专利名称：大黄鱼脂肪细胞体外培养方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞培养方法，具体涉及一种大黄鱼脂肪细胞体外培养方法。
背景技术：
我国是世界上产量最大的水产养殖大国，养殖鱼类脂肪的过度蓄积已是当前困扰 养殖业的主要问题之一。大黄鱼\_Pseudosciaena crocea (Richardson)]是我国重要的经 济鱼类，由于过量捕捞，产量急剧下降。1987年我国大黄鱼人工育苗获得成功，并在1994 年开始人工养殖。但养殖大黄鱼体型差，鱼肉口感、营养价值远不及野生大黄鱼(段青源等， 2000)，因此无法满足市场“质”的需求，大量研究表明，脂肪的过度沉积是影响体型、口感的 重要因素之一(缪伏荣等2008 ；徐继林等，2005)。而且养殖过程中因为脂肪大量沉积，脂肪 肝的高发生率严重影响了养殖的经济效益(刘振勇等，2007 ；曾端等，2008)，影响了大黄鱼 养殖的可持续发展。因此如何改善大黄鱼肉质，降低脂肪的过多沉积是当前最具有现实经 济意义的重大课题。要改善脂肪过多沉积的问题，首先要了解鱼的脂肪代谢和脂肪沉积的 机制。脂肪组织的形成是脂肪细胞增殖、分化和凋亡等过程综合作用的结果；当前体脂 肪细胞过度增殖和分化，凋亡程度降低时，脂肪组织就会过度增长，从而造成水产品脂肪过 多沉积，影响水产品的肉质品质。控制体脂沉积的实质就是降低脂肪细胞的数目和减小脂 肪细胞的体积，也就是抑制前体脂肪细胞的增殖与分化，促进细胞凋亡进行；因此研究前体 脂肪细胞的增殖、分化和凋亡及其控制机制，可以为控制体脂沉积提供理论依据。脂肪细胞 体外培养这种方法已经成为研究脂肪沉积机制、脂肪细胞增殖与分化以及分化过程中分子 事件和标志基因表达的有效手段。关于脂肪细胞的培养，历史悠久，1961年，Haimer等首先进行小鼠脂肪细胞离体 培养的实验工作(宋文华等，2006)，20世纪80年代，Hausman首先采用SVF细胞，通过培养， 就激素和生长因子对猪不同阶段的脂肪分化影响进行了研究，直到今天，脂肪细胞的培养 主要集中在小鼠、畜类等哺乳动物上，在鱼中开展的相关工作较少。2003年，Vegusdal等首次在体外成功培养了大西洋鲑的脂肪细胞，随后2006年， Oku等，进行了真鲷(作從狀ffl^/or)脂肪细胞的培养，2007年，刘茜在草鱼中做了脂肪细胞 的培养，但是目前作为我国重要经济海产鱼类一大黄鱼的脂肪培养相关工作尚未见报道。 大西洋鲑属于冷水性动物，其培养条件和温度无法直接应用于大黄鱼，真鲷是采用无血清 培养技术，目前应用于大黄鱼有相当的困难，而草鱼属于淡水性草食鱼类，其生理状态和培 养参数也无法直接利用于大黄鱼。在这种前提下，研究大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，从 而为研究大黄鱼脂肪代谢和脂肪沉积问题提供物质基础和有效手段就显得意义重大。文中所用的参考文献如下
1、Oku H, Tokuda M, et al. Effects of insulin, triiodothyronine and fat soluble vitamins on adipocyte differentiation and LPL gene expression in the stromal-vascular cells of red sea bream, Pagrus major. Comparative Biochemistryand Physiology, 2006, 144:326-33 (Oku，Tokuda 等，胰岛素，T3 及脂溶性维生素对真鲷 脂肪细胞分化及LPL基因表达的影响。比较生理生化，2006，144:326-333).2、Vegusdal A, Sundvold H, et al. An in vitro method for studying the proliferation and differentiation of atlantic salmon preadipocytes. Lipids, 2003，38:289-296. (Vegusda, Sundvold等，一种体外研究大西洋鲑前体脂肪细胞增殖分 化的方法。脂肪，2003，38:289-296.)。3、段青源，钟惠英等.网箱养殖大黄鱼与天然大黄鱼营养成分的比较分析[J]. 浙江海洋学院学报，2000,19 (2) :125-128.4、缪伏荣，刘景等.对不同养殖模式大黄鱼营养成分的比较[J].现代农业科学 2008，15 (9) :72-74。5、刘茜，吉红，等.草鱼脂肪细胞提取与保存的研究[J].水利渔业，2007，27 (2) :7-806、刘振勇，谢友佺等.大黄鱼肝脏病变组织病理学观察[J].海洋水产研究， 2007,28 (5) :7-11。7、宋文华，王贵，等.脂肪细胞培养研究现状[J].动物医学进展，2006，27(4): 46-51。8、徐继林，朱艺峰等.养殖与野生大黄鱼肌肉脂肪酸组成的比较[J].营养学 报，2005, 27(3) :256-258。9、曾端，麦康森等.脂肪肝病变大黄鱼肝脏脂肪酸组成、代谢酶活性及抗氧化能 力的研究[J].中国海洋大学学报，2008，38 (4) :542-546.
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，使用该种方 法能有效地实现大黄鱼脂肪细胞的体外培养。为了解决上述技术问题，本发明提供一种大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，依次包 括以下步骤
1)、取大黄鱼腹腔腹壁的脂肪组织；
2)、将上述脂肪组织经过细胞分散处理，得大黄鱼前体脂肪细胞；
3)、将大黄鱼前体脂肪细胞接入完全培养基中，吹打均勻，制成细胞悬液；所述完全培 养基为含20%胎牛血清培养液；
4)、原代培养将细胞悬液在M ^TC条件下，培养成贴壁生长的前体脂肪细胞。作为本发明的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法的改进待步骤4)所述的原代培养 的细胞达到70 80%汇合时，进行传代接种培养。作为本发明的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法的进一步改进步骤2)的细胞分散 处理包括以下内容
A、将脂肪组织切成小块，用双抗PBS浸泡、冲洗；得冲洗后小块组织；
B、将冲洗后小块组织悬浮于0.洲胶原酶II消化液中，在22 恒温摇床中消化 0. 8 1. 2小时；上述0. 2%胶原酶II消化液为按照0. 2g胶原酶II与100ml的PBS相混 合所得；C、在步骤B所得物中加入与0.2%胶原酶II消化液同体积的完全培养基，以中和消化 液；然后依次通过220 280 μ m尼龙膜和80 120 μ m尼龙膜，收集滤液；
D、将上述滤液离心，弃上清，加入PBS冲洗；得大黄鱼前体脂肪细胞。作为本发明的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法的进一步改进步骤2)的B中每Ig 的冲洗后小块组织悬浮于4 6ml的0.洲胶原酶II消化液中。作为本发明的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法的进一步改进含20%血清培养基配 方为DMEM/F12培养基，20%标准胎牛血清，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素，3. 7g/L NaHCO3, 2mM L-glutamine。作为本发明的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法的进一步改进步骤4)为将细胞悬 液在血细胞计数板上计数，以5X IO4个细胞/cm2的密度接种于事先用鼠尾胶原蛋白包被的 细胞培养瓶中，然后放在细胞培养箱中进行培养，培养条件为25°C，5% (体积浓度)C02。作为本发明的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法的进一步改进传代接种培养为
①、待步骤4)所述的原代培养的细胞达到70 80%汇合时，先用胰蛋白酶消化液 在M ^TC下消化2 3min，然后用与胰蛋白酶消化液同体积的完全培养基终止消化， 1000rmp/min离心5min，得沉淀；将沉淀与完全培养基按照1 :3的体积比进行传代接种培 养；在此培养过程中，每2 3天更换一次完全培养基；
②、待细胞达到70 80%汇合时，重复上述步骤①。与现有技术相比，本发明的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法具有以下明显的优点 1、本发明首次提出中国重要经济鱼类一大黄鱼脂肪细胞体外培养方法。2、本发明根据大黄鱼的生理特征，摸索了最佳的脂肪细胞体外培养条件。3、本发明所述的培养条件和方法，能够帮助初次进行细胞培养的研究人员，比较 顺利的完成大黄鱼脂肪细胞的体外培养。4、本发明所述的培养条件和方法，能够使大黄鱼脂肪细胞顺利传代。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是接种1 11天时大黄鱼前体脂肪细胞形态观察示意图(在40倍的显微镜 下所得)。图2是接种1 11天时大黄鱼前体脂肪细胞生长曲线。图3是Fl代和FlO代分别接种4天后的大黄鱼前体脂肪细胞形态观察示意图(在 40倍的显微镜下所得)。图4是Fl代和FlO代分别接种4天后的大黄鱼前体脂肪细胞生长曲线。
具体实施例方式以下实施例中所用的完全培养基均为含20%胎牛血清培养液；具体配方为DMEM/ F12培养基，20%标准胎牛血清，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素，3. 7g/L NaHCO3, 2mM L-glutamine。其制备方法如下在80mlDMEM/F12培养基中加入20ml的标准胎牛血清、 10000IU的青霉素、10000IU的链霉素、0. 37g的NaHC03、L_谷氨酰胺，L-谷氨酰胺在所述含 20%血清培养液中的浓度为2mM。
实施例1、一种大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，依次进行以下步骤 1)、取大黄鱼腹腔腹壁脂肪组织
取体重为300-500g大黄鱼，先用MS-222麻醉后，切断鳃弓，放血后击头至鱼死；在无菌 条件下，剖开大黄鱼腹腔，取腹壁的脂肪组织。2)、将上述脂肪组织经过细胞分散处理，依次进行以下步骤
A、将脂肪组织切成Imm3左右的小块，用含双抗(100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素)的 PBS缓冲液浸泡、冲洗；得冲洗后小块组织；
B、将冲洗后小块组织悬浮于0.2%胶原酶II消化液中，在25°C恒温摇床中消化1小 时。冲洗后小块组织与0.2%胶原酶II消化液的用量比是lg/5ml。0. 2%胶原酶II消化 液的制作方法如下将0. 2g胶原酶II与IOOml的PBS缓冲液相混合；
C、步骤B的消化结束后，在步骤B所得物中加入与0.2%胶原酶II消化液同体积的完 全培养基，以中和消化液；然后依次通过250 μ m尼龙膜和100 μ m尼龙膜，收集滤液；
D、将上述滤液lOOOrpm/min离心lOmin，弃上清，在所得的沉淀物中加入PBS缓冲液冲 洗2次，得大黄鱼前体脂肪细胞。3)、将大黄鱼前体脂肪细胞接入完全培养基中，吹打均勻，制成细胞悬液，细胞密 度在5X IO5个/ml。4)、原代培养
将细胞悬液在血细胞计数板上计数，以5X104个细胞/cm2的密度接种于细胞瓶中，此 细胞培养瓶需事先用鼠尾胶蛋白包被，以增加细胞的贴壁能力；然后放在细胞培养箱中进 行培养。培养条件为25°C，C02浓度为5% (体积比)。从而培养成贴壁生长的脂肪细胞。实施例2、一种大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，待实施例1的步骤4)所述的原代培 养的细胞达到70 80%汇合时，进行传代接种培养，具体内容为依次进行以下步骤
①、待原代培养的细胞达到70 80%汇合时，先用Iml胰蛋白酶消化液在25°C下消化 2 3min，该胰蛋白酶消化液的制作方法如下将0. 25g胰蛋白酶与IOOml的PBS缓冲液相 混合配制成0.25%胰酶消化液。1瓶(为底面积是25cm2的培养皿)细胞用Iml胰蛋白酶消 化液。然后用与胰蛋白酶消化液同体积的完全培养基终止消化，1000rmp/min离心 5min，得沉淀；将沉淀与完全培养基按照1 :3的体积比进行传代接种培养；在此培养过程 中，每2 3天更换一次完全培养基。②、上述培养直至细胞达到70 80%汇合时，并铺满整个培养皿时，重复上述步骤 ①。传到第十代的脂肪细胞仍能保持原有特性。实验为了证明本发明的方法确实能实现大黄鱼脂肪细胞的体外培养，发明人作 了如下的验证实验
1.大黄鱼前体脂肪细胞形态观察 具体如图1所示。2.大黄鱼前体脂肪细胞生长曲线 具体如图2所示。根据图1和图2，可以得出以下结论1)、应用本发明的方法可以顺利实现大黄鱼脂肪细胞的体外培养，实现大黄鱼脂肪细 胞的体外增殖；
2)、应用本发明的方法可以实现大黄鱼脂肪细胞的体外顺利传代，而且传到第十代的 脂肪细胞仍能保持原有特性。3、将实施例1步骤4)所得的脂肪细胞和后续的接种培养第十代所得脂肪细胞分 别进行了如下鉴定
1)、大黄鱼前体脂肪细胞形态比较观察 如图3所示。结果细胞形态没有显著差异。2)、大黄鱼前体脂肪细胞生长曲线比较 如图4所示。结果细胞生长没有显著差异。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，其特征在于依次包括以下步骤1)、取大黄鱼腹腔腹壁的脂肪组织；2)、将上述脂肪组织经过细胞分散处理，得大黄鱼前体脂肪细胞；3)、将大黄鱼前体脂肪细胞接入完全培养基中，吹打均勻，制成细胞悬液；所述完全培 养基为含20%胎牛血清培养液；4)、原代培养将细胞悬液在M ^TC条件下，培养成贴壁生长的前体脂肪细胞。
2.根据权利要求1所述的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，其特征在于待步骤4)所述 的原代培养的细胞达到70 80%汇合时，进行传代接种培养。
3.根据权利要求1或2所述的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，其特征在于所述步骤 2)的细胞分散处理包括以下内容A、将脂肪组织切成小块，用双抗PBS浸泡、冲洗；得冲洗后小块组织；B、将冲洗后小块组织悬浮于0.洲胶原酶II消化液中，在22 恒温摇床中消化 0. 8 1. 2小时；所述0. 2%胶原酶II消化液为按照0. 2g胶原酶II与IOOml的PBS相混 合所得；C、在步骤B所得物中加入与0.洲胶原酶II消化液同体积的完全培养基，以中和消化 液；然后依次通过220 280 μ m尼龙膜和80 120 μ m尼龙膜，收集滤液；D、将上述滤液离心，弃上清，加入PBS冲洗；得大黄鱼前体脂肪细胞。
4.根据权利要求3所述的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤2)的 B中每Ig的冲洗后小块组织悬浮于4 6ml的0.洲胶原酶II消化液中。
5.根据权利要求4所述的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，其特征在于，所述含20%血清 培养基配方为DMEM/F12培养基，20%标准胎牛血清，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素， 3.7g/L NaHCO3, 2mM L-glutamine。
6.根据权利要求5所述的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，其特征在于，所述步骤4)为 将细胞悬液在血细胞计数板上计数，以5X IO4个细胞/cm2的密度接种于事先用鼠尾胶原蛋 白包被的细胞培养瓶中，然后放在细胞培养箱中进行培养，培养条件为25°C，5%C02。
7.根据权利要求6所述的大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，其特征在于，所述传代接种 培养为①、待步骤4)所述的原代培养的细胞达到70 80%汇合时，先用胰蛋白酶消化液 在M ^TC下消化2 3min，然后用与胰蛋白酶消化液同体积的完全培养基终止消化， 1000rmp/min离心5min，得沉淀；将沉淀与完全培养基按照1 :3的体积比进行传代接种培 养；在此培养过程中，每2 3天更换一次完全培养基；②、待细胞达到70 80%汇合时，重复上述步骤①。
全文摘要
本发明公开了一种大黄鱼脂肪细胞体外培养方法，依次包括以下步骤1)取大黄鱼腹腔腹壁的脂肪组织；2)将上述脂肪组织经过细胞分散处理，得大黄鱼前体脂肪细胞；3)将大黄鱼前体脂肪细胞接入完全培养基中，吹打均匀，制成细胞悬液；完全培养基为含20%胎牛血清培养液；4)原代培养将细胞悬液在24～26℃条件下，培养成贴壁生长的前体脂肪细胞。待步骤4)所述的原代培养的细胞达到70～80%汇合时，可进行传代接种培养。使用本发明的方法能有效地实现大黄鱼脂肪细胞的体外培养。
文档编号C12N5/077GK102140439SQ201110030738
公开日2011年8月3日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者汪以真, 王新霞 申请人:浙江大学