一种猪克隆胚胎的高效制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种猪克隆胚胎的高效制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪体细胞克隆技术是一项复杂的技术，受诸多环节影响，如供体细胞、卵母细胞来 源、去核方法、融合激活、胚胎移植等，其中融合激活是克隆胚胎制备和供体核重编程启动 的关键因素，影响着克隆胚胎的发育和克隆猪的出生效率。只有供体细胞被激活，才能够使 已高度分化的供体细胞核重新编程，克隆胚胎才能开始发育。
[0003]目前常用的方法就是一次电击使体细胞融合卵子的同时激活体细胞。具体方法为 将构建好的克隆胚胎放在电极中间，然后施加2个100ys，1. 4kv/cm的直流电脉冲诱导融 合同时激活，转入含有化学物质的辅助激活液中，在培养箱中培养4h后体视显微镜下判定 融合。
[0004] 而现在对电激活的研宄主要集中于参数的优化，通过改变场强、脉冲时间和次数 的参数，来优化电激活的效率，或者改变融合激活液中成分等方案来提高融合激活效率，而 在电激活后，利用化学辅助激活来处理克隆胚胎也研宄较多，而所用药品如CB、6-DMAP和 CHX等。
[0005] 在现有的融合激活方案中，是施加一次电击，融合和激活同步进行，但激活时供体 细胞核尚未暴露在卵子胞质内，不利于核的重编程，降低了激活的效率。
【发明内容】
[0006] 基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种高效的猪克隆胚胎的 制备方法，该方法通过延迟融合激活而提高克隆效率。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明采取了如下具体的技术方案：
[0008] 一种猪克隆胚胎的高效制备方法，包括如下步骤：
[0009](3)、在成熟的去核猪卵母细胞中注入供体细胞，在无钙融合液中，电刺激使供体 细胞融合到去核卵母细胞内，培养1-1. 5h ;
[0010] ⑷、挑出已融合的胚胎，放入钙离子浓度为〇.lmmol/L的激活液内，电刺激激活 胚胎，即得猪克隆胚胎。
[0011] 在其中一些实施例中，步骤（1)中融合后于38. 5°C、5%二氧化碳、饱和湿度的培 养箱内培养1. 5h。
[0012] 在其中一些实施例中，步骤（1)中所述无钙融合液的配方为ManicolO. 25mol/L， MgCl2 ? 6H20 0.lmmol/L,HEPES0. 5mmol/L,PVA0.lg/L〇
[0013] 在其中一些实施例中，步骤（2)中所述激活液的配方为Manicol0. 25mol/L， CaCl2 ? 2H20 0?lmmol/L，MgCl2 ? 6H20 0?lmmol/L，HEPES0? 5mmol/L，PVA0.lg/L。
[0014] 在其中一些实施例中，所述供体细胞分离自公猪耳组织成纤维细胞。
[0015] 在其中一些实施例中，步骤（1)所述电刺激为2个160ys，1. 7kv/cm的直流电脉 冲。
[0016] 在其中一些实施例中，步骤（2)所述电刺激为2个80ys，1.6kv/cm的直流电脉 冲。
[0017] 本发明提供的猪克隆胚胎的高效制备方法，是在无钙融合液内，对猪克隆胚胎施 加一个直流电脉冲后，将胚胎放入培养箱培养1~1. 5h后，挑选出体细胞已融合到卵子的 胚胎，在钙离子浓度为〇.lmm〇l/L的激活液内，再施加一个直流电脉冲激活胚胎。与现有技 术相比，本发明具有以下有益效果：
[0018] 本发明先将供体细胞核融合到去核猪卵母细胞中并培养1~1. 5h，这样在激活 前，供体细胞核充分暴露在卵子胞质里，会使染色质长时间凝聚，促进核的重编程，有利于 胚胎的激活和发育，从而会显著提高克隆猪生产效率。该方法与常规的融合激活同步方法 相比，融合率差异不显著，但本方法克隆胚胎移植到受体猪后，克隆猪的生产效率大大高于 常规方法。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明实施例1中一种猪克隆胚胎的高效制备方法流程图。
【具体实施方式】
[0020] 以下结合具体实施例来详细说明本发明。
[0021] 以下实施例中的原料除特殊说明外，均来源于市售。
[0022] 实施例1 一种猪克隆胚胎的高效制备方法
[0023] 如图1所示，为本实施例的通过延迟激活获得猪克隆胚胎后，再获得克隆猪的方 法的流程图，包括以下步骤：
[0024] 1、猪卵母细胞收集及体外成熟培养
[0025] 屠宰母猪获取卵巢，放入加有各50yg/ml的青霉素和链霉素抗生素的37°C左右 的生理盐水内，5h内运回实验室，然后用加有各50yg/ml的青霉素和链霉素抗生素的生理 盐水冲洗3遍，用配有18G针头的10mL注射器抽取2~6mm的卵泡，在体视显微镜下用自制 捡卵针捡取卵丘-卵母细胞复合体（COCs)，用洗卵液洗3遍后，再用成熟培养液（基础成熟 液!^199购自6让〇〇公司，使用时添加10%猪卵泡液，10%胎牛血清，10以/1^6?，1(^/ mlhCG，10U/mlPMSG)洗2遍，然后放入已在C02培养箱内平衡4h以上的成熟培养液中，在 38. 5°C、5%C02、饱和湿度的培养箱中成熟培养44h。将成熟培养后的⑶Cs与0. 1%透明质 酸酶混合，用移液枪反复吹打除去卵丘细胞，去除卵丘细胞的卵母细胞挑选出卵周隙明显 且无杂质、胞质均匀、明显排出第一极体的卵母细胞进行克隆胚胎的构建。
[0026] 2、猪耳组织成纤维细胞培养
[0027] 将猪耳皮组织块剪碎后，用DMEM清洗组织碎片后用适量胎牛血清重悬并转移到 培养皿中，37°C、5%C02、饱和湿度环境中培养。5-7h后添加含10%胎牛血清的01^11培养 液，观察组织块周围细胞爬出情况，待细胞长至90 %汇合时传代培养。用第3-5代的接触抑 制的耳皮成纤维细胞作为核供体细胞。
[0028] 3、猪克隆胚胎构建
[0029] 成熟的卵母细胞使用显微操作仪采用盲吸法去除极体及附近1/3的胞质，以达到 去除卵母细胞核的目的，并注入一个供体细胞完成胚胎重构过程。将重构卵分批放入已经 铺满融合液（Manicol0? 25mol/L，MgCl2 ? 6H20 0?lmmol/L，HEPES0? 5mmol/L，PVA0?lg/ L)的融合槽内，使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，施加2个160ys，1. 7kv/ cm的直流电脉冲使体细胞融合到卵子里，然后将胚胎放入38. 5°C、5%二氧化碳、饱和湿度 的培养箱中培养1-1. 5h。1-1. 5h后将已融合的胚胎用钙离子浓度为0.lmmol/L激活液 (ManicolO. 25mol/L,CaCl2 *2H20 0.lmmol/L,MgCl2 *6H20 0.lmmol/L,HEPESO. 5mmol/L,PVA 0.lg/L)洗 3 遍后，放入妈离子浓度为 0.lmmol/L激活液（Manicol0. 25mol/L，CaCl2 *21120 0?lmmol/L，MgCl2 ? 6H20 0?lmmol/L，HEPES0. 5mmol/L，PVA0?lg/L)的融合槽内，施加 2 个 80ys，1. 6kv/cm的直流电脉冲激活胚胎，得到猪克隆胚胎。
[0030] 4、猪克隆胚胎移植到受体猪
[0031]将猪克隆胚胎用PZM3 培养液（自配：NaCl107. 89mmol/L、NaHC0325. 07mmol/L、 KC1 10mmol/L、KH2P040. 37mmol/L、MgS04 ? 7H20 0? 40mmol/L、sodiumpyrubate0. 20mmol/ L、Ca-lactate? 7H20 2mmol/L、L-glutaminelmmol/L、Hypotaurine5mmol/L、Penicillin G0? 17mmol/L、streptomycin0? 03mmol/L、BSA3g/L、EAA2%、NEAA1%、PhenolRed 0. 1 % )洗涤3遍，立即转入矿物油覆盖的含有CB的辅助激活液（添加5mg/LCB的PZM3) 中，在38. 5°C，5%C02，饱和湿度的培养箱内培养4h后使用手术法移植到受体猪内（每头 受体猪移植200-250枚克隆胚胎）。
[0032] 5、受体猪妊娠检测及克隆仔猪出生跟踪
[0033] 胚胎移植30天进行超声波妊娠检测，确定受孕的母猪跟踪其受孕情况，114天后 克隆仔猪出生，跟踪分娩窝数及仔猪个体数。
[0034] 对比例1
[0035] 按实施例1步骤1和步骤2的方法获得成熟的去核卵母细胞和供体细胞，再使用 常规融合激活同步方法构建猪克隆胚胎，按实施例1步骤4的方法将猪克隆胚胎移植到受 体猪，作为对照，胚胎移植30天进行超声波妊娠检测，确定受孕的母猪跟踪其受孕情况， 114天后克隆仔猪出生，跟踪分娩窝数及仔猪个体数。实施例1和对比例1的克隆猪的方法 对克隆效率的影响结果如表1所示。
[0036] 表1实施例1和对比例1的克隆方法对猪克隆效率的影响
【主权项】
1. 一种猪克隆胚胎的高效制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 、在成熟的去核猪卵母细胞中注入供体细胞，在无钙融合液中，电刺激使供体细胞 融合到去核卵母细胞内，培养1-1. 5h ; (2) 、挑出已融合的胚胎，放入钙离子浓度为0. lmmol/L的激活液内，电刺激激活胚胎， 即得猪克隆胚胎。
2. 根据权利要求1所述的猪克隆胚胎的高效制备方法，其特征在于，步骤（1)中融合后 于38. 5°C、5%二氧化碳、饱和湿度的培养箱内培养I. 5h。
3. 根据权利要求1或2所述的猪克隆胚胎的高效制备方法，其特征在于，所述供体细胞 分离自公猪耳组织成纤维细胞。
4. 根据权利要求1或2所述的猪克隆胚胎的高效制备方法，其特征在于，步骤⑴所述 电刺激为2个60 μ s，I. 7kv/cm的直流电脉冲。
5. 根据权利要求1或2所述的猪克隆胚胎的高效制备方法，其特征在于，步骤⑵所述 电刺激为2个80 μ s，I. 6kv/cm的直流电脉冲。
6. 根据权利要求1或2所述的猪克隆胚胎的高效制备方法，其特征在于，步骤（1)中 所述无钙融合液的配方为 Manicol 0· 25mol/L，MgCl2 · 6Η200· lmmol/L，HEPES 0· 5mmol/L， PVA 0.lg/L〇
7. 根据权利要求1或2所述的猪克隆胚胎的高效制备方法，其特征在于，步骤（2)中所 述激活液的配方为 Manicol 0· 25mol/L，CaCl2 · 2H20 0· lmmol/L, MgCl2 · 6H20 0· lmmol/L, HEPES 0. 5mmol/L, PVA 0.lg/L〇
【专利摘要】本发明公开了一种猪克隆胚胎的高效制备方法，在成熟的去核猪卵母细胞中注入供体细胞，在无钙融合液中，电刺激使供体细胞融合到去核卵母细胞内，培养1-1.5h；挑出已融合的胚胎，放入钙离子浓度为0.1mmol/L的激活液内，电刺激激活胚胎，即得猪克隆胚胎。本发明先将供体细胞融合到去核猪卵母细胞中并培养1-1.5h，这样在激活前，供体细胞核充分暴露在卵子胞质里，会使染色质长时间凝聚，促进核的重编程，有利于胚胎的激活和发育，从而会显著提高克隆猪生产效率。该方法与常规的融合激活同步方法相比，融合率差异不显著，但本方法克隆胚胎移植到受体猪后，克隆猪的生产效率大大高于常规方法。
【IPC分类】C12N15-877
【公开号】CN104651407
【申请号】CN201510067003
【发明人】吴珍芳, 石俊松, 罗绿花, 周荣, 纪红美, 蔡更元, 贺晓燕
【申请人】广东温氏食品集团股份有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月6日