用于基因治疗的原代培养脂肪细胞的制作方法

专利名称：用于基因治疗的原代培养脂肪细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于基因治疗的原代培养脂肪细胞，其导入了异源基因。
背景技术：
目前的基因治疗(Toyooka等，Folia Pharmacol.Jpn.116158-162，2000)可以被分为两组(1)通过直接投药编码基因的病毒载体、裸露质粒等将治疗性基因导入患者的方法(体内)，和(2)暂时从患者取出细胞，将基因导入这些细胞，然后将这些细胞送回患者的方法(回体)。
在体内法中，主要问题仍有待解决，例如导入效率、持续表达、以及将基因选择性导入靶细胞。另一方面，回体法可能可以克服这些问题。回体法的主要实例已经通过利用血液系统细胞(外周血淋巴细胞和骨髓细胞)进行，这是由于它们的收集和移植相对容易，并且患者的负担被降低(Taniet al.Saishin Igaku，56258-267，2001)。对非血液系统细胞的细胞而言，已经实现了将基因导入肝细胞并将这些细胞送回患者的方法(Raper，S.E et al.，Cell Tranplant 2(5)381-400，1993)，但这些方法中的大多数着眼点在转染细胞自身的功能的恢复、维持和增强。

发明内容
在寻找适合回体基因治疗的细胞时，本发明人开发了利用原代培养脂肪细胞的观念。使用脂肪细胞具有以下优点(1)有许多报道是关于脂肪细胞分泌的体液因子的，且脂肪细胞包含产生激素的功能，并作为分泌性器官起作用(Bradley R.D.，et al.，RecentProg.Horm.Res.，2001，56，329-358)；(2)由于它们也存在于皮下，脂肪细胞可被轻易收集，并且在整形和美容外科领域发展出了涉及它们的摘出的技术；此外，即使为了使移植容易将脂肪细胞移植到皮下组织，这些细胞也不是异向的，因为它们本来就属于这一区域；
(3)由于即使在体外，分离的原代培养脂肪细胞也活跃地增殖，它们适合例如基因导入的过程；(4)由于脂肪细胞很可能在移植后停留在限定的区域中，如果需要，移植的细胞可在移植后被摘出(尤其是想要消除基因表达的时候)；(5)由于脂肪细胞本身产生血管生成因子(Mick，G.J.et al.，Endocrinology 2002，143(3)948-53)，移植后可期待高植入水平；(6)由于这一器官的重量在成人中变化很大，脂肪细胞摘出或移植对人体的影响较小；且(7)脂肪细胞被广泛认为是多余且妨碍的，且易于征得对收集它们的同意。
尽管目前正利用角质细胞进行目的相似的研究(J.Gene.Med.2001年1月-2月，3(1)21-31；Histochem.Cell Biol.2001 Jan，115(1)73-82)，在分离原代培养过程中去除皮肤的生物学屏障由于考虑到感染的危险性而变得棘手。在摘出和移植过程中患者的疼痛预期很严重，且不容易再次摘出(4，上述)以消除表达。此外，当利用只能进行平面移植的角质细胞或皮肤时，仅可通过增大移植物表面积来增加移植物的量。因此，允许立体移植的脂肪细胞被认为更有用。
本发明人设计了将基因有效地导入原代培养脂肪细胞中的方法。他们还证实导入的基因在移植后起作用，并发现脂肪细胞在基因治疗中可被有效利用。此外，在体内长期稳定表达导入的异源基因的脂肪细胞可通过本发明的方法获得。植入的成熟脂肪细胞可继续表达异源基因一年或更长时间。此外，如果异源基因的表达在脂肪细胞植入后成为不必要的，可通过去除移植物停止表达。
特别地，本发明涉及用于基因治疗的原代培养脂肪细胞，其稳定保持编码分泌到细胞外的蛋白的异源基因，产生这些细胞的方法，包含这些细胞的移植组合物，这些细胞的用途等，更特别地涉及[1]用于基因治疗的原代培养脂肪细胞，其中脂肪细胞稳定保持编码分泌到细胞外的蛋白的异源基因。
[1]的脂肪细胞，其中基因通过逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体导入细胞。
[1]的脂肪细胞，其具有在体内明显表达蛋白至少20天的能力。
[1]的脂肪细胞，其被用来将蛋白释放到血流中。
[1]的脂肪细胞，其中蛋白是胰岛素或胰高血糖素样肽1(GLP-1)。
生产用于基因治疗的脂肪细胞的方法，其中方法包含以下步骤(i)原代培养脂肪细胞；和(ii)导入，并随后稳定保持编码分泌到细胞外的蛋白的异源基因。
[6]的方法，其中异源基因通过逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体导入。
用于基因治疗的脂肪细胞，其通过[6]或[7]的方法生产。
用于基因治疗的移植组合物，其中组合物包含原代培养的脂肪细胞，所述原代培养的脂肪细胞稳定保持编码分泌到细胞外的蛋白的异源基因，以及药学上可接受的载体。
[9]的移植组合物，其进一步包含细胞外基质成分。
[9]的移植组合物，其进一步包含血管生成因子。
基因治疗方法，其包含将原代培养脂肪细胞投药给身体的步骤，所述原代培养脂肪细胞稳定保持编码分泌到细胞外的所需治疗性蛋白的异源基因。
将蛋白释放到血流中的方法，其中方法包含将原代培养脂肪细胞投药给身体的步骤，所述原代培养脂肪细胞稳定保持编码分泌到细胞外的蛋白的异源基因。
[13]的方法，其是将所述蛋白释放到血流中20天或更多天的方法。
降低血糖的方法，其中所述方法包含将原代培养脂肪细胞投药给身体的步骤，所述原代培养脂肪细胞稳定保持编码胰岛素或胰高血糖素样肽1(GLP-1)的基因；和[16]动物，其身体移植了原代培养脂肪细胞，所述原代培养脂肪细胞稳定保持编码分泌到细胞外的蛋白的异源基因。
下文将描述实施本发明的方式。
首先，本发明提供用于基因治疗的原代培养脂肪细胞，其中脂肪细胞稳定保持编码分泌到细胞外部的蛋白的异源基因。
在此，异源基因指从外部导入原代培养脂肪细胞的基因，并包括编码不是由原代培养脂肪细胞产生的蛋白的基因。此外，原代培养脂肪细胞指从由活体取出的组织培养的非确立细胞。脂肪细胞指成熟脂肪细胞以及包含分化成脂肪组织的能力的细胞，例如前脂肪细胞(preadipocyte)。更特别地，除非脂肪细胞特别称为“成熟”脂肪细胞，它们也包括前脂肪细胞。成熟脂肪细胞是储存脂肪的球形细胞，并含有脂滴。储存在成熟脂肪细胞中的脂肪可以利用油红O染色鉴定。成熟脂肪细胞对胰岛素产生应答时通常分泌瘦素(leptin)。前脂肪细胞通常作为尚未分化成成熟脂肪细胞的间质细胞存在。前脂肪细胞可通过用胶原酶处理脂肪组织来分离，或者利用后面所描述的天花板培养法(ceiling culture)作为成熟脂肪细胞分裂的结果加以分离(Sugihara，et al.Nippon Rinsho 1995，53，115-120；Sugihara，H.，et al.J.Lipid Res.1987，28，1038-1045；Zhang H.H.，et al.J.Endcriniol.2000，164，119-128)。尽管脂肪细胞特异性表面抗原的存在尚未被证实，在成熟脂肪细胞中已经发现CD36高水平的表达(Abumrad N.A.，et al.J.Biol.Chem.1993年8月25日，268(24)17665-8)。因此，极度纯的脂肪细胞可以通过利用这样的分子作为标记物来收集。通过如下述诱导分化，前脂肪细胞可在数天到数周内分化成成熟脂肪细胞(Hauner H.，et al.，J.Clin.Invest.84，1663-1670，1989；Marko，etal.，Endocrinology 136，4582-4588，1994)。原代培养脂肪细胞可从需要的组织分离，例如皮下脂肪组织或内脏脂肪组织例如附睾周围的组织或者肠系膜组织。
用语“用于基因治疗”指利用异源基因编码蛋白的体内表达来期待治疗效果。此外，用于基因治疗的细胞指携带异源基因的细胞，其中细胞用于通过回体投药将异源基因投药给身体，并且细胞包含在该身体内表达蛋白的能力。回体投药指从个体取出脂肪组织或脂肪细胞，进行体外基因导入，然后将细胞移植到相同或不同的个体。
用于基因治疗的细胞优选指用于治疗疾病的细胞，它们是被移植以产生特定蛋白的细胞。优选地，通过特定蛋白的治疗包括替代疗法，其利用一种蛋白，所述蛋白的物理性或功能性缺陷或缺失导致疾病；或者中和疗法，其利用包含中和导致某病理发生的发作及恶化的因子的作用的蛋白。优选地，特定蛋白是在血流中显示活性的蛋白，或者通过血流供给靶组织，并且在该组织的细胞表面起作用。在一定时期(例如数天到数周或更长时间)，连续供给特定蛋白也是优选的。已经对其进行了蛋白替代疗法或者预测所述疗法对其有效的因子或疾病都可作为靶对象。
以下，根据其分类列出代表性的靶对象，但其用途不应理解为限制于这些实施例，且将类似因子用于类似目的也包含在本发明的范围内。
替代疗法包括针对由于激素或细胞因子的功能缺乏或降低而出现或加重的疾病进行补充，针对由于先天性遗传缺陷的疾病进行补充，以及用于病理改善的因子的补充胰岛素/糖尿病；胰高血糖素样肽-1(GLP-1)/糖尿病，肥胖症，摄食障碍；GLP-2/炎性肠病，癌症化疗伴随的胃肠道疾病；瘦素(leptin)/肥胖症，脂肪营养障碍性糖尿病；脂柄蛋白(adiponectin)/糖尿病，血管病；凝血因子VIII和IX/血友病；脂蛋白脂肪酶(LPL)/LPL缺陷，高甘油三酯血症；卵磷脂胆固醇乙酰转移酶(LCAT)/LCAT-缺陷；红细胞生成素/红细胞减少症；脂蛋白A-I/低HDL胆固醇血症；白蛋白/低蛋白血症；心房利尿钠肽(ANP)/高血压，心衰；促黄体激素释放素(LHRH)/乳腺癌，前列腺癌；制管张素，内皮细胞抑制素(endostatin)/血管生成，转移抑制；吗啡受体激动肽(内源性鸦片样肽(例如脑啡肽)，强啡肽等)/缓解疼痛；降钙素和骨形成因子(BMP)/骨质疏松症；干扰素α和β/恶性肿瘤；干扰素-γ/恶性肿瘤，肝炎，过敏症；干扰素β1/多发性硬化；白介素1α和1β/恶性肿瘤；白介素-4/银屑病；白介素-10/自身免疫疾病；白介素-12/恶性肿瘤；胰腺分泌性胰蛋白酶抑制物/胰腺炎；过氧化物歧化酶/缺血性心脏病，血管病；等。
针对病理形成因子或恶性转化因子的中和疗法包括产生溶解的受体或中和抗体的部分肽，或者显性失活蛋白。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的溶解的受体/类风湿性关节炎；溶解的IgE受体/过敏症；溶解的IgA受体/食物过敏；溶解的细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA4)/自身免疫疾病；溶解的CD40配体/免疫疾病；显性失活凝血因子VIIa/血栓症；成纤维细胞生长因子(FGF)溶解的受体/血管内膜增厚，等。
此外，本发明的脂肪细胞不限于那些用于所谓“治疗”的细胞，但包括用于所需分泌性蛋白的体内表达的细胞。例如，本发明的方法使通过特定蛋白的后天表达产生模型动物成为可能。使用这些方法，可以产生具有病理发生或恶化因子的后天表达的疾病模型动物，并且这些动物可用于筛选药物。此外，通过表达病理改善因子，这些方法可用作新药发现的有指导意义的假设的证据，在这样的假设中给定因子可改善病理状况。所用动物包括所需的非人动物，并优选非人哺乳动物(包括啮齿类和灵长类)。
本发明的用于基因治疗的原代培养脂肪细胞稳定保持编码分泌到细胞外的蛋白质的异源基因。用语“稳定保持”指异源基因在细胞分裂中传代到子细胞，且更特别地，该用语指将异源基因掺入细胞染色体。本发明的用于基因治疗的脂肪细胞优选包含异源基因，其通过染色体掺入型病毒载体稳定导入。更优选地，异源基因通过逆转录病毒载体导入。
逆转录病毒载体稳定整合到细胞染色体中，并包含长期表达导入基因的能力。载体的导入效率以及导入基因的持续表达有赖于细胞类型。例如，通过逆转录病毒载体导入的基因可在细胞生长同时表现出连续表达，但细胞生长停止时表达可能停止(Lund，A.H.，et al.，J.Biomed.Sci.1996，3365-378；Niwa，O.et al.，1983，Cell，321105-1113)。常常观察到异源基因表达被抑制，尤其是通过体内或回体方法将基因导入机体以后。这样的表达抑制据称与导入基因的启动子或编码序列的从头甲基化有关(Jahner，D.和Jaenisch，R.，Nature 315594-597，1985；Challita，P.-M.和Kohn，D.B.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 912567-2571，1994；Hoeben，R.C.，et al.，J.Virol.65904-912，1991)。此外，组蛋白的去乙酰化与导入基因的沉默有关(Chen，W.Y.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97377-382，2000；Chen，W.Y.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA945798-5803，1997)。然而，当本发明人利用逆转录病毒载体将异源基因导入原代培养脂肪细胞时，令人吃惊地发现导入基因的表达在体外和体内都极其稳定地持续。导入基因的表达在分化前的脂肪细胞以及成熟脂肪细胞中都是稳定的。导入基因的表达被证实在体外培养实验的整个过程(80天或更多天)和被植入机体的实验的整个过程中(360天或更多天)持续。因此，稳定导入了异源基因的原代培养脂肪细胞，可用作长期稳定表达基因的植入物。
本发明的用于基因治疗的脂肪细胞包含在体外，或更优选在体内显著表达异源基因编码的蛋白至少20天或更多天的能力。用语“显著表达”指，例如与没有导入异源基因时相比，检测到统计学显著水平的表达(例如显著性水平5％或更高)。更优选地，本发明的脂肪细胞植入体内时，包含这样的能力，其在身体内显著表达异源基因编码的蛋白至少30天或更多天，优选40天或更多天，更优选至少50天或更多天，甚至更优选60天或更多天，还更优选80天或更多天，然而甚至更优选100天或更多天，然而甚至更优选150天或更多天，然而甚至更优选200天或更多天，然而甚至更优选250天或更多天，然而甚至更优选300天或更多天，且然而甚至更优选350天或更多天。
本发明的用于基因治疗的脂肪细胞尤其可用作将蛋白释放到血流中的细胞，所述蛋白由细胞携带的异源基因编码。释放到血流中的蛋白包括在血液中或靶组织细胞表面显示活性的所需分泌性蛋白，且实例包括所需的体液因子，例如激素和细胞因子，以及抗体。更具体的实例是，如上述的用于治疗糖尿病等的低血糖激素例如胰岛素和/或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)；用于治疗血友病等的凝血因子；TNF-α受体或抗TNF-α抗体(包括包含抗体可变区例如Fab和scFv的抗体片段)的溶解的片段，其用于治疗显示出TNF-α水平增高的疾病，例如类风湿性关节炎。例如，对胰岛素而言，裂解位点(位点1和位点2)可用脂肪细胞中表达的蛋白酶的裂解序列取代，使得成熟胰岛素可有效产生(例如，Groskreutz，D.J.，et al.JBC，1994，269(8)，6241)。在单链上被修饰的胰岛素类似物也可使用(Lee，H.C.，et al.，Nature.2000年11月23日，408(6811)483-8)。对GLP-1而言，作用为GLP-1受体配体的所需肽也可使用(NP_002053；Thorens，B.，et al.，Diabetes 42，1678-1682(1993)；Dillon，J.S.et al.，Endocrinology 133，1907-1910(1993)；Graziano，M.P.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.196，141-146(1993)；Stoffel，M.et al.，Diabetes 42，1215-1218(1993))。实例是GLP-1(7-37)(Diabetes，1998，47159-69；Endocrinology，2001，142521-7；Curr.Pharm.Des.，2001，71399-412；Gastroenterology，2002，122531-44)。
本发明还涉及生产用于基因治疗的脂肪细胞的方法，所述方法包含以下步骤(1)对脂肪细胞进行原代培养；和(2)将编码分泌到细胞外的蛋白的异源基因导入细胞中，优选利用逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，使得所述基因被稳定地保持。
本发明还涉及用该方法生产的用于基因治疗的脂肪细胞。“稳定保持”指导入异源基因，使得其在细胞分裂时传代到子细胞，且更特别地，其指异源基因整合到细胞染色体中。利用基因组DNA进行的DNA印迹法或PCR法可以在分子生物水平证明异源基因已经通过整合到染色体中而获得稳定表达。此外，为浓缩稳定转染的细胞，可利用例如这样一种方法，所述方法利用荧光活化的细胞分选法(FACS)，所述FACS通过识别和靶基因一起被细胞共表达的GFP浓缩细胞。
1.收集原代培养脂肪细胞的方法原代培养脂肪细胞可以通过Sugihara et al.的报告所述的方法(Sugihara，H.et al.，Differentiation，3142-49，1986)收集。更特别地，在无菌条件下，摘出脂肪组织，且优选移植受体自身的皮下脂肪组织或内脏脂肪组织，例如附睾周围的组织或肠系膜组织，并例如在用PBS洗涤以后，利用剪子或手术刀分碎。这一分碎的组织通过在包含适量胶原酶，优选1-3mg/ml，的培养基中在37℃震荡适当的时间，优选20-60分钟，以进行消化，并随后离心分离成沉淀的残余物和漂浮层。
漂浮层优选再通过离心洗涤一或二次，然后加入充满培养基的培养瓶。去除泡，并将烧瓶静置于CO2孵箱中进行培养，使得常规的培养表面在上方(天花板培养)。培养适当时间，优选10-14天，后，附着于天花板表面的细胞通过胰蛋白酶处理收集。这些细胞随后在传统培养系统中传代培养。
原代培养脂肪细胞可在基因导入以前或以后通过冷冻保存。该步骤使得脂肪细胞在单次收集后可多次利用。
2.脂肪细胞的基因导入基因导入可通过利用基因导入试剂(Fugene 6，Roche；Lipofectamin，Invitrogen；Cellphect转染试剂盒(磷酸钙法)，Amersham；等)，电穿孔法(Chen，H.et al.，J.Biol.Chem.1997，272(12)，8026-31)，或病毒载体(Kay，M.A.，et al.，Nat.Med.2001，7，33-40)进行。导入优选使用病毒载体进行，并更优选使用逆转录病毒载体(例如Arai，T.et al.，J.Virol.，1998，72，pp1115-21)。
当利用质粒进行基因导入时，质粒转染到脂肪细胞内，并且那些稳定保持导入的异源基因的脂肪细胞可被选择。这种脂肪细胞的选择可通过，例如用药物抗性基因装配在编码所述异源基因的质粒中，或者通过与携带药物抗性基因的质粒一起进行转染，并随后利用该药物选出被转染细胞来进行。另外，所述细胞可通过用限制性稀释技术克隆被转染细胞而获得。此外，当利用质粒进行基因导入时，可利用瞬时表达噬菌体来源的整合酶的方法来增加染色体插入的效率(Mol.Cell Biol.2001 Jun，21(12)3926-34)。
利用病毒载体将基因导入脂肪细胞的实例是利用腺伴随病毒(adeno-associated virus)(AAV)的方法。AAV是属于细小病毒科依赖病毒属的病毒，并且其特征为导入的基因整合到染色体中。整合异源基因的重组AAV载体的产生可通过将异源基因整合到两个末端反向重复序列(ITR)之间，并在腺病毒E1、E2A、和E4蛋白的存在下表达AAV包装蛋白(rep和cap基因产物)(Muzyczka，N.(1992)Curr.Top.Microbiol.Immunol.158，97-29；Kaplitt，M.G.et al.(1994)Nat.Genet.8，148-54；Xiao，X.etal.(1996)J.Virol.70，8098-108；Kessler，P.D.et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，14082-4087；Xiao，W.et al.(1998)J.Virol.72，10222-0226)。
本发明中，异源基因更优选用逆转录病毒载体导入脂肪细胞中。逆转录病毒指属于逆转录病毒科的病毒，并包括致癌病毒，泡沫病毒(Russell，D.W.和Miller A.D.，J.Virol.1996，70217-222；Wu，M.et al.，J.Virol1999，734498-4501)，以及慢病毒(例如HIV-1(Naldini，L.et al.，Science1996，272263-267；Poeschla，E.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996，9311395-11399；Srinivasakumar，N.et al.。J.Virol.1997，715841-5848；Zufferey，R.，et al.Nat.Biotechnol.1997，15871-875；Kim，V.N.，et al.，J.Virol.1998，72811-816)和猫免疫缺陷病毒(Johnston，J.C.et al.，J.Virol.1999，734991-5000；Johnston，J.和Power，C.，J.Virol.1999，732491-2498；Poeschla，E.M.et al.，Nat.Med.1998，4354-357))。优选用于本发明的逆转录病毒是莫洛尼鼠类白血病病毒(MoMLV)载体(T.M.Shinnick，R.A.Lerner和J.G.Sutcliffe，Nature 293，543-548，1981)。
所述逆转录病毒可以是自动失活(SIN)载体。SIN载体可以通过在病毒包装过程中缺失3’LTR的一部分制备(Yu S.F.et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 833194；Yee，J.K.et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 845197-5201；Zufferey，R.et al.，1998，J.Virology，72，9873-9880)。逆转录病毒中的异源基因可通过LTR转录，或者可从载体内的另一启动子表达。例如，可使用组成型表达启动子例如CMV启动子、EF-1α启动子、或CAG启动子、或所需的可诱导启动子。此外，可使用LTR的一部分被另一启动子取代的嵌合启动子。
为利用逆转录病毒导入基因，特别地，利用基因转染试剂等将携带待导入基因的质粒如pBabe CL-SEAP-IRES-GFP通过基因-导入法导入包装细胞例如293-EBNA细胞(Invitrogen)中。随后培养适当的时间，优选1-3天，并收集上清中产生的重组病毒。这些病毒随后被感染到待转染的脂肪细胞中。
逆转录病毒载体优选包含具有广泛向性的包膜蛋白，使得它们可感染各式各样的哺乳动物脂肪细胞，包括人的脂肪细胞。例如，可利用兼嗜性包膜蛋白(例如4070A)(保藏号K02729；Sorge，J.et al.，Mol.Cell.Biol.4(9)，1730-1737(1984))。在本发明中，所述逆转录病毒优选通过疱疹性口炎病毒G蛋白(VSV-G)(Rose，J.K.and Gallione，C.J.，J.Virol.39(2)，519-528(1981))被假型化(Emi，T.Friedmann和J.K.Yee，J.Virol.，65(3)，1202-1207(1991)；Yee，J.-K.et al.(1994)Methods Cell Biol.43 4399-112；Burns，J.C.et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90 908033-8037)。通过VSV-G的假型化使得基因高度有效地导入脂肪细胞中。VSV-G假型化载体可通过在包装细胞中表达VSV-G产生。更特别地，例如，可诱导性表达VSV-G的包装细胞可有利地被使用(例如，Arai T.et al.，J.Virol.，199872，pp1115-21)。
所产生的病毒的滴度的测定可通过用经过逐级稀释的病毒溶液感染细胞，并计数被感染细胞的集落数目(详细内容见Ausubel et al)。(AusubelFM、et al.编(1995)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley& Sons，NY))。或者，可通过Byun et al.的方法测定滴度(Byun，J.et al.(1996)Gene Ther.333331018-1020)，Tafuro et al.(Tafuro，S.et al.(1996)Gene Ther.33333679-684)，Miyao et al.(Miyao，Y.et al.(1995)Cell Struct.Funct.20 20177-183)，Claudio et al.(Claudio，P.P.et al.(2001)Anal.Biochem.29196-101)，或Cashion et al.(Cashion，L.M.et al.(1999)Biotechniques 26 26924-930)。
原代培养脂肪细胞可用使载体与细胞接触而导入病毒载体。例如，原代培养脂肪细胞可在包含病毒载体的培养溶液中孵育。脂肪细胞优选以前脂肪细胞(preadipocyte)的形式感染。加入约0.5-8μg/mL左右的1，5-二甲基-1，5二氮十一亚甲基聚甲溴化物可增加感染效率。感染复数(MOI)没有特别限制，但可在0.1-100的范围内适当调节。导入基因的细胞，可通过例如使用标记基因选出。然而，如果感染以大约2或更高，或优选大约3、4、5或更高的MOI进行，即使不进行选择，基因也可导入大多数细胞。基因导入的脂肪细胞无需进一步处理即可用于移植，或者在一定的情况下，它们可以通过在包含3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、地塞米松、和胰岛素的培养基中培养而被转化成成熟脂肪细胞。在这种情况下，由于IBMX和地塞米松主要用来活化脂肪细胞过氧化酶体增殖物活化的受体-γ(PPAR-γ)，可同时加入直接活化这一受体的药物(例如噻唑烷衍生物，吡格列酮(pioglitazone)/Takeda制药有限公司和罗格列酮(rosiglitazone)/GlaxoSmithKline)。
本发明携带所需治疗基因的原代培养的脂肪细胞可植入免疫学相匹配的受体的身体内，由此使通过治疗基因编码的分泌性蛋白的体内表达进行基因治疗成为可能。待移植的原代培养脂肪细胞优选与受体来自同样的宿主的细胞。本发明的原代培养脂肪细胞在其中进行移植的基因疗法可通过在体内表达所需分泌性蛋白，以期待所述蛋白的效果来应用。例如，疾病可通过移植本发明的脂肪细胞来治疗或预防，所述脂肪细胞保持这样的异源基因，其编码包含对疾病具有治疗或预防效果的蛋白。此外，本发明涉及将蛋白释放到血流中的方法，其中方法包含将这一发明的原代培养脂肪细胞投药给身体的步骤。利用这些方法，异源基因编码的蛋白可明显分泌到血流中至少20天或更多天，优选30天或更多天，更优选40天或更多天，甚至更优选50天或更多天，还更优选60天或更多天，然而甚至更优选80天或更多天，然而甚至更优选100天或更多天，然而甚至更优选150天或更多天，然而甚至更优选200天或更多天，然而甚至更优选250天或更多天，然而甚至更优选300天或更多天，且然而甚至更优选350天或更多天。身体中表达的异源基因可通过例如免疫测定例如EIA来检测和/或定量。取出移植细胞可在任何时间停止投予的异源基因的表达。在一些情况下，通过将可诱导的自杀基因(例如HSV-tk)导入移植细胞，例如通过投与甘环鸟苷(ganciclovir)，来消除移植细胞。
本发明还提供了用于基因治疗的移植组合物，其中组合物包含原代培养细胞和药学上可接受的载体，所述细胞稳定保持编码分泌到细胞外的蛋白的异源基因。载体的实例是生理盐水，磷酸盐缓冲液，培养溶液，血清，以及体液。这些载体可以和成为细胞支架(scaffold)的固相或凝胶支持物结合。
本发明的移植组合物优选包含细胞外基质(ECM)成分。细胞外基质成分指细胞间积聚的不可溶网状或纤维状结构中所含的如蛋白或粘多糖这样的成分。它们可从生物体分离或用人工方法重构。本发明优选使用的ECM成分是胶原，纤连蛋白，玻连蛋白，层粘连蛋白，硫酸乙酰肝素，蛋白聚糖，糖胺聚糖，硫酸软骨素，透明质酸盐，硫酸皮肤素，硫酸角质素，弹性蛋白，或两种或两种以上上述物质的组合。优选地，这些ECM成分形成凝胶，并随后和脂肪细胞混合。本发明所用ECM凝胶没有特别的限制，只要其包含至少一或多种上述成分即可，但优选包含至少IV型胶原，层粘连蛋白，和硫酸乙酰肝素。这样的ECM包括从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肿瘤中提取的基质(Matrigel)(Becton Dickinson Labware)(美国专利4,829,000)。包含ECM成分和本发明所用的脂肪细胞的组合物的结构没有特别的限制，且可以是例如凝胶或糊状网状结构、纤维状结构、平板(盘)状结构、蜂窝状结构、以及海绵样结构。ECM成分可根据常规方法凝胶化。例如，可通过将包含大约0.3-0.5％胶原蛋白的水溶液在37℃孵育10-30分钟进行凝胶化。另外，ECM成分可通过使用凝胶化试剂凝胶化。
此外，本发明的移植组合物优选包含血管生成因子。本发明包含血管生成因子的移植组合物使移植后在它们周围形成血管，并以更高的效率将异源蛋白分泌到血流中。血管生成因子没有特别的限制，只要它们是可在体内诱导血管生成的因子，且实例是血管内皮细胞生长因子(VEGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，血小板源性生长因子，转化生长因子-β(TGF-β)，骨粘连蛋白，血管生成素，和肝细胞生长因子(HGF)。最优选的实例是bFGF。bFGF也称为FGF2，其不仅是成纤维细胞生长因子，还具有促进各种细胞例如血管内皮细胞、软骨、成骨细胞、和表皮细胞的生长的活性(Abraham et al.，EMBO J.，5，2523-2528，1986；Prats et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，1836-1840，1989)。本发明所用bFGF不仅是天然蛋白，而且可通过重组DNA技术经遗传工程来产生，且其修饰形也是。bFGF的实例是WO87/01728、WO89/04832、WO86/07595、WO87/03885、欧洲专利申请237966、281822、326907、394951和493737中所述的那些。或者可将瞬时表达血管生成因子的另一表达载体导入脂肪细胞(见WO97/49827)。以这种方式使用的血管生成因子的主要目的是在移植的细胞周围形成血管，使得异源蛋白可有效从本发明的脂肪细胞分泌到血流中。因此，当使用编码血管诱导因子的载体来从脂肪细胞表达该血管诱导因子时，优选使用瞬时表达载体(更特别地为没有掺入染色体的载体)。当脂肪细胞长期表达血管诱导因子时，过量的血管在移植的脂肪细胞周围形成，这导致全身的副作用。因此，优选编码血管生成因子的异源基因不被稳定导入本发明的原代培养脂肪细胞。
3.脂肪细胞的移植基因导入的脂肪细胞以适当的细胞浓度制备，优选0.2×107-2×107细胞/mL，或者用逆转录病毒转染时为0.2×106-5×106细胞/mL。它们照现在的样子通过与有效的介质混合输注入皮下组织或脂肪组织，优选皮下组织，所述介质优选含有例如胶原蛋白的细胞外基质的溶液。通过制造切口并暴露脂肪组织可注入脂肪组织中。终末分化成成熟脂肪细胞的细胞移植后不会增殖，并将以恒定水平长期表达异源基因。异源基因在接受移植物的身体内的表达水平与植入细胞数量成正比。因此，当进行移植时，通过调节植入的脂肪细胞的量，使之与异源基因在体外预测定的表达水平相匹配，可在接受移植物的身体内长期保持所需的表达水平。
附图简述

图1是从3周大ICR小鼠的皮下脂肪中分离的原代培养脂肪细胞的一套显微照片。(A)显示天花板培养14天后，附着于天花板侧培养表面的脂肪细胞，(B)显示在正常培养物中生长的原代培养脂肪细胞，(C)显示由于分化诱导而储存脂肪滴的成熟脂肪细胞，(D)显示分化诱导细胞的油红O染色像。
图2显示了通过将原代培养脂肪细胞(来自ICR小鼠的皮下脂肪)植入ICR裸小鼠获得的血浆碱性磷酸酶(AP)活性，所述脂肪细胞用表达AP的质粒pcDNA3.1-SEAPmh瞬时转染。
图3显示逆转录病毒载体MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP转导入来自各种脂肪组织的原代培养脂肪细胞中时，基因导入效率的比较。
图4是显示转导有MLV(VSV)/pBabeCL(GFP)IP的原代培养脂肪细胞的分化诱导像的一套显微照片。(A)是光学显微镜照片，且和(B)是同一视野的GFP荧光照片。
图5显示转导入AP表达病毒载体的原代培养脂肪细胞传代培养中的AP表达持续的时间。(A)是将SEAP基因(MLV(VSV)/pBabeCL(SEAPmh)I2G)或PLAP基因(MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP)转导入源自C57BL/6小鼠皮下脂肪的细胞的结果。(B)是将PLAP基因(MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP)或GFP基因(PLAP基因(MLV(VSV)/pBabeCL(GFP)IP)导入ICR小鼠脂肪细胞中的结果。
图6是一系列照片和图，显示分化诱导的基因导入脂肪细胞中表达的改变。(A)显示原代培养脂肪细胞在非分化诱导条件下的GFP光学显微镜像，其中所述转染了MLV(VSV)/pBabeCL(GFP)IP的脂肪细胞源自ICR皮下脂肪。(B)显示分化诱导条件下获得的相似的GFP显微镜像。(C)显示在非分化诱导条件(非分化)和分化诱导条件(分化)下MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP转染的原代培养脂肪细胞(来自ICR皮下脂肪)的AP产生。
图7显示通过质粒转染导入原代培养脂肪细胞中的胰岛素原的产生。
图8显示转导入表达AP的AAV的原代培养脂肪细胞(来自C57BL/6小鼠皮下脂肪)的AP的稳定表达。
图9显示由表达s1s2B10胰岛素的逆转录病毒载体转染的原代培养脂肪细胞中进行分化诱导时，胰岛素的表达。(A)显示利用森永(Morinaga)生产的EIA的结果，且(B)显示了利用IBL生产的EIA的结果。
图10显示表达GLP-1(7-37)的逆转录病毒载体转染的原代培养脂肪细胞中GLP-1(7-37)的表达。一式三份进行测定，并显示他们的平均值和标准偏差。
图11显示移植前分化诱导刺激的存在或缺乏对表达AP的原代培养脂肪细胞移植中的体内AP表达的影响。
图12是一套图和照片。(A)显示当表达AP的原代培养脂肪细胞在存在利用补充有碱性FGF的Matrigel进行分化刺激的条件下，血浆AP活性的变化。(B)显示摘出植入的Matrigel时血浆AP活性消失(个体A)。(C)显示从接受GFP转导细胞的对照组摘出Matrigel的GFP光学显微镜像。对于(A)中所示的PLAP植入组，显示的值为直到第32天为止对每个个体进行测定的组平均值和标准偏差。剩余的值为平均值。
图13显示通过图12(A)的方法以及各种其它方法，对接受移植物的小鼠的血中进行长期AP活性检测的结果。
图14显示在移植后期进行类似图12(B)的摘出试验的结果。
图15显示植入表达AP的脂肪细胞时，血AP活性对植入的细胞数目的依赖性。显示的值是每个个体测定的组平均值和标准偏差。
图16显示将表达s1s2B10胰岛素的脂肪细胞植入STZ诱导的糖尿病小鼠中的效果。(A)显示对空腹血浆葡萄糖水平的效果，和(B)显示对体重的效果。所示的值为每个个体测定的组平均值和标准偏差。
最佳实施方式下面将参考实施例对本发明进行详细描述，但本发明不应被解释为限制于此。本文引用的所有对比文件都包含在说明书中。
实施例1小鼠脂肪细胞的原代培养[方法]3周大雄性ICR小鼠或4-5周大雄性C57BL/6小鼠(均来自CharlesRiver)用乙醚麻醉，并通过从心脏收集全血而处死。随后，在无菌条件下逐个摘出腹股沟皮下脂肪、或者附睾周脂肪、或者肠系膜脂肪组织。摘出的脂肪组织用PBS洗涤，并随后用剪子或手术刀切碎。切碎的组织在包含1mg/mL的胶原酶(S1级分/Nitta凝胶)的通常培养基(DMEM-高葡萄糖/SIGMA，10％FCS)中在37℃震荡20-60分钟以进行消化，并随后通过离心(300g，5分钟)分成沉淀和漂浮层。
漂浮层再离心1或2次来通过稀释去除胶原酶，随后加入充满培养基的T-25烧瓶(IWAKI)中。除泡，并在CO2孵箱中在37℃、5％CO2中培养，使得其常规培养面在上方(天井培养)。培养10-14天后，附着于天花板表面的细胞通过胰蛋白酶处理收集，并转移到正常培养系统。随后以1∶3到1∶10的比例进行传代培养。
为诱导分化，将在6孔板中培养到满底的细胞培养基转移到诱导培养基(加入0.5mM IBMX、0.25μM地塞米松、和10μg/mL胰岛素的正常培养基)。刺激持续48小时。随后，细胞在成熟培养基(加入10μg/mL胰岛素的通常培养基)中分化。成熟培养基每3天换一次。
油红O染色溶液通过在使用时将保存液(将0.3g油红O混合于100mL异丙醇(99％)中制备)与蒸馏水以3∶2的比例在用时混合制备。细胞用PBS洗涤，并随后用10％中性福尔马林溶液(WAKO)固定。再次用PBS洗涤后，细胞用油红O染色溶液在室温染色10分钟。细胞再次用PBS洗涤，并随后通过显微镜检查。
图1是从3周大ICR小鼠皮下脂肪分离的原代培养脂肪细胞的一套显微照片。天花板培养14天后，在天花板侧培养表面观察到携带脂滴的脂肪细胞的粘附(A)。当这些细胞转移到通常培养系统中时，它们显示成纤维细胞样生长，如(B)所示。然而，当通过IBMX、地塞米松、和胰岛素进行诱导时，这些细胞再次分化成带有脂滴的成熟脂肪细胞(C)。储存的脂肪用油红O染色进行染色呈红色(D)。通过这种方法分离的细胞被显示是包含分化能力的原代培养脂肪细胞。
实施例2热稳定分泌型碱性磷酸酶(AP)基因瞬时导入原代培养脂肪细胞中，以及将转染后的脂肪细胞植入小鼠作为基因表达的模型系统，AP基因，更特别地为SEAP基因(Clontech)或PLAP基因(Goto，M.et al等.Mol Pharmacol.Vol.49860-873(1996))被导入原代培养脂肪细胞，并检测AP活性改变。(两种AP基因产物都是热稳定的并可通过热处理很容易地与内源性碱性磷酸酶区分。)[方法](1)SEAP基因瞬时转染的原代培养脂肪细胞的产生AP表达质粒(pcDNA3.1-SEAPmh)通过将SEAP序列插入在用于在哺乳动物细胞中表达的载体pcDNA3.1Myc-HisA(Invitrogen)的HindIII-XbaI位点构建，SEAP序列通过用限制性酶HindIII-XbaI二重消化pSEAP2-碱性(basic)载体(Clontech)获得。
每次对10cm皿进行基因导入时，混合500μL无FCS的DMEM培养基和15μL Fugene 6试剂(Roche)，并随后加入5μg pcDNA3.1-SEAPmh。该混合物在室温静置15分钟。将该混合物加入在10cm皿中培养到70-80％满底的原代培养细胞(来自ICR皮下脂肪)中。随后将其在CO2孵箱中培养24小时。
(2)将经碱性磷酸酶基因导入的原代培养脂肪细胞植入小鼠基因导入的细胞通过胰蛋白酶处理收集，并通过离心用PBS洗涤2次。随后以1×107细胞/mL将细胞悬浮于PBS中。动物(ICR裸小鼠，手术时为5周大小)通过腹腔内投药50mg/kg的戊巴比妥钠(Nembutal；DainipponPharmaceutical)麻醉。用稀释的Hibitane溶液(SumitomoPharmaceuticals)消毒手术区域后，在右后肢根部附近的皮肤作3mm到5mm左右的切口，并暴露腹股沟皮下脂肪。将制备的细胞悬液0.55mL(5.5×106细胞/只)充满1-mL注射器中，并利用22G的注射针注入皮下脂肪中。作为对照，将PBS注入相同部位。为比较该方法和蛋白补充法，1μg纯化的AP(Roche)在无菌条件下溶于PBS，并以相似的方式注入。缝合切开的皮肤，并用手术用Isodine(Meiji Seika)消毒手术部位。
移植前(第0天)和移植后随时间推移用肝素包被的毛细管(Dramond)从眶后静脉丛采血。通过在2000g离心15分钟从全血中获得血浆。该血浆中的AP活性通过使用检测试剂盒(SEAP报道基因检测试剂盒，Roche)按所附说明进行测定。
图2显示通过将原代培养细胞植入小鼠获得的血浆AP活性，所述细胞用碱性磷酸酶(AP)表达质粒pcDNA3.1-SEAPmh瞬时转染。为进行比较，通过注射将1μg纯化AP蛋白(Roche)投药给小鼠。投药7天后，这些小鼠中的血AP活性降低到对照水平。另一方面，接受保持瞬时导入基因的细胞移植物的小鼠中的血AP活性被证实在移植后第4天到达峰值，并且表达持续期为14天。植入携带瞬时导入基因的细胞的体内表达持续时间较短，并发现血中的浓度差异很大，虽然这比蛋白注入保持的时间要长。
实施例3利用病毒载体产生稳定表达AP的脂肪细胞[方法](1)构建AP-和对照GFP-表达载体使用HindIII和BglII从pTK-PLAP切割PLAP基因，如文献所述(Goto，M.et al.Mol.Pharmacol.vol.49，860-873(1996))。SEAP基因通过用HindIII/PmeI双重消化pcDNA3.1-SEAPmh获得。使用NotI-NcoI从pEGFP-N2切下GFP基因。
用于病毒载体生产的质粒pBabeCLXI2G，是以pBabePuro(Morgenstern，J.P.et al.，Nucleic Acids Res.vol.18，3587-3596(1990))为基础，通过使用SalI-ClaI切除其SV40启动子和新霉素抗性基因，并用Klenow片段使那些末端平端化，然后用通过HincII-HincII从pIRES2-EGFP切出的脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体再进入位点(IRES)和绿色荧光蛋白(GFP)置换；随后用pCLXSN(IMGENEX)的相应序列(SspI-BamHI)取代从长末端重复序列(LTR)到异源基因插入位点(多克隆位点)的部分(SspI-BamHI)。此外，还使用了pBabeCLXIP，其中pBabeCLXI2G的IRES-GFP部分被IRES-嘌呤霉素抗性基因取代。
上述PLAP、SEAP、和GFP的DNA片段中的每一个用Klenow片段平端化，随后插入Hpa I切割的pBabeCLXIP或pBabeCLXI2G载体中，分别产生pBabeCL(PLAP)IP、pBabeCL(SEAPmh)I2G和pBabeCL(GFP)IP。
(2)病毒载体的生产每次对10cm皿的基因导入如下进行将30μL的质粒转染试剂TransIT(MIRUS)混合入500μL的无FCS DMEM培养基，然后在室温放置5分钟(混合的DMEM/TransIT溶液)。在单独的管子中，将3.3μg编码VSV-G的载体(pCALG，根据Arai，T.et al.，J.Virol.，1998，72，pp1115-21修饰)，3.3μg编码Gag-Pol的载体(pCLAmpho/RetroMax系统(IMGENEX))、和3.3μg包含包装信号和导入基因的载体(pBabeCL(PLAP)IP，pBabeCL(SEAPmh)I2G，或pBabeCL(GFP)IP)混合，总共9.9μg(质粒溶液)。将质粒溶液加入混合的DMEM/TransIT溶液，完全混匀，并在室温放置15分钟。然后将上述混合物加入293-EBNA细胞(Invitrogen)，从前一天的2×106细胞/10cm进行过夜培养。
加入后8小时交换培养基，并且再培养两天后收集培养物上清。收集的培养物上清经离心(300g，5分钟)或通过0.45μm的注射过滤器(Millipore)过滤去除污染物，并将该上清用作病毒溶液(分别为MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP、MLV(VSV)/pBabeCL(SEAPmh)I2G、和MLV(VSV)/pBabeCL(GFP)IP)。一些病毒溶液通过超速离心(19,500rpm，100分钟)浓缩后使用。
(3)原代培养脂肪细胞的基因导入和培养用于基因导入的脂肪细胞(来自ICR小鼠的皮下脂肪、附睾周围的脂肪、以及肠系膜脂肪、以及C57BL/6小鼠的皮下脂肪)在6孔或96孔板中制备，使得它们在转染前一天达到50-80％满底。弃去培养基，并将等量的4μg/mL的聚凝胺(Polybrene)(SIGMA)溶液和病毒溶液加入细胞来转导病毒载体。转导后8小时，将培养基换成通常培养基，并进一步进行培养和传代。部分细胞的AP活性通过在转染后第4天收集24小时培养物上清来测定(图3)。
传代培养在10cm皿的范围内根据实施例1的方法进行。细胞培养4-7天，并在达满底时更换培养基。17小时后在培养上清中测定AP活性。这些细胞连续传代，并通过适当地进行类似的操作，检测表达的保持(图5和6)。不是每次进行传代都测定AP活性。
在6孔板中，根据实施例1的方法诱导分化。然而，用诱导培养基培养3天以进行处理，其后每三天用成熟培养基替换所述诱导培养基。培养物上清的AP活性利用每三天获得的培养物上清测定，且图中的x轴显示收集上清的那一天。对于GFP-转染的细胞，在适宜的GFP光下进行显微照相(图4和6)。非分化诱导条件指在通常培养基而不是诱导培养基或成熟培养基的条件下进行培养。
图3是利用逆转录病毒时，每种组织来源的细胞的基因导入效率的比较。当对分离自存在于ICR小鼠的腹股沟皮下组织、附睾周围区域、和肠系膜的每一脂肪组织的原代培养脂肪细胞进行基因导入时，在所有细胞的培养物上清中都确定了AP活性。这表明不管细胞来源的位置如何，逆转录病毒载体都可以导入基因。
图4是一套显微照片，显示用表达GFP的逆转录病毒载体转导的细胞的分化诱导像。分化诱导在基因导入后13天开始，并在3周后照相。在含脂滴的细胞中观察到GFP荧光，这表明病毒载体可将基因导入具有分化能力的前脂肪细胞，且由载体带来的基因导入不影响其分化能力。
图5显示在用AP表达病毒载体转染的原代培养脂肪细胞的传代培养中表达的持续性。细胞在10cm皿中达满底后17小时，在培养物上清中测定AP活性。检测了来自C57BL/6小鼠皮下脂肪的原代培养脂肪细胞，在87天中都证实到AP的持续产生(A)，检测了来自ICR小鼠皮下脂肪的原代培养脂肪细胞，在63天中都证实到AP的持续产生(B)。这些结果表明，将病毒载体转导入原代培养脂肪细胞可产生稳定表达细胞，所述细胞在分裂后产生的子细胞中保持异源基因。
图6是一套照片和一张图，显示分化诱导的基因导入后脂肪细胞中表达的改变。来自ICR皮下脂肪的GFP表达脂肪细胞在普通培养条件(A)、和分化诱导条件(B)下均显示GFP强表达。此外，来自ICR皮下脂肪的AP表达脂肪细胞在非分化诱导条件(非分化)和分化诱导条件(分化)(C)下，均显示AP持续表达。发现不仅是在图5描述的增殖条件下，而且在非分化诱导条件或更特别地在非增殖条件或成熟条件下，通过病毒载体进行基因导入的原代培养脂肪细胞在任何阶段都稳定表达基因。
通过使用质粒载体生产稳定表达胰岛素的脂肪细胞基因导入的方法包括使用质粒载体的方法。
(1)人胰岛素基因的分离和修饰利用表1(胰岛素Fw和Rv)所示的引物，对人胰腺来源的cDNA文库(Stratagene)进行PCR。获得人胰岛素基因片段。测定该获得的354-bp片段的核苷酸序列，并将所述片段亚克隆到pCR2.1TOPO载体(Invitrogen)中作为天然胰岛素。
表1用于PCR的引物序列引物 核苷酸序列(5’-)胰岛素FwN CATAAGCTTACCATGGCCCTGTGGATGCGC(SEQ ID NO1)胰岛素Rv CATTCTAGACTAGTTGCAGTAGTTCTCCAG(SEQ ID NO2)位点1 CTTCTACACACCCAGGACCAAGCGGGAGGCAGAGGAC(SEQ ID NO3)位点2 CCCTGGAGGGATCCCGGCAGAAGCGTGG(SEQ ID NO4)B10CACCTGTGCGGATCCGACCTGGTGGAAGC(SEQ ID NO5)sPL-GLP-1FTTCCACCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCCTGAGGCTACAGCTCT-w -CCCTGGGCCATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTG(SEQ ID NO6)sPL-GLP-1RAATTATCCTCGGCCTTTCACCAGCCAAGCAATGAACTCCTTGGCAGCTTG-v -GCCTTCCAAATAAGAACTTACATCACTGGTAAAGGTCCCTTCAGC(SEQ IDNO7)GLP-5’TTCCACCATGCTGCTGCTGC(SEQ ID NO8)GLP-3’AATTATCCTCGGCCTTTCACCAG(SEQ ID NO9)
(粗体字母表示Fw中的起始密码子，和Rv中的终止密码子的反义序列。下划线表示突变部分)随后，为在脂肪细胞中表达成熟胰岛素，根据文献(JBC，1994，269(8)，6241-)进行遗传修饰。更特别地，单独合成两个方向的引物，使其在位于人胰岛素B链和C肽之间(位点1)、同一C肽和A链之间(位点2)、以及B链的第十个组氨酸残基上(B10)的每一连接位点上包含突变(表1)。突变体通过利用Quikchange诱变试剂盒(Stratagene)获得。在位点1和位点2进行该反应产生了s1s2突变体。在位点1、位点2和B10进行该反应产生s1s2B10突变体胰岛素。证实获得的修饰人胰岛素基因的核苷酸序列后，基因被掺入pcDNA3.1载体，并随后用于基因导入。
(2)原代培养脂肪细胞的基因导入将500μL的无FCS DMEM培养基和15μL的Fugene 6试剂(Roche)混合后，加入5μg的转染质粒，并随后将其于室温放置15分钟。将该混合溶液加入原代培养脂肪细胞(来自C57BL/6小鼠附睾周围的脂肪组织)，所述脂肪细胞已在10cm的皿中培养到70-80％满底。将其在CO2孵箱中培养24小时。基因导入4天后，所述细胞在T225烧瓶中进行传代培养，并培养过夜。随后将培养基交换为包含0.2mgU/mL的G418(SIGMA)的培养基，并继续培养3周，于是选择基因导入的细胞。获得的G418抗性细胞铺于10cm皿上，并使用超敏胰岛素EIA试剂盒(Morinaga)测定培养物上清中的胰岛素量。该EIA试剂盒既检测未被加工的胰岛素原，也检测成熟胰岛素。
图7显示通过将质粒转染到原代培养脂肪细胞中生产胰岛素原。将单独掺入了天然人胰岛素基因(天然)和位点1/位点2/B10修饰的形式(s1s2B10)的每种pcDNA3.1Myc-His载体、或空载体(模拟品)转染到来自C57BL/6小鼠附睾周围的脂肪组织的脂肪细胞中。在通过G418选择获得的抗性细胞的培养物上清中检测到人胰岛素原。这显示了使用质粒载体也有可能将基因稳定导入原代培养脂肪细胞。
利用腺伴随病毒生产稳定表达AP的脂肪细胞基因导入的方法包括利用腺伴随病毒(AAV)的方法。
利用无AAV辅助病毒(AAV Helper-Free)系统(Stratagene)进行该研究。实施例2的PLAP片段(利用HindIII和BglII切割的片段)被插入pAAV-MCS载体的相同限制性酶位点，产生pAAV-PLAP。
AAV载体生产如下进行将1.75mL的OPTI-MEM(Invitrogen)与220μL的质粒转染试剂Fugene混合，随后将分别为25μg的pAAV-PLAP、pAAV-RC和pHelper加入其中混合，并将所述混合物室温下放置15分钟(Fugene/质粒溶液)。同时，制备在15cm的皿中生长到60-70％满底的293-EBNA细胞。将培养物溶液换为无FCS DMEM，并将Fugene/质粒溶液均匀滴入，并培养该混合物2-3小时。随后加入FCS至终浓度10％，并将其再培养两天。通过胰蛋白酶处理和离心以收集细胞，并重悬于50mM Tris-HCl和150mMNaCl溶液中，使得终体积为3mL。通过对该悬液进行3个循环的干冰-乙醇/37℃冻融来破坏细胞。此外，利用Benzonase(SIGMA)降解宿主基因组DNA后，通过以9,000rpm离心30分钟来生产病毒溶液，然后过滤上清。
基因导入前一天，将原代培养脂肪细胞(来自C57BL/6小鼠皮下脂肪)以1×104细胞/孔铺于12孔板，并进行培养。随后在含有40mM的羟基脲和1mM的丁酸(均来自SIGMA)的培养基中处理6小时。去除这一培养基后，加入0.5mL/孔的病毒溶液，所述病毒溶液用无FCS DMEM稀释到1/100。培养1小时后，加入含FCS的培养基使其终浓度为10％，并将其培养过夜。随后，进行正常培养基交换，并在第24天进行传代培养。
在导入的第1天、第7天和第25天交换培养基，并将每次交换后的两天后收集的培养上清用于AP测定。10μL的上清，该上清如必要可稀释，在65℃加温20分钟，然后混合入50μL的测定缓冲液(16mM NaHCO3、12mMNa2CO3、0.8mM MgSO4)、和50μL的发光染色试剂(CDP-Star Ready to Usewith Sapphire II，TROPIX)，在暗处反应30分钟，并随后用发光计测量。
图8显示用AP表达AAV转染的原代培养脂肪细胞(来自C57BL/6小鼠皮下脂肪)中AP的稳定表达。在整个检验期间检测培养物上清中的AP活性。这显示对原代培养脂肪细胞的稳定基因导入可通过使用AAV载体实现。
构建表达人胰岛素的逆转录病毒载体，并将其转导入脂肪细胞[方法]将实施例4中构建的修饰人胰岛素基因(s1s2B10Ins)根据实施例3的方法插入pBabeCLXI2G载体(pBabeCL(s1s2B10Ins)I2G)。该质粒和VSV-G-编码载体(pVPack-VSV-G/Stratagene)以及Gag-Pol-编码载体(从pVPack-gp/Stratagene修饰而来)一起，根据实施例3的方法导入293-EBNA细胞中，从而产生出修饰的表达胰岛素的逆转录病毒载体(MLV(VSV)/pBabeCL(s1s2B10Ins)I2G)。从22只10cm皿收集293-EBNA细胞的培养物上清(大约200mL)，通过离心/过滤处理去除不溶性物质，并随后通过超速离心(19,500rpm，100分钟)产生浓缩的病毒溶液。将该溶液导入原代培养脂肪细胞(来自C57BL/6皮下脂肪)，所述细胞在前一天已铺于6孔板上。
导入基因的细胞重新铺于6孔板上，并根据实施例1的方法诱导分化。从诱导前3天到诱导开始的3天内(诱导前)，以及诱导第14天到第17天的三天内(诱导后)，分别收集培养上清。通过与实施例4中相同的方法测定胰岛素的量。此外，为确定加工在所需的位点出现，并且产生了成熟胰岛素，利用仅识别成熟胰岛素的胰岛素EIA试剂盒(IBL)进行测量。同时接受分化诱导的非基因导入细胞的培养物上清用作对照。
图9显示s1s2B10胰岛素表达逆转录病毒载体转导的原代培养脂肪细胞，在分化诱导时的胰岛素表达。(A)显示利用森永(Morinaga)制造的EIA所得结果，且(B)显示用IBL制造的EIA所得的结果。这些结果显示，在分化诱导前后，胰岛素都稳定分泌，并且突变胰岛素基因的导入可能导致从脂肪细胞产生成熟胰岛素。
表达人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的逆转录病毒载体的构建，以及将其转导入脂肪细胞GLP-1是在食物摄入过程中从小肠L细胞产生的肽，并具有通过作用在胰腺β细胞上而刺激胰岛素分泌的作用。GLP-1已知也具有各种其它抗糖尿病和抗肥胖作用，例如对胰腺β细胞的再生作用、抑制食欲的作用、和对胃排空的抑制作用(Meier，J.J.et al.Eur.J.Pharmacol.2002，12；440(2-3)269-79；Drucker，D.J.Gastroenterology 2002；122(2)531-544)。包含GLP-1氨基酸序列位置7到37(或者在酰胺形式中直到位置36)的肽，是通过对前胰高血糖素原基因产生的多肽进行组织特异性加工形成的，并已知包含主要药理学活性(Drucker，D.J.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1987年5月；84(10)3434-3438；Kreymann，B.etal.Lancet.1987，5；2(8571)1300-1304；Mojsov，S.et al.J.Clin.Invest.1987 Feb；79(2)616-619)。为从脂肪细胞产生该因子进行以下检测。
设计了总共具有156个碱基对的核苷酸序列，其包含一种序列(SEQ IDNO10显示了编码序列)，在该序列中人GLP-1(7-37)和终止密码子与实施例3中所用的PLAP基因的信号肽(17个氨基酸)相连。合成核苷酸使得在中心包含22聚物的重叠序列(表1中的sPL-GLP-1Fw和sPL-GLP-1Rv)。对其进行退火，并利用Pfu聚合酶(Stratagene)形成双链。随后利用5’末端和3’末端引物(表1中的GLP-5’和GLP-3’)通过PCR扩增靶片段。该片段被亚克隆入pCR2.1载体中，并随后利用限制性酶切割，然后如实施例3中那样插入pBabeCLXI2G载体(pBabeCL(sPL-GLP1)I2G)。利用与实施例6的方法类似的方法，将所得载体导入293-EBNA细胞，产生GLP-1表达逆转录病毒载体(MLV(VSV)/pBabeCL(sPL-GLP-1)I2G)。收集来自9只10cm皿的大约90mL的293-EBNA细胞培养物上清。不溶性物质通过离心/过滤处理去除，并随后对上清进行超速离心(19,500rpm，100分钟)以产生浓缩的病毒溶液。将该病毒溶液转导入原代培养脂肪细胞(来自C57BL/6皮下脂肪)，所述细胞在前一天被铺于6孔板上。转染后的脂肪细胞再次铺于12孔板上，并根据实施例1的方法进行分化诱导。“非诱导的”指在通常培养基而不是诱导培养基或成熟培养基中继续培养的条件。7天后，将培养基换为无FCSDMEM培养基，所述培养基包含1mM缬氨酸-吡咯烷(GLP-1降解酶抑制物；在Eisai合成)。18小时后收集培养物上清，并利用ELISA(LINCO)测定活性GLP-1(7-37)的量。
图10显示用GLP-1(7-37)表达逆转录病毒载体转染的原代培养脂肪细胞中的表达水平。活性形式GLP-1(7-37)的表达在非分化诱导的和分化诱导的脂肪细胞中均可观察到。这表明即使因子作为前原型产生并随后通过加工切出，该方法允许从脂肪细胞仅产生该因子。
将稳定表达AP的细胞植入小鼠(试验1)[方法]培养通过实施例3的方法产生的AP表达脂肪细胞(由MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP转导；来自C57BL/6皮下脂肪)到满底后，通过胰蛋白酶处理收集细胞，用PBS洗涤，并以5×106细胞/mL重悬于冰冷的Matrigel(Becton Dickinson)中。通过将该悬液以0.2mL/每只小鼠(1×106细胞/每只)的剂量注入C57BL/6小鼠(手术时为8周大；Charles River)的背部皮下区(Sc)进行移植(无分化诱导)。另一方面，将同样的细胞培养到满底，并随后在实施例1的诱导培养基中培养3天，然后通过类似的方法进行移植(分化诱导)。通过实施例2中指示的方法随时间的推移收集血液，并测定血浆中的AP活性。
图11显示植入了AP表达原代培养脂肪细胞的小鼠中的血浆AP活性的变化。与接受没有被诱导的细胞移植物的个体相比，接受移植前经过分化诱导刺激3天的细胞移植物的个体(“具有分化诱导”)显示连续表达的波动较小。然而，两种移植方法在50天左右的整个检验期间均显示持续的表达。这表明细胞的移植后存活率可通过提供分化诱导刺激而改善。
将稳定表达AP的细胞植入小鼠(试验2)[方法](1)移植实施例3中生产的AP表达脂肪细胞(用MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP转导；来自ICR皮下脂肪)培养到满底。细胞通过胰蛋白酶处理收集，用PBS洗涤，并以5×106细胞/mL悬浮于加入了1μg/mL的bFGF(Genzyme Techne)的冰冷Matrigel(Becton Dickinson)中。通过将该细胞悬液以0.2mL每只小鼠(1×106细胞/只)的剂量注入I CR裸小鼠(操作时为6周大小，Charles River)的各个位点(背部皮下区(Sc)、腹股沟皮下脂肪(脂肪)、和腹腔内区(腹腔内))进行移植。作为对照，GFP表达脂肪细胞类似地处理，并移植入皮下组织。
一些AP表达细胞用实施例1的诱导培养基培养3天，随后被收集并以相同的方式植入(Dif)。使用诱导培养基后，这些细胞中的一些在成熟培养基中培养4天，并随后被收集并以相同的方式植入(Mat)。
此外，一些AP表达细胞在用于移植的相同条件(1×106/0.2mL加入bFGF的Matrigel)下，铺于8孔Labteck小室(chamber)(Nunc)，并在37℃加热以固化细胞。通过将该固化的凝胶插入小鼠皮下区进行移植。这里，固化后在通常培养基中培养的细胞称为预固定的(pre-fixed)(pf)/gr，而在分化诱导培养基中培养的细胞称为pf/dif。培养7天后，进行移植。
根据实施例2的方法，随时间推移测定移植前(第0天)和移植后的血浆AP活性。
(2)摘出分化诱导后进行移植的组(Dif/Sc)中，分别在移植后5周从个体A、并在移植后43周从个体B和Matrigel一起摘出植入的细胞团。移植后第5周对对照样品进行摘出。对每个个体腹腔内给药50mg/kg的戊巴比妥用作麻醉。然后切开它们的皮肤，并肉眼证实植入的Matrigel切片被摘出。缝合手术部位，并用Isodine(Meiji)消毒。随后以相同的方式饲养动物，并随时间推移收集血液。
图12(A)显示了当AP表达原代培养脂肪细胞在分化刺激的存在下利用添加碱性bFGF的Matrigel移植时(Dif/Sc组)，50天中血浆AP活性变化的检测结果。49天中血AP活性的变化稳定在大约5倍的范围内。这表明移植时加入bFGF可进一步改善移植后的植入率。(B)显示由于在同一时期内摘出植入的Matrigel(个体A)，血浆AP活性的消失。与PLAP转导组的平均值相比，摘出后个体的AP活性明显降低。这表明血AP来自植入的细胞，且植入物的摘出可迅速消除基因表达。此时，也对部分对照组进行摘出，所述对照组植入了GFP转染的细胞。在摘出的Matrigel中发现了GFP阳性细胞，并且它们中的许多显示与图6(B)中所示类似的空泡像(C)。这表明通过这种方法植入的原代培养脂肪细胞可在体内作为成熟脂肪组织植入。
图13显示对图12(A)的移植小鼠、和通过各种其它方法接受植入物的小鼠的血AP活性进行长期检测的结果。在植入PLAP转染的细胞的组中，对于所有移植位点和移植方法均证实了血AP活性明显升高。血AP活性保持较长的一段时间，并且特别地，在Dif/Sc组(图12(A)所述的组)试验期间一年的时间内，观察到稳定的AP表达。对于其它移植方法，也证实了持续的AP生产，所有都是在检验期间(对腹腔内组注射为316天，对于脂肪组为54天，对于Sc组为225天，对于Mat/Sc组为317天，且对于两个预固定(pre-fix)组为314天)。移植后一周内观察到的活性峰值以腹腔内注射组为最高。最高值的顺序为Sc>fat>Dif/Sc≅pf-dif>pf-gr≅Mat/Sc.]]>移植后变化范围可观察为13周后的活性和峰值活性之间的比值，该比值可在所有组中进行比较。在两个预固定(pre-fix)组中，变化最小，大约3倍；在腹腔内注射、Dif/Sc、和Mat/Sc组中大约为5倍；在Sc和脂肪组中大约为10倍。每一移植方法的移植后即刻峰值、以及移植后的变化范围各不相同。可根据所用根据基因产物的性质、病理学特征和技术的简单性，利用这些方法中任何一种。这表明稳定回体导入基因的原代培养脂肪细胞的移植，可通过各种方法进行，并且移植后长期稳定体内基因表达是可能的。
图14显示移植后期进行摘出实验的结果，该实验与图12(B)中描述的相似。不仅在移植早期接受摘出实验的个体(个体A)中，而且在移植晚期接受摘出实验的个体(个体B)中，都肯定了摘出后血AP活性迅速消失。这显示通过这种方法植入的脂肪细胞在移植后长期定位于植入位点，并且在适当的时候摘出所述脂肪细胞可消除基因表达，而与时间无关。
将稳定表达AP的细胞移植入小鼠(试验3)以下检验被用来证实对移植细胞数的“剂量”依赖性[方法]实施例3中产生的AP表达脂肪细胞(用MLV(VSV)/pBabeCL(PLAP)IP转染；来自ICR皮下脂肪)培养到满底。细胞在实施例1所指示的诱导培养基中培养3天，并随后通过胰蛋白酶处理收集。用PBS洗涤后，将细胞以5×106。细胞/mL悬于Matrigel中。利用Matrigel对AP细胞悬液进行5倍逐级稀释，并分别制备1×106细胞/mL和2×105细胞/mL的溶液。将bFGF以1μg/mL的终浓度加入这些溶液中，并随后将其以每只小鼠0.2mL的剂量(高剂量1×106细胞/只；中等剂量2×105细胞/只；低剂量4×104细胞/只)植入ICR裸小鼠的背部皮下区。作为对照，类似地处理GFP表达脂肪细胞，并在和高剂量条件(1×106细胞/只)相同的条件下将其移植到皮下组织中。
图15显示植入AP表达脂肪细胞时，血AP活性对植入细胞数目的依赖性。改变植入细胞数目时观察到不受持续时间影响的剂量依赖的血AP活性。更特别地，中等或低剂量组在移植早期不显示在高剂量组可观察到的峰值，并且波动范围较窄。这表明利用植入细胞数，可轻易调整体内表达水平，并且通过调整最佳细胞数目，可稳定移植后血液浓度(表达水平)。
表达胰岛素的脂肪细胞的植入对糖尿病模型小鼠的低血糖效应[方法]通过将170mg/kg的链脲佐菌素(streptozotocin)(STZ，SIGMA)以10mL/kg静脉内给药8周大的雄性C57BL/6小鼠产生糖尿病小鼠。给药STZ后1周和2周后，分别测定空腹血糖(FBG)水平，并且FBG等于或大于300mg/dl的个体被认定患有糖尿病。血糖水平通过在收集全血后立即进行高氯酸盐处理、然后利用葡萄糖测试II(Glucose Test-II)(WAKO)测定。
实施例6中生产的MLV(VSV)/pBabeCL(s1s2B10Ins)I2G转染的脂肪细胞用实施例10中相同的方法进行分化诱导刺激，并随后以5×106细胞/mL悬于加入了1μg/mL的bFGF的Matrigel中。该悬液以每个位点0.2mL植入每只糖尿病小鼠的背部皮下区，共移植到4个位点(4×106/只)。对于对照组，非基因导入脂肪细胞用同样的方法植入。STZ处理后19天进行移植，并随后随时间推移测定FBG水平。通过与对照组比较进行统计分析(非配对的t检验)。
图16显示将s1s2B10表达胰岛素的脂肪细胞植入STZ诱导的糖尿病小鼠的效果。植入非基因导入细胞作为对照。植入胰岛素表达细胞组的血糖水平从移植第7天开始有下降趋势，且在移植第13天和第21天显示明显的低血糖效应(A)。与对照组相比，植入胰岛素表达细胞组的移植后20天的体重明显更高，并且由于糖尿病造成的体重降低因此得到改善(B)。利用AP进行检验的结果提示，该低血糖效应将长时间持续。因此，从植入的原代培养脂肪细胞产生的异源基因产物被显示对受体的病理修饰有贡献，表明该方法有可能能治疗糖尿病。
工业实用性本发明建立了将异源基因回体导入适合基因治疗的原代培养脂肪细胞的方法，以及建立了稳定保持异源基因的原代培养脂肪细胞。
序列表<110>卫材株式会社(EISAI CO.，LTD.)<120>用于基因治疗的原代培养脂肪细胞<130>E1-A0305Y1P<150>JP 2002-177648<151>2002-06-18<150>JP 2002-237974<151>2002-08-19<160>11<170>PatentIn ver sion 3.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于扩增人胰岛素基因的人工合成寡核苷酸<400>1cataagctta ccatggccct gtggatgcgc 30<210>2<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于扩增人胰岛素基因的人工合成的寡核苷酸<400>2cattctagac tagttgcagt agttctccag 30<210>3<211>37<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于诱变的人工合成寡核苷酸<400>3cttctacaca cccaggacca agcgggaggc agaggac 37<210>4<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于诱变的人工合成寡核苷酸
<400>4ccctggaggg atcccggcag aagcgtgg 28<210>5<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于诱变的人工合成寡核苷酸<400>5cacctgtgcg gatccgacct ggtggaagc 29<210>6<211>83<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于构建编码分泌性人GLP-1的基因的人工合成寡核苷酸<400>6ttccaccatg ctgctgctgc tgctgctgct gggcctgagg ctacagctct ccctgggcca60tgctgaaggg acctttacca gtg83<210>7<211>95<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于构建编码分泌性人GLP-1的基因的人工合成寡核苷酸<400>7aattatcctc ggcctttcac cagccaagca atgaactcct tggcagcttg gccttccaaa60taagaactta catcactggt aaaggtccct tcagc 95<210>8<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>用于PCR的人工合成寡核苷酸<400>8ttccaccatg ctgctgctgc20<210>9<211>23<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>用于PCR的人工合成寡核苷酸<400>9aattatcctc ggcctttcac cag23<210>10<211>144<212>DNA<213>人工的<220>
<223>编码分泌性人GLP-1的基因<220>
<221>CDS<222>(1)..(144)<223>
<400>10atg ctg ctg ctg ctg ctg ctg ctg ggc ctg agg cta cag ctc tcc ctg48Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu Ser Leu1 5 10 15ggc cat gct gaa ggg acc ttt acc agt gat gta agt tct tat ttg gaa96Gly His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu20 25 30ggc caa gct gcc aag gag ttc att gct tgg ctg gtg aaa ggc cga gga144Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly35 40 45<210>11<211>48<212>PRT<213>人工的<220>
<223>分泌性人GLP-1<400>11Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu Ser Leu1 5 10 15Gly His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu20 25 30Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly35 40 4权利要求
1.用于基因治疗的原代培养脂肪细胞，其中所述脂肪细胞稳定保持编码分泌到细胞外的蛋白的异源基因。
2.权利要求1的脂肪细胞，其中所述基因通过逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体导入所述细胞。
3.权利要求1的脂肪细胞，其具有在体内明显表达所述蛋白至少20天的能力。
4.权利要求1的脂肪细胞，其用来将所述蛋白释放到血流中。
5.权利要求1的方法，其中所述蛋白是胰岛素或胰高血糖素样肽1。
6.生产用于基因治疗的脂肪细胞的方法，其中所述方法包含以下步骤(1)对脂肪细胞进行原代培养；和(2)导入，并随后稳定保持编码分泌到细胞外的蛋白的异源基因。
7.权利要求6的方法，其中所述异源基因通过逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体导入。
8.用于基因治疗的脂肪细胞，其通过权利要求6或7的方法生产。
9.用于基因治疗的移植组合物，其中所述组合物包含原代培养脂肪细胞和药学上可接受的载体，所述原代培养脂肪细胞稳定保持编码分泌到细胞外的蛋白的异源基因。
10.权利要求9的移植组合物，其进一步包含细胞外基质成分。
11.权利要求9的移植组合物，其进一步包含血管生成因子。
12.基因治疗方法，其包含将原代培养脂肪细胞投药给身体的步骤，所述原代培养脂肪细胞稳定保持编码分泌到细胞外的所需治疗性蛋白的异源基因。
13.将蛋白释放到血流中的方法，其中所述方法包含将原代培养脂肪细胞投药给身体的步骤，所述原代培养脂肪细胞稳定保持编码分泌到细胞外的蛋白的异源基因。
14.权利要求13的方法，其是将所述蛋白释放到血流中20天或20天以上的方法。
15.降低血糖的方法，其中所述方法包含将原代培养脂肪细胞投药给身体的步骤，所述原代培养脂肪细胞稳定保持编码胰岛素或胰高血糖素样肽1(GLP-1)的基因。
16.一种动物，其身体移植了原代培养脂肪细胞，所述原代培养脂肪细胞稳定保持编码分泌到细胞外的蛋白的异源基因。
全文摘要
本发明涉及用于基因治疗的原代培养脂肪细胞，其中脂肪细胞稳定保持编码分泌到细胞外的蛋白的异源基因。本发明提供适合基因治疗的细胞，其可代替用于传统回体基因治疗的骨髓细胞和肝细胞。本发明建立了将异源基因导入适于回体基因治疗的原代培养脂肪细胞中的方法，所述脂肪细胞可被容易地收集和移植，并可在移植后除去。特别地，本发明建立了使用逆转录病毒的这些方法，本发明也建立了用于基因治疗的原代培养脂肪细胞，其中脂肪细胞稳定保持编码分泌到细胞外的蛋白的异源基因。
文档编号A61K35/12GK1671836SQ0381853
公开日2005年9月21日 申请日期2003年6月18日 优先权日2002年6月18日
发明者伊藤昌史, 斋藤康 申请人:卫材株式会社