一种大黄鱼肝脏细胞系及其建立方法
【专利摘要】本发明公开了一种大黄鱼肝脏细胞系及其构建方法，该细胞系于2013年10月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为：CCTCCNO:C2013157。本发明的大黄鱼肝脏细胞系可连续传代，能够提供大量的大黄鱼肝脏细胞系，用于病原特性研究、疫苗研制、功能基因研究及育种研究等；其性状优良，为类纤维细胞，多有伪足伸出，成不规则状等。分裂旺盛，传代时间短，易消化，贴壁率好，耐饥饿。本发明的构建方法重复性强、构建的细胞系稳定性好。
【专利说明】一种大黄鱼肝脏细胞系及其建立方法
【技术领域】
[0001]本发明属于鱼类细胞培养【技术领域】，具体涉及一种大黄鱼肝脏细胞系及其建立方法。
【背景技术】
[0002]大黄鱼(Larimichthys crocea),硬骨鱼纲,S卢形目，石首鱼科，黄鱼属。肉质鲜嫩，经济价值较高，市场需求量较大。上世纪70年代以前野生大黄鱼资源较充沛，年平均捕捞量一度达到12万吨的水平。70年代初由于对野生大黄鱼尤其是对其越冬群体的滥捕乱捞，致使野生大黄鱼产量迅速枯竭。80年代以后，随着近海经济开发、环境污染等原因，导致近海的原各大产卵场不再适宜大黄鱼产卵，现野生大黄鱼捕获量极低。1986年大黄鱼人工育苗得以突破，随后得到重视迅猛发展，现阶段市场大黄鱼都是由海水养殖大黄鱼来提供_。然而，现阶段伴随工业化发展，近海养殖环境进一步恶化；大黄鱼病害频发；大黄鱼亲鱼资源枯竭，种质退化等因素极大 的限制了大黄鱼养殖的进一步发展，现阶段大黄鱼养殖产量约8.6万吨，不及70年代以前的捕捞量。因此对大黄鱼病害防治、良种选育、遗传背景的研究极为迫切。
[0003]建立鱼类细胞系能为鱼类病毒分离、抗病毒机制、疫苗研发、转基因技术、嵌合体组织工程等研究提供极大的便捷，且设施人力等资源要求相对活体实验低，重复性好，研究周期短。目前关于大黄鱼细胞系的建立仅有孙爱在2010年报道建立了大黄鱼成鱼的鱼鳍、吻端、脾脏三种细胞系，而未见其他组织细胞系的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种大黄鱼肝脏细胞系。
[0005]本发明的另一目的在于提供上述大黄鱼肝脏细胞系的建立方法。
[0006]本发明的技术方案如下:
[0007]—种大黄鱼肝脏细胞系(即生物材料样品保藏证明中的大黄鱼肝细胞系LYCL)，该细胞系于2013年10月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址:中国.武汉.武汉大学)，保藏登记入册编号为CCTCC N0:C2013157o
[0008]本发明的另一技术方案如下:
[0009]一种上述大黄鱼肝脏细胞系的建立方法，包括如下步骤:
[0010](I)大黄鱼肝脏组织的获取:将7个月大，长9-llcm的大黄鱼鱼苗在含青霉素及链霉素双抗的灭菌海水(青霉素及链霉素双抗购自康宁公司，该双抗的100X浓缩液含10000U/mL青霉素以及10000 μ g/mL链霉素，配制海水时每IOOmL海水加入ImL青霉素及链霉素双抗的100X浓缩液)中暂养1-1.5h，然后滴入占灭菌海水体积0.005-0.015%的丁香酚，直至鱼体翻转，腹部朝上，对刺激物应激行为为止；以灭菌纱布块擦除鱼体表面粘液，以浸有酒精的棉球擦拭鱼体表面后，取出大黄鱼肝脏组织并置于含青霉素及链霉素双抗的D-hanks液(IOOmL D-hanks液加入ImL青霉素及链霉素双抗的100X浓缩液)中；[0011](2)原代培养:将上述大黄鱼肝脏组织切碎至0.7-2.0mm3的小组织块，以D-hanks液漂洗，最后以完全培养液漂洗；漂洗后将上述小组织块接种于细胞培养瓶中，吸除多余培养液，翻转瓶身27°C恒温干贴24h，再加入完全培养液，翻正瓶身以使小组织块浸入培养液中，于27°C恒温培养启动原代培养,每周更换完全培养液一次；
[0012](3)传代培养:原代培养至贴壁细胞增殖至至少50-60%覆盖率时，移除旧培养液，并清洗去除残留的血清和二价金属离子；然后以0.25%胰酶消化法传代悬起细胞，以1:2-10进行传代；以后每隔2-8天传代一次，所述大黄鱼肝脏细胞系建立成功。
[0013]在本发明的一个优选实施方案中，所述完全培养液中包括:DMEM/F12培养液、胎牛血清FBS、β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人FGF-basic、人EGF、人HGF、青霉素及链霉素。
[0014]在本发明的一个优选实施方案中，所述完全培养液为:以DMEM/F12培养液为基础，包括终浓度分别为16.7%胎牛血清FBS、0.5%ο β -巯基乙醇、50 μ g/mL N-乙酰葡糖糖胺、50μg/mL羧甲基纤维素钠、10μg/L人FGF-basic、5μg/L人EGF、lμg/L人HGF、100IU/mL青霉素以及100 μ g/mL链霉素。
[0015]本发明的有益效果是:
[0016]1、本发明的大黄鱼肝脏细胞系可连续传代，迄今已传代40代，能够提供大量的大黄鱼肝脏细胞系，用于病原特性研究、疫苗研制、功能基因研究及育种研究等。
[0017]2、本发明的大黄鱼肝脏细胞系的构建方法重复性强、构建的细胞系稳定性好；
[0018]3、本发明的大黄鱼肝脏细胞系的细胞性状优良。为类纤维细胞，多有伪足伸出，成不规则状等。分裂旺盛，传代时间短，易消化，贴壁率好，耐饥饿；
[0019]4、本发明的构建方法所使用的完全培养液中包括DMEM/F12培养液、胎牛血清FBS、β-巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人FGF- basic、人EGF、人HGF、青霉素及链霉素，DMEM/F12培养液和胎牛血清FBS为细胞生长提供了充足的营养；β -巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人FGF-basic、人EGF和人HGF的加入可以刺激细胞活性、加速细胞分裂增殖，同时为细胞体外培养提供了良好的缓冲环境，能够使细胞在长期培养时维持稳定的PH ;青霉素和链霉素加大了抗菌谱，特别在原代培养时，能有效地抑制细菌生长，防止细胞污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明的大黄鱼肝脏细胞系原代培养第7天的显微镜照片(50X);
[0021]图2为本发明的大黄鱼肝脏细胞系原代培养第15天的显微镜照片(50X);
[0022]图3为本发明的大黄鱼肝脏细胞系原代培养第61天的显微镜照片(50X )；
[0023]图4为本发明的大黄鱼肝脏细胞系传代培养第2代的显微镜照片(50X )；
[0024]图5为本发明的大黄鱼肝脏细胞系传代培养第9代的显微镜照片(50X )；
[0025]图6为本发明的大黄鱼肝脏细胞系传代培养第21代的显微镜照片(50X )；
[0026]图7为本发明的大黄鱼肝脏细胞系传代培养第35代的显微镜照片(50X )；
[0027]图8为本发明的大黄鱼肝脏细胞系在不同传代比例下的增殖曲线；
[0028]图9为本发明的大黄鱼肝脏细胞系冻存后复苏24h后的显微镜照片(50 X )；
[0029]图10为本发明的大黄鱼肝脏细胞系冻存后复苏72h后的显微镜照片(50X );[0030]图11为本发明的大黄鱼肝脏细胞系冻存复苏后再传代的显微镜照片(50X)
[0031]图12为本发明的大黄鱼肝脏细胞系的染色体图(100X);
[0032]图13为本发明的大黄鱼肝脏细胞系的染色体数目分布图；
[0033]图14为本发明的大黄鱼肝脏细胞系饥饿处理30天后的显微镜照片(50X);
[0034]图15为本发明的大黄鱼肝脏细胞系饥饿处理后更换完全培养液36h的显微镜照片(50X);
[0035]图16为本发明的大黄鱼肝脏细胞系转染pEGFP-Nl质粒36h的显微照片(100 X )
[0036]图17为本发明的大黄鱼肝脏细胞系转染0ct4-pEGFP_Nl重组载体36h的显微镜照片(100X )。
【具体实施方式】
[0037]以下通过【具体实施方式】结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0038]溶液配制
[0039]D-Hanks 溶液:取 0.4g KCl, 0.06g KH2PO4,8.0g NaCl，0.35g NaHCO3,0.132gNaH2PO4.12H20 定容至 1L，于 121。。20min 高压灭菌，4°C保存。另取 D-Glucose 配成 200g/L贮存液，121°C 20min高压灭菌，冷却后-20°C长期贮存。使用时每L D-Hanks溶液加入5mL D-Glucose贮存液以及IOmL 100X双抗溶液(购自康宁公司，该双抗的100X浓缩液含10000U/mL青霉素以及10000 μ g/mL链霉素)。
[0040]含双抗的灭菌海水:取新鲜海水，于121°C 20min高压灭菌，使用时每IL灭菌海水加入IOmLlOOX双抗溶液(购自康宁公司，该双抗的100X浓缩液含10000U/mL青霉素以及10000 μ g/mL 链霉素)。
[0041]完全培养液:取商品化500mL DMEM/F12培养液，然后加入终浓度分别为16.7%胎牛血清FBS、0.5%ο β -巯基乙醇、50 μ g/mL N-乙酰葡糖糖胺、50 μ g/mL羧甲基纤维素钠、10μ g/L 人 FGF-basic、5y g/L 人 EGF、ly g/L 人 HGF、100IU/mL 青霉素以及 100 μ g/mL 链霉素。4°C保存，使用时间不超过I个月。
[0042]10%甘油冻存液:甘油于121 °C 20min高压灭菌。取IOmL甘油与90mL的胎牛血清
混匀，4 °C保存。
[0043]秋水仙碱忙存液:取上述配置D-hanks溶液，加入250mg秋水仙碱,定容至125mL,充分溶解，于超净台内以0.22 μ m针头过滤器过滤除菌。贮存液浓度为2mg/mL( 100 X )，除菌后密封，4 °C保存。
[0044]低渗溶液:称取0.3g KCl溶于IOOmL超纯水中。室温长期有效。
[0045]MTT贮存液:取上述配置D-hanks溶液，加入250mg MTT粉末，充分溶解，定容至50mL,于超净台内以0.22 μ m针头过滤器过滤除菌。贮存液浓度为5mg/mL，除菌后以锡箔纸包裹避光，_20°C保存。
[0046]卡诺氏固定液:将醋酸与甲醇按照1:3的比例混合，而后置于-20°C短期保存，配好后有效期不超过I天。 [0047]Giemsa染液母液:称取0.5g Giemsa干粉，加入5mL甘油，充分碾磨；继续加入28mL甘油，以锡箔纸包裹，于60°C加热2h;添加33mL甲醇，混匀。母液存放于棕色玻璃瓶中，放置3周以后使用，室温长期保存。[0048]实施例1
[0049]本发明大黄鱼肝脏细胞系的建立:
[0050]( I)由于大黄鱼属石首鱼科鱼类，对次氯酸盐极度敏感，故在体表消毒步骤采用含双抗的灭菌海水代替次氯酸消毒液。将7个月大,长9-llcm的大黄鱼鱼苗在含双抗的灭菌海水中暂养I~2h。结束时滴入3-4滴丁香酚，直至鱼体翻转，腹部向上，对刺激无应激行为为止。以灭菌纱布块擦除鱼体表黏液。以浸有75%酒精的棉球擦拭鱼体表2次。将鱼体移入超净台，用解剖器具取出肝脏组织，并放入事先加好D-hanks中培养皿中漂洗3-4次。
[0051](2)将肝脏组织块以两把11号手术刀交叉切碎至Imm3大小左右的小组织块。将切好的小组织块以含双抗的D-hanks溶液漂洗2次，最后以含血清生长因子的培养液漂洗一次。将组织块接种于25cm2细胞培养瓶中，吸除多余培养液。轻轻翻转瓶身，使之倒置。于27°C恒温干贴24h。小心加入5mL完全培养液(含双抗、生长因子)，轻轻翻正培养瓶以使组织块浸入培养液中。于27°C恒温培养启动原代培养,每周换完全培养液一次。
[0052]如图1至图3所示，大黄鱼肝脏组织启动原代培养后第7天即有贴壁细胞迁徙出组织块(图1)，至第15天已有小片细胞簇出现(图2)，至第61天一些组织块周围出现密集细胞堆叠现象(图3)。
[0053](3)当大黄鱼肝脏细胞系原代培养贴壁细胞覆盖率达到50-60%或是更高时，原代细胞可能会出现较明显的接触抑制，此时以胰酶消化法启动传代培养。采用经典细胞消化步骤:移除原先培养瓶中的旧培养液；加入5mLD-Hanks溶液，清洗I次以去除原培养液中的血清、二价金属离子(此类物质会极大地影响胰蛋白酶的消化作用)；倒出上述D-Hanks溶液，加入2.5mL0.25%的 商品化的含EDTA的胰酶消化液，晃动瓶体，使胰酶溶液与底层细胞充分接触，倒出胰酶消化液(此步应较快进行，否则易造成消化过度；移除胰酶消化液时应留有足够使平底保持湿润的溶液，否则瓶底易出现部分区域变干而影响消化)；移出培养瓶，倒置显微镜下观察，至大多数细胞变圆解除贴壁后，立即移入超净台加入5mL含血清培养液终止消化；吹打，镜检吹打效果，如若残余细胞过多则可重复消化一次；以1:2-10的比例将细胞悬液接种至新培养瓶，补齐培养液至5mL后将培养瓶置于27°C恒温培养，以后每隔2-8天传代一次。如图4至7所示，大黄鱼肝脏细胞系从2代至第35代较稳定地呈现类纤维状多边形。
[0054]实施例2
[0055]实施例1的大黄鱼肝脏细胞系的冻存与复苏。
[0056](I)冻存:取一瓶75cm2的生长旺盛铺满培养瓶瓶底的大黄鱼肝脏细胞系细胞，采用胰酶消化法，离心后收集细胞沉淀，缓慢加入3mL配置好的细胞冻存液，并轻轻吹打细胞，使其均匀分散在细胞冻存液中，使用移液枪将液体移入冻存管中。冻存管在4°C放置lh，再置于冰盒中，将冰盒置于-80°C放置I天，最后取出冻存管并浸入液氮中，可长期冻存。
[0057](2)将冻存管从液氮中取出，迅速放置在已经调节好温度(40°C)的水浴锅中，融化细胞的过程中应不断地摇晃冻存管，使其快速均匀解冻，直至完全融化。将融化的细胞悬液转移到25cm2培养瓶离心管中，向培养瓶中补齐5mL的完全培养液，于27°C，5%C02培养。24h后更换新的完全培养液,继续培养。
[0058]如图9所示，对于大黄鱼肝脏细胞系冻存后复苏24h贴壁率达到60%_80%，与冻存前的细胞形态无明显差异；如图10所示冻存后复苏72h后细胞可长满培养瓶瓶底；如图11，复苏后的大黄鱼肝脏细胞可以进行正常传代，且与冻存前细胞以及冻存复苏后的细胞形态无差异。
[0059]实施例3
[0060]实施例1的大黄鱼肝脏细胞系不同传代比例增殖曲线的影响及群体倍增时间分析:
[0061]从实施例1所建立的大黄鱼肝脏细胞系中选取形态良好、增殖旺盛的细胞，消化传代，分别以1: 2、1: 3、1:5和1:10进行传代至25cm2细胞培养瓶(即向4个培养瓶分别加入2.5mL, 1.6mL, lmL，0.5mL细胞悬液，而后以培养液将各瓶溶液总量补齐至5mL)。从传代24h起每隔24h拍照一次，采用经典五点交叉取样法对培养细胞进行倒置显微拍摄统计视野观测细胞数，每组取5点观测细胞数总和作图分析。
[0062]如图8所示，对于大黄鱼肝脏细胞系，不同的传代比例对细胞影响很大，除了 1:2传代组外，其余组增殖均十分缓慢。第一天末的总贴壁数目与接种密度成正比，之后除1:2组以外，其余组均以较慢的 速度增殖。
[0063]实施例4
[0064]实施例1的大黄鱼肝脏细胞系的染色体分析:
[0065]取分裂旺盛取分裂旺盛的大黄鱼肝脏细胞，接种至75cm2细胞培养瓶，待细胞增长处于对数期，加入终浓度为20 μ g/mL的秋水仙碱，继续培养6-8h后收集细胞得到细胞悬液。将细胞悬液移至15mL离心管，1000g离心10 min，轻轻吸出上清液，加入4mL3%。KCl低渗30min ;加入0.5mL新鲜配置预冷的卡诺氏固定液预固定IOmin, 2000g离心10min ;取细胞沉淀加入0.5mL卡诺氏固定液，以移液枪重悬沉淀；再加入ImL固定液；30cm高度向玻璃载玻片(于-20°C预处理)滴片，水平放置以使其彻底延展，65°C干燥；而后浸入含Giemsa染液工作液的染缸中染色lOmin，双蒸水冲洗以去除玻片表面渣滓，干燥，中性树脂封片，1000X油镜观察计数。
[0066]如图12和图13所示，对大黄鱼细胞系的染色体分析显示大黄鱼细胞系的核型均呈现近似正态分布:56%观测到的分裂相细胞染色体数目为48条；染色体数目均分布在单倍体与四倍体之间(24-96条)。
[0067]实施例5
[0068]实施例1的大黄鱼肝脏细胞系的饥饿处理
[0069]取细胞覆盖率80%_100%的大黄鱼细胞，用完全培养液换液，于27°C，5%C02培养，30d后发现培养液颜色由橙色变成浅黄色，说明培养液中的营养物质被大量消耗。显微镜下观察大黄鱼肝脏细胞形态，如图14所示，可见由大量细胞解除贴壁而形成空洞状；部分细胞由于营养消耗细胞发生皱缩，在显微镜下观察折光性增强；细胞仍有较多细胞存活且形态未发生变化。如图15所示，当再次补给新鲜的完全培养液后，存活下来的细胞可以再次增值，分裂仍然旺盛，形态也未发生变化。
[0070]实施例6
[0071]实施例1的大黄鱼肝脏细胞系转染pEGFP-Nl质粒以及功能基因oct4
[0072]设计大黄鱼oct4基因的正反向引物，扩增不含终止密码子的大黄鱼oct4基因的 orf。正向引物 oct4F:TACGAGCTCGCCACCATGACGGAGAGACC 和反向引物 oct4R:ACGGAATTCTTCCAGTCAGGTGACTAACC,其中 GAGCTC 为 SacI 酶切位点，GCCACC 为增强表达的Kozak序列，GAATTC为EcoRI酶切位点，T为避免三联子移码突变的占位碱基。用SacI和EcoRI内切酶对pEGFP-Nl质粒进行双酶切，并将扩增出的大黄鱼oct4基因的orf片段链接到真核表达质粒PEGFP-Nl上，成功构建出oct4-pEGFP-Nl重组质粒。
[0073]感受态细菌细胞制备:采用大肠杆菌DH5a菌种，采用经典氯化钙法制备感受态细胞，_80°C长期保存。
[0074]质粒转化:取Ing DNA溶液置于EP管中，冰浴放置。从_80°C冰箱取出100μ L感受态细菌悬液，迅速溶解，加入DNA溶液中，冰浴lOmin。42°C，水浴2min。将EP管于37°C 220转培养Ih。而后将转化后的菌液涂布于含抗生素的LB固体培养平板上。
[0075]质粒制备:按照HiPure Plasmid MaxiPrep Kit质粒大提试剂盒(TransGene公司)说明书提取pEGFP-Nl质粒和oct4-pEGFP-Nl重组质粒，_20°C保存。
[0076]转染细胞:取旺盛生长的大黄鱼肝脏细胞系细胞，以1:2接种于12孔板，27°C，5%C02培养。待细胞覆盖率至70% — 80%后，按照sofast转染试剂(购自太阳马公司)说明书进行操作。27°C，5%C02培养，24h以后检测荧光表达。
[0077]利用梭华一Sofast介导质粒DNA转染大黄鱼肝脏细胞系24h后，于荧光显微镜下镜检能够检测到绿色荧光，即如图16和图17所示，pEGFP-Nl质粒以及-大黄鱼功能基因oct4在该细胞系中有表 达。转染36h后，仍能观察到绿色荧光。说明建立的大黄鱼肝脏细胞系可以适应外源基因的转染实验。
[0078]以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，SP依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
【权利要求】
1.一种大黄鱼肝脏细胞系，其特征在于:该细胞系于2013年10月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为=CCTCC N0:C2013157o
2.—种权利要求1所述的大黄鱼肝脏细胞系的建立方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)大黄鱼肝脏组织的获取:将7个月大，长9-1Icm的大黄鱼鱼苗在含青霉素及链霉素双抗的灭菌海水中暂养1-1.5h，然后滴入占灭菌海水体积0.005-0.015%的丁香酚，直至鱼体翻转，腹部朝上，对刺激物应激行为为止；以灭菌纱布块擦除鱼体表面粘液，以浸有酒精的棉球擦拭鱼体表面后，取出大黄鱼肝脏组织并置于含青霉素及链霉素双抗的D-hanks液中； (2)原代培养:将上述大黄鱼肝脏组织切碎至0.7-2.0mm3的小组织块，以D-hanks液漂洗，最后以完全培养液洗；漂洗后将上述小组织块接种于细胞培养瓶中，吸除多余培养液，翻转瓶身27°C恒温干贴24h，再加入完全培养液翻正瓶身以使小组织块浸入培养液中，于27 °C恒温培养启动原代培养,每周更换完全培养液一次； (3)传代培养:原代培养至贴壁细胞增殖至至少50-60%覆盖率时，移除旧培养液，并清洗去除残留的血清和二价金属离子；然后以0.25%胰酶消化法传代悬起细胞，以1:2-10进行传代；以后每隔2-8天传代一次，所述大黄鱼肝脏细胞系建立成功。
3.如权利要求2所述的一种大黄鱼肝脏细胞系的建立方法，其特征在于:所述完全培养液中包括:DMEM/F12培养液、胎牛血清FBS、β -巯基乙醇、N-乙酰葡糖糖胺、羧甲基纤维素钠、人FGF-basic、人EGF、人HGF、青霉素及链霉素。
4.如权利要求3所述的一种大黄鱼肝脏细胞系的建立方法，其特征在于:所述完全培养液为:以DMEM/F12培养液为基础，包括终浓度分别为16.7%胎牛血清FBS、0.5%。β -巯基乙醇、50 μ g/mL N-乙酰葡糖糖胺、50 μ g/mL羧甲基纤维素钠、10 μ g/L人FGF_basic、5 μ g/LAEGF、lyg/LAHGF、100IU/mL 青霉素以及 100 μ g/mL 链霉素。
【文档编号】C12N5/071GK103992981SQ201310703543
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】王艺磊, 庄道华, 张子平, 李敏 申请人:集美大学