专利名称：一种脂肪细胞体外培养方法
技术领域：
本发明涉及一种生物培养技术，具体是一种脂肪细胞体外培养方法。
背景技术：
脂肪组织是机体内最大的能量储库，脂肪代谢是生命最基本的能量代谢方式。现在普遍认为脂肪代谢异常可引发多种疾病，如肥胖、动脉粥样硬化、II型糖尿病、高血压和血脂代谢障碍等。为了更深入地对脂肪代谢紊乱疾病进行研究，研究者发现建立脂肪细胞体外培养模型是一种有效的途径(Armani A, Mammi C, Marzolla V, et al. . Cellular models for understanding adipogenesis, adipose dysfunction, and obesity. J Cell Biochem. 2010，110(3) : 564-72.)。
脂肪细胞体外培养方法目前主要有两种，分别是胶原酶消化法和组织块培养法。 胶原酶消化法首先将脂肪组织剪碎，然后加入一定浓度的胶原酶，37°C消化60-90分钟，期间每隔约10分钟用吸管吹打混匀组织，之后将消化的组织液过200目细胞筛，收集过滤的液体离心洗涤两次，最后加入培养液放培养箱培养，约16-18小时后细胞贴壁生长，3-4天后有约80-90%细胞贴壁。这种方法的优点是细胞贴壁快，生长均匀，然而缺点是操作时步骤繁琐、花费时间较长，因而容易造成培养污染。组织块培养法同样是先将脂肪组织剪碎， 然后用吸管将组织块均匀排放在培养瓶底壁上(组织块间隔约3毫米)，之后翻转培养瓶加入培养液，平放入培养箱，2-3小时后将培养瓶翻转，让培养液浸入组织块继续培养，96-108 小时后有细胞从组织块周围游离出来生长，约10-12天后有80-90%细胞贴壁。这种方法的优点是操作步骤简单、一般不会造成培养污染，但缺点也是显而易见的，一是细胞培养周期较长；二是细胞生长不均匀，组织块周围细胞生长由于过于密集而老化，但这时培养瓶底壁还有部分空间由于距离组织块较远，细胞还未游离过来贴壁生长。发明内容
为了克服以上两种脂肪细胞体外培养方法的缺点，本发明提供了一种脂肪细胞的体外培养方法。该培养方法与胶原酶消化法相比，操作步骤简单，花费时间短，通常不会造成培养污染，而且由于不受胶原酶消化的影响，细胞活性较高，贴壁后生长状态良好；与组织块培养法相比，细胞培养周期大大缩短，而且细胞生长均匀。
本发明的技术方案是一种脂肪细胞的体外培养方法，其特征是，将脂肪组织先匀浆处理成乳糜状，然后用接种环(优选用改进的接种环)将乳糜组织在培养瓶底壁均匀涂片，之后翻转培养瓶加入含牛磺酸的培养液，平放入培养箱，30-40分钟后将培养瓶翻转, 让培养液进入培养瓶底壁的涂片中继续培养，24-36小时后细胞贴壁生长，4-5天后有约 80-90%细胞贴壁。
具体包括以下步骤
( I)脂肪组织的匀浆处理
在无菌超净台内首先将脂肪组织放在平皿中修剪成0. 8-1. 2cm3的块状，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3-5遍，之后把组织块放在干燥的平皿内沾3-5下，让组织块稍微干燥后，放入组织匀浆机的无菌试管内，180-200转/分钟匀浆处理3-5分钟，这时组织块成乳糜状。
(2)脂肪细胞培养
用吸管吸取乳糜组织放在培养瓶底壁，然后用改进的接种环(环圈与手柄之间成 30度角，如图I所示)将组织在培养瓶底壁上均匀涂片(厚度为O. 10-0. 15毫米)，之后将剩余乳糜组织用接种环推到瓶口处，吸管吸出弃掉；然后翻转培养瓶加入含牛磺酸的培养液， 平放入培养箱中，30-40分钟后将培养瓶再次轻轻翻转，让培养液慢慢进入培养瓶底壁的涂片中，并重新放回培养箱继续培养。24-36小时后细胞贴壁生长，4-5天后有约80-90%细胞贴壁。
(3)培养液配制与添加
将50-60份(体积份数)胎牛血清(FBS )、2-3份(体积份数)青链霉素混合液、O.1-0. 2份(质量份数，每450-500毫升的细胞培养液中加入O. I O. 2g的牛磺酸)牛磺酸溶解在450-500份(体积份数)细胞培养液(DMEM/F12)中，经O. 22微米滤膜过滤后分装到灭菌的离心管中，每管40-45毫升，放置4°C保存，两周内用完。细胞培养前O. 5-1小时将培养液放在37 °C水浴锅中预热。
培养瓶中第一次加入培养液的量非常关键，应严格按照表I所不。
表I培养液添加量与培养瓶型号对应表
权利要求
1.一种脂肪细胞的体外培养方法，其特征是，将脂肪组织先匀浆处理成乳糜状，然后用接种环将乳糜组织在培养瓶底壁均匀涂片，之后翻转培养瓶加入含牛磺酸的培养液，平放入培养箱，30-40分钟后将培养瓶翻转，让培养液进入培养瓶底壁的涂片中继续培养。
2.如权利要求I所述的脂肪细胞的体外培养方法，其特征是，(1)脂肪组织的匀浆处理在无菌超净台内首先将脂肪组织放在平皿中修剪成O. 8-1. 2cm3的块状，然后用PBS缓冲液冲洗3-5遍，之后把组织块放在干燥的平皿内沾3-5下，再放入组织匀浆机的无菌试管内180-200转/分钟匀浆处理3-5分钟，使组织块成乳糜状；(2)脂肪细胞培养用吸管吸取乳糜状组织放在培养瓶底壁，然后用接种环将组织在培养瓶底壁上均匀涂片，涂片厚度为O. 10-0. 15毫米，之后将剩余乳糜状组织用接种环推到瓶口处，吸管吸出； 然后翻转培养瓶加入含牛磺酸的培养液，平放入培养箱中，30-40分钟后将培养瓶再次翻转，让培养液慢慢进入培养瓶底壁的涂片中，并重新放回培养箱继续培养。
3.如权利要求I或2所述的脂肪细胞的体外培养方法，其特征是，所述含牛磺酸的培养液为按体积比，将50-60份胎牛血清和2-3份青链霉素混合液溶解在450-500份的细胞培养液DMEM/F12中，同时每450-500ml细胞培养液DMEM/F12中另外加入O. I O. 2g的牛磺酸。
4.如权利要求I或2所述的脂肪细胞的体外培养方法，其特征是，所述接种环的环圈与手柄之间呈30度角。
5.如如权利要求I或2所述的脂肪细胞的体外培养方法，其特征是，所述培养瓶内培养液的添加量为T25型培养瓶内添加4-5ml，T75型培养瓶内添加12_15ml。
全文摘要
本发明公开了一种脂肪细胞体外培养方法。本发明将脂肪组织先匀浆处理成乳糜状，然后用改进的接种环将乳糜组织在培养瓶底壁均匀涂片，之后翻转培养瓶加入含牛磺酸的培养液，平放入培养箱，30-40分钟后将培养瓶翻转，让培养液进入培养瓶底壁的涂片中继续培养，24-36小时后细胞贴壁生长，4-5天后有约80-90%细胞贴壁。本发明培养方法与胶原酶消化法相比，操作步骤简单，花费时间短，通常不会造成培养污染，而且由于不受胶原酶消化的影响，细胞活性较高，贴壁后生长状态良好；与组织块培养法相比，细胞培养周期大大缩短，而且细胞生长均匀。
文档编号C12N5/077GK102936580SQ20121045479
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者谭秀文, 游伟, 成海建, 刘桂芬, 刘晓牧, 万发春, 宋恩亮, 韩红 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所