专利名称：一种猪羊水干细胞系的建立及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞系的建立方法，尤其涉及一种猪羊水干细胞系的建立方法。
背景技术：
由于胚胎干细胞的研究受到伦理道德问题的束缚与限制，很多研究者都在尝试寻 找新的干细胞来源。2003年，Prusa等在羊水中发现0CT4阳性细胞，表明羊水中可能存在 多能干细胞。2007年，Anthony等于Nature Biotechnology杂志上报道，他们找到了易于 获得并有很强增殖能力的干细胞新来源。研究人员通过筛选并分离孕中期羊水中的CD117 阳性细胞，得到少量具有胚胎干细胞特性的细胞。他们将这类细胞命名为羊水源干细胞 (Amniotic Fluid Stem Cell，AFS细胞)，包括胎儿皮肤、胎盘的羊膜、胎儿消化道、呼吸道、 泌尿生殖道的黏膜及上皮细胞。AFS细胞表达CD117表面标记蛋白，该蛋白是干细胞因子 的细胞表面受体，在配子发生、黑素形成和造血细胞发生等过程中起重要作用。人胚胎干 细胞、原始生殖细胞和一些成体干细胞如神经嵴细胞等，都表达⑶117表面标记。实验结果 显示，与ES细胞一样，AFS细胞可在体外长期培养，而普通的体细胞在体外只会存活一段时 间，随后便会死亡。AFS细胞表达0ct4，且表达部分胚胎干细胞和成体干细胞标记，因此，研 究人员认为，AFS细胞处于ES细胞和成体干细胞的中间状态。目前，已经证实羊水来源的干细胞具有向多种细胞分化的能力例如采用地塞 米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和吲哚美辛诱导其分化为脂肪细胞；地塞米松、维生 素C-2-磷酸盐导其分化为成骨细胞；地塞米松、维生素C-2-磷酸盐、丙酮酸钠、脯氨酸、 TGF-β等诱导其分化为软骨细胞；成纤维细胞生长因子和巯基乙醇诱导其分化为神经 系细胞，并证实了分化后的神经细胞能够分泌释放多巴胺。台湾学者Tsai等，通过两步培养法成功地从孕中期羊水中通过贴壁培养分离出 具有多潜能间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，具有神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的特性，在特定的诱导条件下可分化成脂肪细胞、成骨细胞及神经细胞； 国内学者李现铎等，分离出MSCs并诱导成平滑肌和脂肪细胞。王晗学者等分离人的羊水 干细胞并诱导分化已得到类似于早期心肌细胞的分化细胞，表达α -actin, Tbx5、Nkx2. 5、 GATA4、α-MHC等心肌特异标记基因。猪是我国重要经济动物，而且是人类器官移植的最理想动物，PAFS细胞医学应用 的优势在于它很容易获取。研究结果表明，PAFS细胞既可从产前诊断的羊水中提取，也可 以从产后的羊水中分离得到，而且抽取羊水过程并不会损害母体。因此，猪羊水来源的干细 胞为组织工程提供了一个新的种子细胞来源。重要的一点是猪以及很多动物的ES细胞至今尚未建系，而羊水细胞是接近于ES 细胞的一种干细胞。我们可以利用羊水细胞代替ES细胞开展许多研究工作，为动物的遗传 育种，拯救频危动物提供了极大的便利。并在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因动物等 方面有着重要的意义。国内关于羊水干细胞的研究刚刚起步，还存在大量空白，仅在人羊水细胞分离培养，研究进展等方面见到零星报道。关于羊水中细胞的类型、不同类型细胞的分选及羊水细 胞的诱导分化等问题，还有待于进一步探索。关于猪的羊水干细胞的分离培养及定向诱导 分化研究，在国内外均为见到报道，有很大的研究价值及研究前景。
发明内容
为了解决背景技术中所存在的技术问题，本发明提供了一种快速、有效、安全、分 离猪羊水干细胞的方法，可为组织工程研究提供新的种子细胞来源以及有望作为种子细胞 从事科研和生产应用。
本发明的技术解决方案是一种猪羊水干细胞系的建立方法，其特征在于该方 法包括以下步骤1)羊水干细胞的原代分离培养；2)将分离培养的原代羊水干细胞进行机械分离纯化；3)检测并将分离纯化后的羊水干细胞进行培养，建立猪羊水干细胞系，其具体实 现方式是3. 1)待分离纯化后的羊水干细胞长至融合时，弃去培养液，用PBS洗2-3遍，然后 用0. 25%胰蛋白酶+0. 04% EDTA细胞消化液在38°C条件下消化3_4分钟；3. 2)等量细胞培养液中止消化；3. 3)将经过消化的羊水干细胞在1000r/min离心5_10分钟；3.4)弃上清，调整细胞浓度为1. OX IO5个/ml将细胞悬液接到细胞培养皿上，力口 细胞培养液；3.5)连续培养4-8代后，上皮样细胞逐渐减少消失，90%以上表现为成纤维样细 胞，细胞大量扩增，即建成羊水干细胞系。上述步骤1)的具体实现方式是1. 1)收集怀孕母猪的羊水，连同子宫带回，无菌打开子宫，分出由胎衣完整包裹的 羊水备用，测量胎儿的大小，详细记录，然后抽取羊水；1. 2)用100目滤纱过滤，以除去较大的组织碎片，然后2000r/min，离心lOmin，弃
上清，收集细胞。1. 3)将步骤2)中所收集的细胞加入含有5%血清+5%双抗的PBS溶液中，混勻， 置38°C，5% C02培养箱中处理10分钟，然后离心，收集细胞，重复3次。1. 4)将分离出的猪羊水细胞加入原代羊水细胞培养液接种于不同的培养皿中，置 于38°C、5% C02培养箱中培养。上述原代羊水细胞培养液是α -MEM+15 % FBS+1 Ong BFGF+2mmo 1 /L谷胺酰胺 +100u/ml青霉素+100u/ml链霉素的培养液。上述步骤2)的具体实现方式是2. 1)将分离出的羊水细胞加入原代羊水细胞培养液三天后，观察细胞生长情况， 并记录原代细胞贴壁时间及贴壁细胞数；2. 2)五天后观察细胞生长情况，并半量换液；2. 3)在显微镜下用笔在培养皿上标记出上皮样细胞克隆的区域；2. 4)吸去培养液，用PBS洗1-2遍；
2. 5)用细胞刮刀将上皮样细胞克隆刮掉，不要刮到成纤维样克隆，然后补加培养 液，继续培养；或者用细胞刮刀将成纤维样克隆刮下，接到新的培养皿中，继续培养。 上述步骤3. 4)中的细胞培养液是α -MEM+10% FBS+2mmol/L谷胺酰胺+100u/ml 青霉素+lOOu/ml链霉素的培养液。本发明的优点是1、快速、有效、安全。本发明采用采用原代贴壁法和机械分离法，分离纯化了猪羊 水干细胞，并建立一种快速、有效、安全的猪羊水干细胞分离方法。2.通过胚胎测量及后续细胞的培养，发现由4-8厘米的胎儿分离的羊水成功率最 高，并且细胞活性好。3、可实现了猪羊水干细胞体外长期扩增。依照本发明所提供的人羊水干细胞系的 建立方法，不需滋养层细胞，实现了猪羊水干细胞体外长期扩增，已传至22代，经流式细胞 仪分析表明，分离的hAFS细胞传至20代后核型正常，已冻存1 1. 5 X IO8个种子细胞，其 性能稳定，遗传性状良好。并且经免疫荧光、RT-PCR和流式细胞检测表明，所分离的猪羊水 干细胞表达HLA-ABC，不表达HLA-DR ；表达ES细胞标记基因Oct4、Nanog、和CD117、SSEA-4、 TRA-60.TRA-81 ；不表达SSEA-I ；表达间质细胞标志基因⑶90、⑶44等；不表达⑶34、⑶45、 ⑶54等造血细胞系标志基因。可以形成类胚体，并且类胚体碱性磷酸酶检测阳性，RT-PCR 分析表明具有分化为三胚层来源的各种细胞的潜能，体外可以诱导分化为脂肪细胞，神经 细胞。体内注射裸鼠分化实验，未形成畸胎瘤，说明致瘤性低，与报道的人羊水干细胞一致。4、可为组织工程研究提供新的种子细胞来源。本发明根据建立细胞系的要求按细 胞系的定义成功的建立了猪羊水干细胞系，为今后干细胞研究开辟了新方向，有望作为种 子细胞从事科研和生产应用。5.猪的ES细胞至今尚未建系，羊水细胞是最接近ES细胞的一种细胞，可以代替 ES细胞进行一些研究。
图1 (a)是本发明的孕早期的胎儿形态图；图1 (b)是本发明的猪原代羊水细胞中的成纤维样克隆50X ；图1(c)是本发明的原代细胞中的上皮样克隆50X ；图1 (d)是本发明的pl2代猪羊水干细胞50X ；图2(a)是本发明的p6代猪羊水干细胞的生长曲线图；图2(b)是本发明的p6代猪羊水干细胞的细胞周期图；图3 (a)是本发明的猪羊水干细胞0CT4阳性200 X ；图3 (b)是本发明的猪羊水干细胞Nanog阳性200 X ；图3 (C)是本发明的猪羊水干细胞SSEA-I阴性200 X ；图3⑶是本发明的猪羊水干细胞SSEA-3阳性200 X ；图3 (E)是本发明的猪羊水干细胞Tra-60阳性200 X ；图3 (F)是本发明的猪羊水干细胞Tra-81阳性200 X ；图4(a)是本发明的猪羊水干细胞类胚体染色阳性200X ；图4(b)是本发明的猪羊水干细胞向脂肪诱导油红O染色阳性200X ；
图4(c)是本发明的猪羊水干细胞向神经诱导6h形态学观察200X ；
具体实施例方式本发明提供了一种猪羊水干细胞系的建立方法，该方法包括以下步骤1、猪羊水干细胞的原代分离培养，分析哪个时期羊水细胞最好1)从屠宰场收集 怀孕母猪的羊水，连同子宫带回实验室。先无菌打开子宫，分出由胎衣完整包裹的羊水，测 量胎儿的大小，详细记录，然后用注射器抽取羊水。2)用100目滤纱过滤，以除去较大的组 织碎片，然后2000r/min，离心lOmin，弃上清，收集细胞。3)将所收集的细胞加入含有5% 血清+5%双抗的PBS溶液中，混勻，置38°C ,5% CO2培养箱中处理10分钟，然后离心，收集 细胞，重复3次。将分离出的猪羊水细胞根据羊水体积的大小加入原代羊水细胞培养液，该培养液 是 α -MEM+15% FBS+10ngBFGF+2mmol/L 谷胺酰胺+100u/ml 青霉素+100u/ml 链霉素的培养液。2、将分离培养的原代羊水干细胞进行机械分离纯化将分离出的猪羊水细胞培养 3天后，在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并记录原代细胞贴壁时间及贴壁细胞数；5天 后观察细胞生长情况，并半量换液。待细胞出现上皮样细胞克隆和成纤维样细胞克隆，两种 克隆分界明显时，用机械分离法进行分选1)在倒置显微镜下用笔在培养皿上标记出上皮 样细胞克隆的区域；2)吸去培养液，用PBS洗1-2遍；3)用消过毒的细胞刮刀将上皮样细胞 克隆刮掉，在操作中不要刮到成纤维样克隆，然后补加培养液，继续培养。或者也可以用细 胞刮刀将成纤维样克隆刮下，接到新的培养皿中，继续培养，以上两种方法都可以得到较纯 的细胞克隆。4)可以重复上面的第3)步，如此反复，直到获得成纤维样克隆。3、检测并进行扩大培养，建立猪羊水干细胞系。具体实现方式是1)待细胞长至 融合时，弃去培养液，用PBS洗2-3遍，然后用0. 25%胰蛋白酶+0. 04% EDTA细胞消化液 38°C消化3-4分钟；2)等量细胞培养液中止消化，1000r/min离心5_10分钟；3)弃上清， 调整细胞浓度为1. OX IO5个/ml将细胞悬液接到60培养皿上。加细胞培养液，成份为 α -MEM+10% FBS+2mmol/L谷胺酰胺+100u/ml青霉素+100u/ml链霉素；重复步骤3)，连续 培养4 8代后，上皮样细胞逐渐减少消失，90%以上表现为成纤维样细胞，细胞大量扩增。参见图1，用以上方法获得的猪羊水干细胞，并稳定传代到22代，细胞形态没有发 生改变。经多次分离发现，孕早期(胎儿在3-5cm)时容易分离，且孕早期细胞比孕晚期的 活性强。对分离培养的羊水干细胞的进一步检测方法1、群体倍增时间的测定及细胞周期的检测，测得本株猪羊水干细胞的生长曲线及 细胞周期；具体方法是 1)取p6代细胞，消化制成细胞悬液，接种于24孔板，每天抽取3孔进行细胞计数， 计算平均值，绘制生长曲线，计算群体倍增时间，公式为TD = t X lg2/ (IgNt-IgNO)TD 细胞群体倍增时间；t 培养时间；NO 接种后的细胞数；Nt 培养t小时后的细 胞数。
2)取pl2代细胞消化制成悬液，离心收细胞，用70%的酒精固定过夜，200目纱布 过滤，加50ng/ul的PI上流式机检测。参见图2，猪羊水干细胞的群体倍增时间为34.07小时；P12代细胞Gl期为 42. 901，G2 期为 11. 121，S 期为 45. 978。根据细胞群体倍增时间及流式周期检测得出，本株猪羊水干细胞增值较快，细胞 在多次传代后仍具有较强的增值能力，同时细胞核型正常，没有异倍体出现。2、PCR检测特异性标志基因，在RNA水平上检测猪羊水干细胞的特异性标志基因， 鉴定其是否具有胚胎干细胞的特性。具体方法是收集不同代次的猪羊水干细胞，离心，然后加入Iml Trizol，震荡，室 温处理5-10min，再加入0. 2ml氯仿，室温处理5min，10000r/min，4°C离心lOmin，此时溶液 分为3层，吸取上清液约0. 45ml，在加入等体积异丙醇，室温静置20-30min，10000r/min, 4°C离心lOmin，弃上清。加入预冷的75%乙醇1ml，混勻10000r/min，4°C离心lOmin，弃上 清，真空干燥3-4min，加入适量的DEPC水溶解，并测OD值。随后，按Revert AidTM First Strand cDNA 合成试剂盒合成 cDNA 链。通过 PCR 检测 0CT4、NANOG、CDl 17、CD90、CD45、 HLA-ABC的表达，内参为β -actin。结论分离的本株不同代次的猪羊水干细胞，表达0CT4、NANOG,⑶117、⑶90、 HLA-ABC,不表达⑶45，说明本株细胞表达胚胎干细胞和间充质干细胞标志，不表达造血干 细胞标志。3、荧光检测，在蛋白水平上检测PAFS特异性标志基因，进一步鉴定其是否具有胚 胎干细胞的特性。具体方法是取第8代细胞进行免疫荧光染色，4%多聚甲醛室温固定细胞30min ；0. 2 % tritonlOO打孔10分钟，洗两次，每次5-lOmin，加5% BSA,室温封闭30min ；分别滴加 Oct-4、Nanog、SSEA-1/4, TRA-60, TRA-81，抗体(设滴加 PBS 组为阴性对照)，4°C过夜；滴 加FITC标记的二抗，室温下孵育60min. Leica倒置显微镜下观察照相。结论参见图3，本株猪羊水干细胞0CT4、NANOG、SSEA-4、TRA-60、TRA-81抗原检测阳性， 而SSEA-I阴性，进一步证明了本株猪羊水干细胞具有胚胎干细胞的特性，即表达胚胎干细 胞的特异标志物。4、猪羊水干细胞体外分化潜能检测，检测本株猪羊水干细胞是否具有在体外分化 为多种细胞的能力。具体方法是1)猪羊水干细胞可以形成类胚体，并对类胚体进行检测。用1 %的琼脂处理塑料培养皿，待用。消化收集6代PAFS细胞，按3X 105/mL密度 接种，加入培养液，于38°C，5 % C02饱和湿度悬浮培养，观察并小心摇晃吹打，避免类胚体 之间聚集和贴壁。或者调整细胞密度为300-500个/20ul在培养皿盖上做悬滴培养，培养 两天，收集形态较好的类胚体，待刚刚贴壁后(或悬浮染色)，加入新鲜配制的碱性磷酸酶 染色液，30min内镜下观察着色情况。2)猪羊水干细胞可以定向分化为中胚层的脂肪细胞
将p6代的猪羊水细胞形成类胚体培养3天后，挑取好的类胚体接于塑料培养皿上，让其贴壁，加诱导液(配方)，每两天半量换液，观察诱导情况。
3)猪羊水干细胞可以定向分化为外胚层的神经细胞将p6代的细胞接于24孔细胞培养板中贴壁培养，在倒置显微镜下每天观察细胞 生长情况，当细胞长到约60%时，用含有lmmol/L β -ME的羊水基础培养液预诱导24h。PBS 洗3次，然后换5mmol/L，10mmol/L的无血清的α -MEM液诱导，观察诱导效果。结论1)参见图4(a)，猪羊水干细胞形成的类胚体变红，AP阳性。2)参见图4(b)，脂肪诱导九天后在细胞核周围出现大量脂滴，油红0染色阳性。3)参见图4(c)，加正式诱导液4_6h后，观察细胞变圆，有多个细胞突起，RT-PCR 检测FGF5，CD56外胚层特异性基因表达阳性，免疫荧光检测抗神经微丝(NF)，巢蛋白 (nestin)表达阳性。进一步证明了猪羊水干细胞具有胚胎肝细胞的特性，在体外能分化为不同的组织 和细胞的潜能。5、猪羊水干细胞体内分化潜能检测，检测本株羊水细胞的致瘤性具体方法是将猪羊水干细胞P6代，p8代，P12代细胞消化，制成3 X 106/0. 2ML注射入裸鼠背 部，同时注射小鼠的胚胎干细胞做阳性对照。参见图5，六周后，阳性对照长出肿瘤，而猪羊 水干细胞未长出肿瘤。结论羊水干细胞与胚胎干细胞相比，致瘤性低。
权利要求
一种猪羊水干细胞系的建立方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)羊水干细胞的原代分离培养；2)将分离培养的原代羊水干细胞进行机械分离纯化；3)将分离纯化后的羊水干细胞进行培养和检测，建立猪羊水干细胞系，其具体实现方式是3.1)待分离纯化后的羊水干细胞长至融合时，弃去培养液，用PBS洗2-3遍，然后用0.25％胰蛋白酶+0.04％EDTA细胞消化液在38℃条件下消化3-4分钟；3.2)等量细胞培养液中止消化；3.3)将经过消化的羊水干细胞在1000r/min离心5-10分钟；3.4)弃上清，计数，调整细胞浓度为1.0×105个/ml将细胞悬液接到培养皿上，加细胞培养液；3.5)连续培养4-8代后，上皮样细胞逐渐减少消失，90％以上表现为成纤维样细胞，细胞大量扩增，即建成羊水干细胞系。
2.根据权利要求1所述的猪羊水干细胞系的建立方法，其特征在于所述步骤1)的具 体实现方式是1.1)收集怀孕母猪的羊水，连同子宫带回，无菌打开子宫，分出由胎衣完整包裹的羊水 备用，测量胎儿的大小，详细记录，然后抽取羊水；1.2)用100目滤纱过滤，以除去较大的组织碎片，然后2000r/min，离心lOmin，弃上清， 收集细胞。1.3)将步骤2)中所收集的细胞加入含有5%血清+5%双抗的PBS溶液中，混勻，置 38°C,5% CO2培养箱中处理10分钟，然后离心，收集细胞，重复3次。1.4)将分离出的猪羊水细胞加入原代羊水细胞培养液接种于不同的培养皿中，置于 38°C>5% C02培养箱中培养。
3.根据权利要求2所述的猪羊水干细胞系的建立方法，其特征在于所述原代羊水细胞培养液是 α -MEM+15% FBS+10ng BFGF+2mmol/L 谷胺酰胺 +100u/ml 青霉素 +100u/ml 链 霉素的培养液。
4.根据权利要求1所述的猪羊水干细胞系的建立方法，其特征在于所述步骤2)的具体实现方式是2.1)将分离出的羊水细胞加入原代羊水细胞培养液三天后，观察细胞生长情况，并记 录原代细胞贴壁时间及贴壁细胞数；2. 2)五天后观察细胞生长情况，并半量换液；2. 3)在显微镜下用笔在培养皿上标记出上皮样细胞克隆的区域；2. 4)吸去培养液，用PBS洗1-2遍；2. 5)用细胞刮刀将上皮样细胞克隆刮掉，不要刮到成纤维样克隆，然后补加培养液，继续培养；或者用细胞刮刀将成纤维样克隆刮下，接到新的培养皿中，继续培养。
5.据权利要求1所述的猪羊水干细胞系的建立方法，其特征在于所述步骤3.4)中的细胞培养液是α -MEM+10% FBS+2mmol/L谷胺酰胺+100u/ml青霉素+100u/ml链霉素的培养液。
全文摘要
本发明提供了一种猪羊水干细胞系的建立方法，该方法包括以下步骤1)羊水干细胞的原代分离培养；2)将分离培养的原代羊水干细胞进行机械分离纯化；3)检测并将分离纯化后的羊水干细胞进行培养，建立猪羊水干细胞系，本发明提供了一种快速、有效、安全、分离猪羊水干细胞的方法，可为组织工程研究提供新的种子细胞来源以及有望作为种子细胞从事科研和生产应用。
文档编号C12R1/91GK101798566SQ20101001357
公开日2010年8月11日 申请日期2010年1月8日 优先权日2010年1月8日
发明者卢智娟, 张淑金, 成德, 王华岩, 高志敏 申请人:西北农林科技大学