专利名称：山羊黄体细胞系的建立方法
技术领域：
本发明属于生物动物细胞系领域，具体涉及一种山羊黄体细胞系的建立方法。
背景技术：
黄体是哺乳动物排卵后在卵巢中形成的一个暂时性的内分泌组织，对于哺乳动物 维持正常的生殖功能具有重要作用，此外它受控于脑垂体促性腺激素的调节，其分泌的类 固醇激素主要是孕酮。其主要作用(1)刺激子宫腺的分泌，子宫充血肿胀和子宫黏膜肥 厚，保证受精卵着床；( 保证妊娠早期胎儿的存活。此外还对下丘脑-脑垂体轴，卵巢，输 卵管和乳腺等器官具有调节作用。近年来研究发现如果妊娠黄体功能异常或其他药物影响 黄体细胞孕酮的分泌，则会影响妊娠的维持和胎儿的存活。黄体作为成年雌性动物体内具有周期性生长和退化特性的组织之一，其组织结构 的规律性变化，调节和分泌的机制一直是许多研究的重点，也是近年来研究最热的内分泌 器官之一。此外黄体细胞在体外培养时间有限，不同代数细胞之间在形态，生物特性和基因 表达水平上都有很大的差异，这也造成了不同试验室之间的实验结果很难进行比较。因此建立一种能保持原代黄体细胞的生物学特征和长期稳定传代的永生化的黄 体细胞系对于阐明黄体细胞的生理调节功能具有重要意义。由于自发永生化的几率非常小，因此目前建立细胞系常用的方法主要有放射性， 癌基因和原癌基因的转染，DNA致瘤病毒。这些方法常常使永生化的细胞核型不稳定，表型 改变和具有致瘤性等诸多缺点，限制了其广泛应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种能保持原代黄体细胞孕酮分泌等生物学特征的山羊黄 体细胞系，为研究黄体细胞的生长，生理生化和孕酮分泌调节的分子机制提高了细胞模型 和研究工具。本发明的另一目的是提供分离和纯化原代山羊黄体细胞的方法。本发明通过下述方法和步骤建立山羊黄体细胞系1原代培养和纯化通过检查胎儿大小和观察发育程度来判定妊娠期，胶原酶消化黄体组织使其成单 个细胞或者细胞团，并接种细胞瓶进行培养，并柠檬酸-胰酶消化，倒置显微镜下观察，约 20% 40%的细胞收缩呈圆形时，加入培养液终止消化，并吹打，移去悬浮的细胞，继续培 养剩余，并重复几次。直至纯度达到95%以上。通过组织细胞化学对细胞进行鉴定，阳性细胞的细胞核周围成蓝色。(这样应该是 蓝色)2转染和筛选用脂质体2000把人端粒酶逆转录基因导入黄体细胞内，转染后加入G50yg/ml) G418进行筛选2-3周，等单克隆形成后，挑取单克隆并用组织细胞化学法进行鉴定。
对阳性细胞进行扩大培养，3天传代一次，传代率1 2，待细胞传到30代时进行 鉴定试验，并测定转染前后山羊黄体细胞的生长曲线。RT-PCR检测黄体细胞人端粒酶逆转录酶基因mRNA的表到，ELISA法检查端粒酶活 性。RT-PCR检测转染后黄体细胞内关键基因的表达，用放射免疫法(RIA)测定转染后 黄体细胞分泌孕酮的量。核型分析转染后黄体细胞染色体数量的变化。软琼脂试验和裸鼠致瘤性试验检测转染后黄体细胞是否具有肿瘤转化的特征；如 悬浮生长和致瘤性。利用上述方法建立的山羊黄体细胞系，能在体外长期生长和稳定传代，具有下列 生物特性(1)与原代细胞形态相似，永生化的细胞呈多角型或梭型；(2)外源性人端粒酶逆转录酶基因能在转染的黄体细胞内稳定表达，而且有较高 的端粒酶活性，细胞的增殖能力明显增加；(3)该细胞系保持了原代黄体细胞的一些重要特征，如分泌孕酮，表达黄体细胞内 的关键基因StAR，P450scc, 3 β -HSD, LH-R ；(4)核型分析，该细胞系没有发生染色体的丢失或增加，核型稳定；(5)体内和体外致瘤性试验显示，该细胞系不具有肿瘤的转化特征。
图1为倒置显微镜下转染前后山羊黄体细胞的形态A 原代山羊黄体细胞 (100Χ) ；B 转染后15代山羊黄体细胞(hTERT-GLCs) (100X) ；C 转染后30代山羊黄体细 胞(100X) ；D 转染后55代山羊黄体细胞(100X)；图2组织细胞化学染色鉴定山羊黄体细胞类固醇脱氢酶染色鉴定(阳性细胞的 细胞核周围显蓝色，100X)；图3转染前后山羊黄体细胞生长曲线转染后第55代后山羊黄体细胞 (hTERT-GLCs)和第2代原代山羊黄体细胞(GLCs)；图4RT-PCR检测转染前后山羊黄体细胞人端粒酶逆转录酶基因mRNA的表达转染 后山羊黄体细胞第30代(泳道幻和第55代(泳道幻，原代山羊黄体细胞第2代(泳道 4)和HeLa细胞(泳道1)作为阳性对照；图5端粒酶活性检测试剂盒(Roche)测定转染后山羊黄体细胞端粒酶活性；1 子宫颈癌细胞(HeLa)，2 转染后山羊黄体细胞第30代，3 转染后第55代后山 羊黄体细胞，4 第2代原代山羊黄体细胞图6RT-PCR检测转染前后山羊黄体细胞关键基因mRNA的表达；图7放射免疫测定环化腺苷酸(8-Br-cAMP)，22(lO-羟胆固醇 (22 (R) -hydroxycholesterol)和孕烯醇酮(Pregnenolone)对转染后山羊黄体细胞孕酮分 泌量的影响；图8转染后山羊黄体细胞核型分析结果；图9软琼脂试验结果A =HeLa细胞在软琼脂上培养3周(阳性对照)，B 转染后山
4羊黄体细胞在软琼脂上培养3周；图10裸鼠致瘤性试验结果A:裸鼠接种HeLa细胞2月后接种区组织结构(HE， 100X)，组织切片检查发现，细胞排列紊乱，极性消失，向深部浸润，可见大量核分裂相，呈 现恶性肿瘤的特征。B:裸鼠接种第55代转染后山羊黄体细胞2月后接种区组织结构(HE， 100X)，组织结构良好，和正常组织比未见有明显的区别。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。一.细胞培养1.山羊黄体细胞的分离和纯化在当地屠宰场取妊娠6-8周的健康萨能奶山羊的卵巢(通过检查胎儿大小和观察 发育程度来判定妊娠期)，放到4°C加有双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)中，30min内带回实验 室超净台内，剥离黄体组织并尽可能剪成Imm3组织碎块，加入0.2% (质量体积比)胶原 酶II anl，置37°C恒温水浴锅中消化黄体组织15min后，加入含15%胎牛血清，100IU/mL 青霉素，100μ g/mL 链霉素的 DMEM/F12(Dulbecco，s Modified Eagle，s andHAM，S F-12， 1 l(v/v)with 15mmol/I HEPES)培养基，吹到分散细胞，并用150 μ m尼龙膜进行过滤， 除去未消化完全的组织块，收集过滤液进行离心并重复洗涤3次，然后用含15%胎牛血清 的DMEM/F12培养基悬浮沉淀，用台盼蓝排斥试验检测细胞的活性，并调整细胞密度使活细 胞达到IX IO6个/ml，接种于25cm2培养瓶内，放置于37°C，5% CO2培养箱中进行培养。3 天后进行换液，待细胞长满瓶底时进行传代，用柠檬酸-胰蛋白酶进行差速消化纯化，并根 据组织细胞化学染色结果，在显微镜下计算阳性细胞所占细胞总数的比例，待黄体细胞纯 度达到95%以上时进行后续转染。2.组织细胞化学染色鉴定黄体细胞通过对细胞内3 β-羟基类固醇脱氢酶(3i3_HSD)活性染色，进行类固醇黄体细胞 的鉴定，黄体细胞染色后在细胞核周围层深蓝色。培养的细胞接种到6孔板里，24h后移去 培养基，并用PBS洗两次，用的甲醛固定20min，然后加入染液(0. IM的PBS液中含有； 0. 1% BSA, 1. 5mM NAD，0. 25mM氯化硝基四氮唑和0. 2mM脱氢异雄甾酮)，在37°C避光放置 4h，然后用PBS液洗两次，镜下观察拍照(见图2)。3转染和筛选第2代原代黄体细胞用0. 25%胰酶消化，用不含双抗的培养基终止消化并接种到 六孔板。待细胞达到90%以上汇合时，移去培养基，并用不含血清的基础培养基洗涤两次。 根据^vitrogen公司的脂质体2000说明书进行转染，用脂质体2000把人端粒酶逆转录基 因导入黄体细胞内，转染后加入G50yg/ml)G418进行筛选2-3周，等单克隆形成后，挑取 单克隆，用步骤2组织细胞化学染色鉴定黄体细胞。4阳性细胞扩大培养组织细胞化学染色鉴定的阳性细胞接种到25cm2细胞培养 瓶里，用低浓度G418维持培养，每隔3天传代一次，分种率1 2，体外传至30代时进行生 物学指标的检查和验证。5转染前后山羊黄体细胞的生长曲线的测定将第2代山羊黄体细胞和第55代转染后的山羊黄体细胞按1 X IO4个细胞/孔接种于M孔培养板，3d换液1次，每天用0. 25%胰蛋白酶消化细胞，血细胞计数板计数。每 个孔计数3次，每次取3个孔，取其平均值绘制细胞的生长曲线，并按以下公式计算群体倍 增时间(PDT) =PDT = [log2/ (LogNt-IogNO) ] X t，其中NO和Nt分别代表接种时和培养t小 时后的细胞数(见图3)。6RT-PCR检测转染后山羊黄体细胞端丽酶基因的表达参照hvitrogen公司的Trizol Reagent的操作说明从第30代，55代转染后山羊 黄体细胞和第2代山羊黄体细胞中提取总的mRNA，并进行逆转录成cDNA，然后进行PCR扩 增，扩增条件；先在95°C下变性:3min，然后95°C，30s，56°C，40s，72°C，60s，35个循环，最后 在72°C延伸lOmin。取上述PCR产物6 μ L于0. 2%的琼脂糖凝胶中电泳，120V，30min电泳 完毕后溴化乙锭显色，于紫外凝胶成像系统观察、拍照(见图4)。7端粒酶活性检测按照试剂盒TeloTAGGGTelomerasePCRELISAPLUSkit (Roche)中的操作说明进行端 粒酶提取，端粒酶延伸和PCR扩增反应，ELISA测定。收集2X IO5个细胞，用Lysis buffer 在冰上裂解30min。12000rpm, 20min,取上1 μ 1裂解上清液作为端粒酶模板，按照试剂盒 的PCR扩增反应条件进行扩增，阴性对照用RNAase处理。扩增结束后，按ELISA要求和加 样顺序进行显色和吸光度测定(见图5)。 8RT-PCR检测转染后山羊黄体细胞内关键基因的表达利用步骤6中提取的mRNA转录成的cDNA进行PCR，PCR扩增反应条件同步骤3 — 样，然后进行凝胶电泳，成像并拍照(见图6)。9放射免疫检测转染山羊黄体细胞的孕酮分泌根据碘1251孕酮放射免疫分析药盒(天津九鼎医学生物工程有限公司)的说明 书进行样品准备和处理。将传至第55代山羊黄体细胞接种于12孔培养板，24h移去培养 基，并分别加入含有不同浓度的环化腺苷酸类似物，22-羟胆固醇和孕烯醇酮，每个浓度重 复3孔，24h收集上清，4°C，3500r/min离心15min取上清，放_20°C保存待测。根据给定的 标准曲线，算出待测样品中孕酮的含量(见图7)。10核型分析取对数生长期细胞，加秋水仙素至浓度0. 1 μ g/mL继续培养6h，用0. 25%胰蛋白 酶消化细胞，PBS液洗涤细胞1次，800r/min离心5min，弃上清。用75mmol/L KCl重悬细 胞，室温放置lOmin，然后一些甲醇/冰醋酸(ν/ν 3 1)固定液，混勻后4°C离心，弃上清， 继续加固定液，4°C放置30min，4°C离心，弃上清，根据细胞多少加适量固定液重悬细胞，后 滴加在4°C预冷的玻片上，空气快速干燥，用姬姆萨染色IOmin左右，常规脱水封片，油镜下 观察(见图8)。11软琼脂悬浮试验先在12孔培养板底层铺上含0. 35 %琼脂，取第55代转染后山羊黄体细胞，制备成 单细胞悬液，并稀释成2000个细胞/ml，然后和1.2%的琼脂按1 1(体积)混合，作为上 层胶。培养3周后相差显微镜下观察克隆形成情况。HeLa细胞为阳性对照(结果见图9)。12裸鼠致瘤性试验收集第55代转染后上样黄体细胞，用培养基重悬并调整细胞密度为IX 106个/ ml，于6周龄裸鼠臀部皮下无菌接种细胞悬液0. lmL，定期观察。HeLa细胞为阳性对照。两月后裸鼠脱臼致死，观察肿瘤有无并对接种部位进行组织切片检查(HE染色)(结果见图 10)。 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种山羊黄体细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤(1)原代培养和纯化取妊娠6-8周的健康萨能奶山羊黄体，无菌条件下消化黄体组 织，并把得到的黄体细胞接种到细胞培养瓶里，用DMEM/F12进行培养，所述DMEM/F12含有 15%胎牛血清、100IU/mL青霉素、lOOyg/mL链霉素；并置到37°C、5% C02培养箱进行培 养；等细胞长满培养瓶后进行传代，用柠檬酸-胰蛋白酶差速消化进行纯化；(2)转染和筛选对细胞纯度达到95%以上的原代黄体细胞利用脂质体转染人端粒酶 逆转录酶基因，并用G418进行筛选2-3周，挑取单克隆并用组织细胞化学染色进行鉴定；(3)扩大培养对阳性细胞进行扩大培养，3天传代一次，分种率1 2，待细胞传到30 代时进行鉴定试验，并测定转染前后山羊黄体细胞的生长曲线。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)鉴定黄体细胞的方法通过对 细胞内3β-羟基类固醇脱氢酶活性染色，进行类固醇黄体细胞的鉴定，黄体细胞染色后在 细胞核周围层深蓝色。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)用450μ g/ml G418进行筛选。
全文摘要
本发明属于生物动物细胞系领域，具体涉及一种妊娠早期萨能奶山羊黄体细胞系的建立方法。本发明利用怀孕6-8周的健康萨能奶山羊的黄体组织为细胞来源，用胶原酶消化黄体组织从而得到离散的黄体细胞，并在体外进行扩大培养和纯化。利用脂质体把人端粒酶逆转录酶基因转染纯化后的黄体细胞内，并用抗性基因进行筛选，挑取单克隆进行扩大培养。然后通过组织细胞化学染色进行鉴定。本发明黄体细胞系细胞呈多角型或梭型，3β-羟基类固醇脱氢酶染色呈阳性，此外还保持了原代黄体细胞的一些重要特征。
文档编号C12N5/071GK102146358SQ20111000872
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月17日 优先权日2011年1月17日
发明者李伟, 童德文, 许信刚 申请人:西北农林科技大学