一种大菱鲆肌肉细胞系的建立方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种大菱鲆肌肉细胞系的建立方法。
【背景技术】
[0002]大菱鲆1992年由中国黄海水产研宄所从英国引进，1999年大规模生产获得成功后，在北方沿海推广养殖，成为海水养殖的重要对象。至今，大菱鲆养殖已经发展成为年产量超过6万吨的北方海水养殖支柱产业。
[0003]作为肉食性鱼类，大菱鲆饲料需求蛋白量为42 %。而作为其优质蛋白源鱼粉年产量受限，制约了产业的进一步发展。为了保证中国水产养殖业稳定安全的发展，迫切寻找替代鱼粉的蛋白源。涉及的新蛋白源包括植物蛋白、动物蛋白、微生物蛋白。多年以来，围绕蛋白源替代开展了多方面的研宄，技术集成与加工处理在一定程度上实现了鱼粉部分替代之后，却长期陷入不能进一步提高鱼粉替代水平的瓶颈。其根本原因是过分关注蛋白源替代后鱼类的生理、病理表现，缺忽略了其深层次的分子机理。为了深入研宄蛋白源替代后鱼类生长性能下降的分子机理，必须构建相应的肌肉细胞系。
[0004]因此，建立大菱鲆肌肉细胞系，能探宄氨基酸与细胞生长信号通路机理，从而能在分子层次解释非鱼粉蛋白源氨基酸不平衡导致的生长性能下降的原因，进而为改善蛋白源替代提供方向。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的问题便是利用大菱鲆肌肉组织，提供一种大菱鲆肌肉细胞系的构建方法，从而弥补现有技术的不足
[0006]本发明的大菱鲆肌肉细胞系的建立方法，包括如下的步骤:
[0007]I)原代细胞培养:将大菱鲆幼鱼的背部肌肉用DMEM培养基清洗后进行剪切，将组织块再用添加有抗生素的DMEM培养基进行清洗；
[0008]将清洗后的组织块用含有胶原酶的DMEM培养基进行消化，消化3-8min后，离心弃掉上清，使用DMEM培养基进行重悬清洗，离心后弃上清；
[0009]使用添加有胰蛋白酶的DMEM培养基对组织块再次进行消化，消化后离心，收集上清液；沉淀用完全生长培养终止胰酶消化，清洗后用完全生长培养基重悬沉淀，使用细胞筛过滤，收集过滤液后移入之前收集的上清液中；再次离心获得沉淀；
[0010]使用完全生长培养基重悬细胞沉淀，种入细胞培养平板中放入无二氧化碳的24°C培养箱中培养；
[0011]所述的含有胶原酶的DMEM培养基，其中胶原酶的浓度为0.2% ；
[0012]所述的添加有抗生素的DMHM培养基，其中抗生素为青霉素和链霉素，添加浓度为100单位/mL of青霉素，100 μ g/mL of链霉素；
[0013]所述的完全生长培养基为:L15培养基含有20%胎牛血清，100units/mL of青霉素，100 μ g/mL of链霉素，4.76g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，2.5ng/ml成纤维细胞生长因子
[0014]2)细胞传代
[0015]待细胞长满平板后进行传代，传代8次以后，将完全生长培养基中胎牛血清的含量降低为10%，传代30次后完成细胞系的制备。
[0016]本发明的优点在于:
[0017]1.构建的大菱鲆肌肉细胞系能传代培养，能快速获得大量的肌肉细胞，用于探宄鱼类生长的基础研宄。
[0018]2.优化启动原代培养的方案，能有效排除组织中细菌污染导致失败。
[0019]3.比起传统的组织块培养法，本发明所使用的单细胞法启动原代培养更快。所得到细胞更能代表源组织性状。
[0020]4.低等动物所建立的细胞系往往难以转染，限制了基础研宄。而本细胞系能用于转染表达蛋白，转染率高，表达蛋白效率高。
【具体实施方式】
[0021]目前构建细胞系大多数使用组织块法，组织块法制备速度慢，而且依靠细胞迀出而获得的细胞往往不能代表源组织性状。而单细胞法绝大多数使用单纯的胰酶裂解组织获得单细胞，这样会导致细胞从组织块中掉落下来后长时间暴露在胰酶消化作用和不适合生存的缓冲液中受到损伤。细胞受损便很难以恢复，使获得细胞状态差。而本发明使用胶原酶和胰酶联合多次消化，创造性的将消化酶和无血清培养基混合，让细胞在消化下来后能在合适的缓冲液中短暂生存，并且完成最终的收集纯化。
[0022]为了更好的阐释本发明，以下结合实施例进一步阐明本发明的主要内容。
[0023]实施例1
[0024]I)培养基的制备
[0025]DPBS, DMEM,青霉素 & 链霉(100X)素均购于 Gbico
[0026]高双抗的DPBS:在DPBS中加入4%青霉素&链霉素溶液(100X)
[0027]高双抗的DMEM:在DMEM中加入4%青霉素&链霉素溶液(100X)
[0028]含有胶原酶的DMEM:称0.2g胶原酶溶于DMEM中。
[0029]含有胰蛋白酶的DMEM:使用0.25%胰蛋白酶溶液和DMEM按照1:1混合
[0030]完全成长培养基:在L15培养基中加入20%胎牛血清，100units/mL of青霉素，100 μ g/mL of链霉素，4.76g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，2.5ng/ml成纤维细胞生长因子
[0031]2)启动原代培养
[0032]取健康大菱鲆幼鱼(5g左右)断尾弃血，放入75%酒精中30s。使用含有高双抗DPBS冲洗鱼体表面以去除酒精，然后放入解剖盘中。用解剖刀刮去鱼体表面粘液和鱼皮，取小块背肌，移入装含有高双抗的DMEM离心管中。把离心管移入超净台，吸弃液体，再重新加入含高双抗的DMEM。将离心管内容倒在6cm细胞培养平板上，用解剖刀将肌肉块切成小碎块(约Icm3)。用移液枪吸取小碎块移入15ml离线管中(可剪掉枪头前端防止碎块堵枪头)。待小碎块沉淀至离心管底部，弃去上清。重新加入高双抗的DMEM 5ml (此过程为了洗去组织碎块间的杂质，重复2次)。吸去上清，加入含有胶原酶的DMEM室温消化80分钟，300g, 5min弃去上清。加入5ml含胰蛋白酶的DMEM消化10分钟，4°C，300g，Imin离心。吸上清，移入50ml离心管中，加入5ml含血清生长培养基终止消化反应，重复I次。使用含血清生长培养基重悬沉淀，将沉淀使用100 μ m细胞筛过滤，收集过滤液体加入装有上清液体的50ml离心管中。300g，20min，4°C离心。弃上清，使用完全生长培养基重悬细胞。细胞计数后，稀释至1.5X106cells/ml种入细胞培养平板上。放入无二氧化碳24°C培养箱中培养。使用此方法启动原代培养，细胞能在6h内贴壁，48h后开始生长。72小时便可长满培养平板。
[0033]3)传代培养
[0034]待细胞的覆盖率达到90%左右，将培养基和胰酶在24°C中预热30min以上。对于1cm的细胞培养平板:吸走原培养基，以Iml胰酶润洗培养基几秒钟，以除去血清对胰酶的抑制作用。再加入2ml胰酶处理约4?5min，在倒置显微镜下观察，待大部分细胞收缩变圆，加入完全生长培养基终止反应。根据需要可按1/2?1/4传代培养。1/2传代约24h内长满平板，而1/4传代约48h长满平板。
[0035]4)细胞冻存与复苏
[0036]使用上述方法将细胞洗下来，4°C，500g，5min离心。弃上清，使用预冷4ml细胞冻存培养基重悬。分装入细胞冻存管中，每个lml。放入程序降温盒中_80°C过夜，随后移入-150°C深低温冰箱长期冻存。将完全生长培养基预热至24°C，倒入细胞1cm细胞培养平板上。将冻存细胞从深低温冰箱中取出后，可放入液氮中转移进入细胞房。随后将冻存管放入24°C水浴约90s，待细胞冻存管只剩零星小冰块时移入超净台。一个冻存管可以解冻于一个1cm细胞培养平板上。待约12h细胞贴壁后，换上新的完全生长培养基，以移除未贴壁的死细胞和二甲基亚砜。待细胞长满平板后，即可传代培养。细胞复苏后，需要传代2?3次，以移除解冻过程中对细胞产生的胁迫，才可相应的实验。目前该细胞系已经传至38代，状态良好稳定，而在会出现细胞融合等肌肉细胞典型的性质，表明本细胞系更能代表源组织性状。
【主权项】
1.一种大菱鲆肌肉细胞系的建立方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤: 1)原代细胞培养:将大菱鲆幼鱼的背部肌肉用DMEM培养基清洗后进行剪切，将组织块再用添加有抗生素的DMEM培养基进行清洗； 将清洗后的组织块用含有胶原酶的DMEM培养基进行消化，消化3-8min后，离心弃掉上清，使用DMEM培养基进行重悬清洗，离心后弃上清； 使用添加有胰蛋白酶的DMEM培养基对组织块再次进行消化，消化后离心，收集上清液；沉淀用完全生长培养终止胰酶消化，清洗后用完全生长培养基重悬沉淀，使用细胞筛过滤，收集过滤液后移入之前收集的上清液中；再次离心获得沉淀； 使用完全生长培养基重悬细胞沉淀，种入细胞培养平板中放入无二氧化碳的24°C培养箱中培养； 2)细胞传代 待细胞长满平板后进行传代，传代8次以后，将完全生长培养基中胎牛血清的含量降低为10%，传代30次后完成细胞系的制备。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有胶原酶的DMEM培养基，其中胶原酶的浓度为0.2%。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的添加有抗生素的DMHM培养基，其中抗生素为青霉素和链霉素。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的青霉素的添加浓度为100单位/mL。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的链霉素的添加浓度为100μ g/mL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的完全生长培养基为含有20%胎牛血清，100unitsv/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素，4.76g/L 4-轻乙基呢嘆乙磺酸，2.5ng/ml成纤维细胞生长因子的L15培养基。
【专利摘要】本发明公开了一种大菱鲆肌肉细胞系的构建方法。它以大菱鲆肌肉组织为材料，使用单细胞法启动原代培养。在含有胎牛血清、成纤维生长因子的L15培养基中培养，采用胰蛋白酶消化法传代培养。可使用含有DMSO的冻存培养基冻存。此发明构建的大菱鲆肌肉细胞系已经传35代，生长迅速稳定，可提供大量细胞用于营养、免疫、环境毒性、基因功能分析等研究。
【IPC分类】C12N5-077, C12R1-91
【公开号】CN104830760
【申请号】CN201510292390
【发明人】何艮, 江浩文, 麦康森, 周慧慧, 王旋
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年6月1日