗开始，每4天一次测量肿瘤块的大小，以测定施用药物进行治疗的效果。
所得到的结果示于图11。从图11可以看出，与没有治疗的组相比，仅施用lactacystin和仅施用依托泊苷对肿瘤增长显示出很小的抑制，即很小的抗肿瘤效果系数。另一方面，综合施用lactacystin和依托泊苷在治疗开始后立即显示出几乎没有肿瘤增长，因此可知，综合施用lactacystin和依托泊苷具有强的抗癌效果。实施例6(在人癌细胞移植的小鼠模型2中抗癌治疗的效果的提高)与上述的实施例5相似，测定了同时施用两种药物，即lactacystin，蛋白酶体抑制剂，和依托泊苷，靶向拓扑异构酶II的抗癌药物，的治疗效果。对裸鼠的HT29细胞的移植是按照实施例5所述的方法进行的。治疗是在HT29细胞的肿瘤块达到100至150mm3时开始的。HT29肿瘤移植的小鼠被分成4组，每组6只动物。每4天通过腹膜内施用药物两次进行治疗，如下文所述。(1)对没有治疗的对照组施用盐水，(2)施用33mg/kg的依托泊苷，(3)施用25mg/kg的lactacystin，和(4)同时施用25mg/kg的lactacystin和33mg/kg的依托泊苷。从治疗开始每4天测量一次肿瘤块的大小，以此测定施用药物的治疗效果。
所得到的结果示于图12。从图12可以看出，与没有治疗的组和单独用lactacystin或者单独用依托泊苷治疗的组相比，综合施用lactacystin和依托泊苷显示出强的抗肿瘤效果。换句话说，发现综合施用蛋白酶体抑制剂，lactacystin，和靶向拓扑异构酶II的抗癌药物，依托泊苷，与同时单独施用它们相比具有较强的抗肿瘤效应。
所得到的结果示于图13。从图13可以看出，与没有治疗的组和单独用lactacystin或者单独用阿霉素治疗的组相比，综合施用lactacystin和阿霉素显示出强的抗肿瘤效果。换句话说，蛋白酶体抑制剂，lactacystin，不仅与依托泊苷组合使用，而且也与靶向类似的拓扑异构酶II的抗癌药物阿霉素组合使用与单独治疗相比具有较强的抗癌效果。
对于M期同步化培养方法和在葡萄糖饥饿条件下培养的细胞培养条件描述于实施例1。将M期同步化的细胞培养在培养基中，向其中加入终浓度为10μM的lactacystin，或者培养基中没有加入这种物质，分别作为在普通条件和葡萄糖饥饿条件下的蛋白酶体抑制剂，培养13小时。在蛋白酶体抑制剂PSI和MG132的情况下，M期同步化的细胞被培养在培养基中，分别向其中加入终浓度为2.5μM的这些物质，或者在培养基中没有加入这些物质，在葡萄糖饥饿条件下培养13小时。为了检测这些细胞对拓扑异构酶I抑制剂喜树碱(Yakult生产)的敏感性，将该药物加入培养基中，并继续培养4小时。通过使用实施例1描述的集落形成方法测定细胞的敏感性。另一方面，作为喜树碱靶标的拓扑异构酶I的表达量通过实施例2所述的制备全细胞抽提溶液然后进行Western印迹来测定。作为参考，在测定拓扑异构酶I的表达量时，对于蛋白酶体抑制剂，clasto-lactacystinβ内酯(Boston Biochem产品)，它是一种激活形式的喜树碱，所使用的终浓度为2.5，5，10μM。同时，作为针对人拓扑异构酶I的抗体，使用由Tsuruo等建立的鼠单克隆抗体。
所得到的结果示于图14至17。从图14，类似于实施例1描述的靶向拓扑异构酶II的抗癌药物的情况，可以看出，作为蛋白酶体抑制剂的lactacystin提高在存在与实体癌的葡萄糖饥饿条件下提高喜树碱作为拓扑异构酶I的杀细胞效应。令人感兴趣的是，在喜树碱的情况下，其杀细胞效应也在普通的培养条件下被1actacystin提高。换句话说，喜树碱的效果被作为蛋白酶体抑制剂的lactacystinde的提高在葡萄糖饥饿条件下可不受限制地观察到。从图15和16可以看出，蛋白酶体抑制剂PSI和MG132与喜树碱类似，也提高喜树碱的效果。换句话说，对于喜树碱的效果的提高，蛋白酶体抑制活性是重要的。喜树碱使可被裂解的拓扑异构酶I和DNA的复合体稳定，诱导细胞死亡，因而，已知与靶向拓扑异构酶II的抗癌药物的情况相似，其杀细胞效应与拓扑异构酶I的表达量相关，它是靶分子。但是，从图17(a)可以看出，拓扑异构酶I的表达量在普通条件和葡萄糖饥饿条件之间并不变化，如对照组所示，并且不论是否加入激活类型的lactacystin(2.5，5，和10μM)也不发生变化。作为参考，图17(b)显示通过使用与图17(a)相同的细胞抽提溶液测定拓扑异构酶IIα的表达量的结果，从对照组的两个泳道可以看出，拓扑异构酶IIα的表达量在葡萄糖饥饿条件下降低，并且也可以看出，表达的降低是由加入2.5，5，和10μM的激活类型的lactacystin完全抑制的。因而，由蛋白酶体抑制剂对靶向拓扑异构酶I的抗癌药物的效果的提高，这与靶向拓扑异构酶II的抗癌药物的情况不同，依赖于不伴随拓扑异构酶I的表达量的变化的未知的机制。关于这一未知的机制，基于蛋白酶体是细胞内进行蛋白质降解的酶这一事实，因而，据认为，该酶降解一种对于靶向拓扑异构酶I的抗癌药物的杀细胞效应的表现来说非常重要的蛋白质，从而导致对抗癌药物的抗性。据推测，蛋白酶体抑制剂抑制这一降解，从而增强靶向拓扑异构酶I的抗癌药物的效应。
对于M期同步化培养方法和在葡萄糖饥饿条件下培养的细胞培养条件描述于实施例1。将M期同步化的HT29细胞培养在培养基中，向其中加入终浓度为7.5μM的lactacystin，或者培养基中没有加入这种物质，分别作为在普通条件和葡萄糖饥饿条件下的蛋白酶体抑制剂，培养13小时。为了检测这些细胞对顺铂((Bristol Myerss Squibb K.K.生产)的敏感性，将该药物加入培养基中，并继续培养4小时。通过使用实施例1描述的集落形成方法测定细胞的敏感性。
所得到的结果示于图18。从图18可以看出，作为蛋白酶体抑制剂的lactacystin提高顺铂的杀细胞效应。可以看出，lactacystin对顺铂的效应的提高类似于靶向拓扑异构酶I的抗癌药物的情况，在普通的培养条件和葡萄糖饥饿条件下均有效。与靶向拓扑异构酶的抗癌药物不同的是癌细胞在胁迫环境中对顺铂显示出高的敏感性，有趣的是，这一现象与现阶段的临床实验中顺铂显示出最高的效果相吻合。而且，作为蛋白酶体抑制剂的lactacystin对效果的提高有希望对改善顺铂治疗实体癌的结果有帮助。据认为，顺铂与癌细胞中的DNA链相结合来抑制DNA的合成以及癌细胞随后的分裂。但是，目前还没有证据显示蛋白酶体抑制剂是如何诱导顺铂的效应的提高的。
对于M期同步化培养方法和在葡萄糖饥饿条件下培养的细胞培养条件描述于实施例1。将M期同步化的HT29细胞培养在培养基中，向其中加入终浓度为5μM的decarboxy lactacystin，或者培养基中没有加入这种物质，分别作为在普通条件和葡萄糖饥饿条件下的蛋白酶体抑制剂，培养13小时。为了检测这些细胞对依托泊苷(Bristol Myerss Squibb K.K.生产)的敏感性，将该药物加入培养基中，并继续培养4小时。通过使用实施例1描述的集落形成方法测定细胞的敏感性。另一方面，将M期同步化的HT29细胞培养在培养基中，向其中加入终浓度为0.5，1，2.5，和5μM的decarboxy lactacystin，或者培养基中没有加入这种物质，分别作为在普通条件和葡萄糖饥饿条件下的蛋白酶体抑制剂，培养13小时，来检测拓扑异构酶IIα(即依托泊苷的靶分子)的表达量。拓扑异构酶IIα的表达量是通过制备总细胞抽提溶液然后进行Western印迹来测定的，如实施例2所述。
所得到的结果示于图19。从图19的上部可以看出，作为蛋白酶体抑制剂的decarboxy lactacystin与lactacystin类似，提高依托泊苷的杀细胞效应。从图19的底部可以看出，作为蛋白酶体抑制剂的decarboxy lactacystin与lactacystin类似，抑制有葡萄糖饥饿造成的拓扑异构酶IIα的表达量的降低。
细胞培养条件描述于实施例1。将M期同步化的HT29细胞培养在培养基中，向其中加入终浓度为5μM的decarboxy lactacystin，或者培养基中没有加入这种物质，分别作为在普通条件和葡萄糖饥饿条件下的蛋白酶体抑制剂，培养13小时。为了检测这些细胞对SN38(Yakult生产)的敏感性，将该药物加入培养基中，并继续培养4小时。通过使用实施例1描述的集落形成方法测定细胞的敏感性。
所得到的结果示于图20。从图20可以看出，与lactacystin相似，lactacystin的衍生物decarboxy lactacystin在普通条件下可提高SN38，即喜树碱的衍生物的杀细胞效应。
对于M期同步化培养方法和在葡萄糖饥饿条件下培养的细胞培养条件描述于实施例1。将M期同步化的细胞培养在培养基中，向其中加入终浓度为7.5μM的lactacystin，或者培养基中没有加入这种物质，分别作为在葡萄糖饥饿条件下的蛋白酶体抑制剂，培养13小时。为了检测这些细胞对丝裂霉素C(Kyowa Hakko产品)和博来霉素(Nippon Kayaku产品)的敏感性，将该药物加入培养基中，并继续培养4小时。通过使用实施例1描述的集落形成方法测定细胞的敏感性。
所得到的结果示于图12。从图12的上端可以看出，作为蛋白酶体抑制剂的lactacystin在葡萄糖饥饿条件下提高了丝裂霉素C(a)和博来霉素(b)的杀细胞效应。
丝裂霉素C被制备成注射形式的抗癌药物，这是通过将用于注射的Japanese Pharmacopoeia水以5ml中2mg丝裂霉素C(factor)的比例制备的。当需要时将其稀释至预先确定的浓度，用于上述的操作。
另一方面，将博来霉素盐酸盐形式的15mg至30mg(factor)的博来霉素溶解在约5至20ml的盐水中，制备成注射液，这是抗癌药物中的一种药物形式。当需要时将其稀释至预先确定的浓度，用于上述的操作。
如上文所述，可以看出，针对暴露与实体癌内生理胁迫并且耐受靶向拓扑异构酶II的抗癌药物的癌细胞，蛋白酶体抑制剂作为提高抗癌药物的效应的试剂显示出非常合理的效力。此外，如使用靶向拓扑异构酶I的抗癌药物的实施例8，使用铂复合物的顺铂的实施例9，和使用烷化剂丝裂霉素和博来霉素的实施例12所示，任何一种抗癌药物，在可以假定蛋白酶体降解用于表达抗癌药物的杀细胞效应的重要蛋白质，从而导致抵抗抗癌药物的情况下，无论癌细胞所处的环境如何，可以明显看出，蛋白酶体抑制剂可被用作提高抗癌药物的效应的试剂。
权利要求
1.一种提高抗癌药物效果的抗癌药物增强剂，其特征在于其有效成分是抑制蛋白酶体活性的物质，它具有提高DNA链破坏型抗癌药物对癌细胞效应的功能。
2.按照权利要求1的抗癌药物增强剂，其特征在于所述DNA链破坏型抗癌药物是一种在蛋白酶体活性存在情况下其效果被抑制或降低的抗癌药物。
3.按照权利要求1的抗癌药物增强剂，其特征在于所述抗癌药物含有一种抑制拓扑异构酶活性的物质作为有效成分。
4.按照权利要求2的抗癌药物增强剂，其特征在于所述抗癌药物是抑制拓扑异构酶I活性的物质和抑制拓扑异构酶II活性的物质中的至少一种。
5.按照权利要求1的抗癌药物增强剂，其特征在于所述DNA链破坏型抗癌药物是一种通过直接作用于DNA而破坏DNA的抗癌药物。
6.按照权利要求1-5中任何一个的抗癌药物增强剂，其特征在于所述抑制蛋白酶体活性的物质为选择性蛋白酶体活性抑制剂。
7.按照权利要求1-5中任何一个的抗癌药物增强剂，其特征在于所述抑制蛋白酶体活性的物质为非肽醛蛋白酶体活性抑制剂。
8.按照权利要求1-7中任何一个的抗癌药物增强剂，其特征在于所述癌症为实体癌。
9.按照权利要求1-7中任何一个的抗癌药物增强剂，其特征在于所述癌症处于生理胁迫状态。
10.按照权利要求9的抗癌药物增强剂，其特征在于所述生理胁迫状态为葡萄糖饥饿胁迫状态和组织缺氧胁迫状态。
11.一种抗癌药物和提高抗癌药物效果的增强剂的药物组，其特征在于所述增强剂为抑制蛋白酶体活性的物质，它通过抑制癌细胞中蛋白酶体的活性而具有提高所述抗癌药物效果的功能，并且所述抗癌药物为当蛋白酶体活性存在时其效果可以被抑制或降低的抗癌药物。
12.按照权利要求11的药物组，其特征在于所述抗癌药物含有抑制拓扑异构酶活性的物质作为有效成分。
13.按照权利要求12的药物组，其特征在于所述抗癌药物是抑制拓扑异构酶I活性的物质和抑制拓扑异构酶II活性的物质中的至少一种。
14.按照权利要求11的药物组，其特征在于所述抑制蛋白酶体活性的物质为lactacystin。
15.按照权利要求11-14中任何一个的药物组，为包括含有所述抗癌药物的制剂和含有其它所述抑制蛋白酶体活性的物质的制剂的两种制剂的药物组。
16.按照权利要求11-14中任何一个的药物组，为在同一制剂中含有所述抗癌药物和所述抑制蛋白酶体活性的物质的混合物形式。
17.按照权利要求11-16中任何一个的药物组，其特征在于所述癌症为实体癌。
18.按照权利要求11-16中任何一个的药物组，其特征在于所述癌症处于生理胁迫状态。
19.按照权利要求18的药物组，其特征在于所述生理胁迫状态为葡萄糖饥饿胁迫状态和组织缺氧胁迫状态。
20.一种通过直接作用于DNA而破坏DNA的抗癌药物和抑制蛋白酶体活性的药物的药物组。
21.按照权利要求20的药物组，其特征在于通过直接作用于DNA而破坏DNA的抗癌药物为铂复合物、烷化剂和博来霉素类药物。
22.按照权利要求20的药物组，其特征在于抑制蛋白酶体活性的物质为选择性蛋白酶体活性抑制剂。
23.按照权利要求22的药物组，其特征在于所述选择性蛋白酶体活性抑制剂为lactacystin。
24.一种癌症治疗方法，其特征在于给药一种DNA链破坏型抗癌药物和一种抑制蛋白酶体活性的物质，这种抑制蛋白酶体活性的物质具有提高DNA链破坏型抗癌药物对癌细胞的效应的功能。
25.抑制蛋白酶体活性的物质并具有提高DNA链破坏型抗癌药物对癌细胞效应的功能的物质在制备提高抗癌药物效应的药物中的应用。
全文摘要
将蛋白酶体活性抑制剂与应用拓扑异构酶活性抑制剂的抗癌药物组合应用,能抑制蛋白酶体活性对拓扑异构酶的降解,以保持在癌细胞中有足够量的拓扑异构酶,并通过拓扑异构酶活性抑制剂对此的靶向作用可以提高抗癌药物的效应。另一方面,与蛋白酶体活性抑制剂组合应用同样可以提高DNA链破坏型抗癌药物直接作用于DNA的效应,如铂复合物、烷化剂和博来霉素类,其效应通过蛋白酶体活性被抑制或降低。
文档编号A61K45/06GK1339970SQ00803697
公开日2002年3月13日 申请日期2000年2月10日 优先权日1999年2月10日
发明者鹤尾隆, 富田章弘, 小木曾泰成, 大村智 申请人:鹤尾隆, 社团法人北里研究所, 日本化药株式会社