一种快速筛选鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的方法
【专利摘要】本发明涉及海水鱼类养殖和育种技术领域，具体地说是一种基于动态法无损快速筛选鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的方法。将待筛选群体/家系个体，经荧光标记后，以0.5?1℃/h的速率逐渐升高培养温度，观察鱼的游泳状态变化，记录其丧失翻身能力时的温度，即为鲆鲽鱼类可耐受的临界高温水平(critical thermal maximum，CTM)，统计分析各群体/家系的CTM值。CTM高者为耐高温群体/家系；CTM水平无统计学差异，即为相同耐高温能力的群体/家系。本发明操作过程简单、快速，检测成本低，同时有效避免了筛选期间的个体死亡，实现了鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的无损快速筛选。
【专利说明】
一种快速筛选鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的方法
技术领域
[0001]本发明涉及海水鱼类养殖及育种技术领域，具体地说是一种基于动态法无损快速筛选鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的方法。
【背景技术】
[0002]牙鲆和大菱鲆等鲆鲽鱼类是我国重要的海水经济养殖鱼种，但其在夏季期间生长速度明显降低。目前，养殖生产上多利用深层海水作为冷水源来降低水体温度，从而减弱夏季高温对鲆鲽鱼类生长的影响，但这增加了养殖企业的生产成本，而且也对海洋生态环境造成了潜在的影响。因此，亟需开展鲆鲽鱼类耐高温品系的选育。
[0003]对鲆鲽鱼类耐高温能力的评估是耐高温品系选育中的重要基础，然而目前相关研究和生产实践中主要依赖静态法进行，即比较各群体/家系在高温条件下的死亡时间和死亡率差异筛选耐高温群体/家系。这种传统方式筛选时间成本较大，所需时间短则几天，长则数周甚至数月，而且用于筛选的个体最终大多死亡(死亡率多高于50%)，不仅造成了一定的养殖经济损失，而且导致静态法不适用于甚至不能用于数量较少群体/家系的耐温性状鉴定。近年来，微卫星和AFLP等分子标记技术虽在鲆鲽鱼类耐高温性状的研究中得到了应用，但该法操作较为繁琐，标记筛选效率低，更为重要的是该法检测的样本量大，以50个群体/家系(每个群体/家系选取20尾计算)为例，则需要至少分析1000例样本，同时其检测费用较为昂贵，检测周期较长，这成为分子标记技术在实际生产中极少应用的重要原因。因此，建立一种无损快速评价方法，已成为生产上筛选鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的迫切需求。与传统静态法相比，动态法是一种快速评价物种耐温能力的方法，可显著降低筛选的时间成本，目前这一方法已被用于不同鱼种或甲壳类耐高温性状的比较，但利用该法进行同一鱼种耐高温群体/家系的筛选尚未见报道。因此，建立基于动态法进行鲆鲽鱼类群体/家系耐高温能力的评价方法，对促进鲆鲽鱼类耐高温养殖及育种研究和应用具有十分重要的作用。
【发明内容】
[0004]本发明主要针对上述现有技术的缺点，提供一种基于动态法无损快速筛选鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的方法。
[0005]为实现上述目的，本发明采用技术方案为:
[0006]—种快速筛选鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的方法，将待筛选群体/家系个体荧光标记后，以0.5-l°C/h的速率逐渐升高培养温度，观察鱼的游泳状态变化，记录其丧失翻身能力时的温度，即为鲆鲽鱼类可耐受的临界高温水平(critical thermal maximum，CTM)，统计分析各群体/家系的CTM值。CTM高者为耐高温群体/家系；CTM水平无统计学差异，即为相同耐高温能力的群体/家系。
[0007]选取待筛选的鲆鲽鱼类群体/家系，从每个家系中随机选取体色正常的健康个体，以荧光标记颜色一标记部位组合方式对家系进行标记后，将所有群体/家系均分混养，暂养驯化3?5d，期间保持水温恒定，连续充氧，待用。
[0008]待筛选群体/家系个体荧光标记后，其培养水温以0.5-l°C/h的速率逐渐升高，在此期间，观察鱼的游泳状态变化，记录其丧失翻身能力时的温度，即为鲆鲽鱼类可耐受的临界高温水平CTM，记录此时的温度水平(CTM)，并将鱼捞出转移至常温海水中以恢复正常；比较各群体/家系的CTM值。CTM高者为耐高温群体/家系；CTM水平无统计学差异，即为相同耐高温能力的群体/家系。
[0009]所述观察鱼的游泳状态变化采取轻搅水体，鱼的反应明显较小时，利用工具小心将其翻身，以Imin内鱼体不能恢复至正常身体状态为标准，升温初期观察频率低，后期逐渐加大。
[0010]本发明的优点和积极效果如下:
[0011]I)本发明将动态法在生物耐温能力评价中的应用引入鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的筛选。基于动态法的耐高温能力评价方法，可极为简单、快速地区分鲆鲽鱼类群体/家系耐高温能力差异；
[0012]2)以往的耐高温鱼类筛选是在致死温度水平上开展，不仅周期时间长，而且实验动物多不能存活，限制了在家系数量少这一情况下的应用。本发明基于动态法原理进行鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的筛选，极大缩减了筛选时间成本，而且证实可有效避免筛选期间鱼类的死亡，从而使数量较少的群体/家系也能用于耐高温筛选。
【附图说明】
[0013]图1A为本发明实施例提供的传统静态法测定的3个大菱鲆家系在高温下的存活时间图。其中F1、F2和F3分别表示大菱鲆家系1、家系2和家系3，柱体上不同小写英文字母表示差异显著；
[0014]图1B为本发明实施例提供的动态法测定的3个大菱鲆家系在高温下的存活时间图。其中F1、F2和F3分别表示大菱鲆家系1、家系2和家系3，柱体上不同小写英文字母表示差异显著。
【具体实施方式】
[0015]本发明基于动态法原理，建立评价鲆鲽鱼类群体/家系耐高温能力的无损方法，避免了筛选导致的鱼类死亡，极大降低了筛选时间成本，为鲆鲽鱼类耐高温等抗逆性状的研究提供了有力的技术支持。
[0016]具体地说是一种基于动态法判定生物耐温能力的原理，实现鲆鲽鱼类耐高温群体/家系无损快速筛选的方法。选择不同的群体/家系，经标记、混养后，控制水温以不超过I°c/h的速率逐渐升高，直至鱼体丧失翻身能力，并记录此时的温度水平;统计各群体/家系耐受的临界高温水平(critical thermal maximum,CTM)，并对各群体/家系进行排序，CTM值高表示耐高温能力强，从而筛选获得鲆鲽鱼类耐高温群体/家系。
[0017]具体，
[0018]I)群体/家系标记混养
[0019]选择所要评估的鲆鲽鱼类群体/家系，从每个家系中随机选取体色正常的健康个体，以荧光标记颜色一标记部位组合方式对家系进行标记后，将所有群体/家系均分至4个实验缸中；
[0020]2)动态法筛选
[0021]将标记好的家系进行3?5d适应，期间保持水温恒定，连续充氧。实验开始后，以控温装置控制水温以不超过l°C/h的速率匀速升高；
[0022]3)鱼体状态监测
[0023]升温过程中，采取“前松后紧”(即升温初期观察频率低，后期逐渐加大)的观察策略。当轻搅水体，鱼的反应明显较小时，利用鱼网等工具小心将其翻身，以Imin内鱼体不能恢复至正常身体状态为标准，记录此时的温度水平(CTM)，并将鱼捞出转移至常温海水中以恢复正常;统计分析各群体/家系的CTM值，排序确定各家系耐温能力差异(CTM值与群体/家系耐温能力呈反比)。
[0024]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例是本发明一部分实施例，但不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前题下所获得所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]实施例:
[0026]I)家系选择
[0027]确认各个家系的月龄和体尺寸(如体重和全长)等背景信息，选取3个大菱鲆家系(分别标记为Fl、F2、F3)进行动态法耐高温能力的判别；
[0028]2)家系标记
[0029]从每一家系中，观察并小心捞取体色正常的健康个体32尾，置于60mg/L的间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)溶液中麻醉lOmin，然后轻放于平板上，取制备好的荧光标记注射针，对每一家系个体进行嵌入性荧光标记，3个家系分别进行尾部红色、黄色和蓝色荧光标记。
[0030]3)家系混养
[0031 ]将标记后的家系随机均分至4个实验缸中，每缸作为一个实验重复，确保每缸每个家系有8尾。然后，所有家系于恒温条件下进行至少3?5d的环境适应，期间保持流水(每小时换水量为0.5m3)，连续充氧(>6mg/L)，水温(To)由控温装置维持稳定，其中To可根据鱼种进行适当调整，本实施例中为17 °C ;
[0032]4)动态法筛选
[0033]实验开始前，再次检测水温(To)。在此基础上，利用控温装置以TC/h速率匀速升高，并密切观察鱼的状态变化。在升温至30°C后，利用渔具轻搅水体，若鱼无明显反应，小心将其翻身(鲆类:使其右侧身体朝上;鲽类:使其左侧身体朝上)；当鱼在Imin内无法恢复至正常身体状态时，记录此时的温度水平，即为鱼可耐受的临界高温水平(CTM)。
[0034]5)数据采集和分析
[0035]将数据录入Excel，以AVERAGE函数计算每一家系每一实验重复的CTM平均值，进而以AVERAGE函数计算每个家系4个实验重复的CTM平均值，最终获得该家系的CTM值。将所有家系实验重复的CTM均值录入SPSS统计软件中，选择“分析”一一“比较均值”一一“单因素方差分析(one-way AN0VA)”，在“多重比较”选项中选择“Ducan”，从而进一步分析不同家系的CTM差异。
[0036]本实施例中，3个大菱鲆家系的CTM值分别为32.5 °C (FI)、32.3 °C (F2)和31.6 °C(F3)，由于CTM值与家系耐高温能力呈正比，初步判断3个大菱鲆家系耐高温能力顺序为:Fl>F2>F3oSPSS 20.0统计分析进一步确认，Fl和F2的CTM值差异不显著，而二者均高于F3。综合判明，Fl和F2的耐高温能力相近，而且均高于F3(参见图1A)。本实施例结果与传统静态法筛选结果(参见图1B)—致。
[0037]本发明建立的基于动态法的评价体系，不仅操作过程极为简单，筛选所需时间较短(<24h)，而且筛选效果好，实现了鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的快速筛选;并避免了筛选期间鲆鲽鱼类的死亡，实现了鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的无损筛选。
【主权项】
1.一种快速筛选鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的方法，其特征在于:将待筛选群体/家系个体荧光标记后，以0.5-1 °C/h的速率逐渐升高培养温度，观察鱼的游泳状态变化，记录其丧失翻身能力时的温度，即为鲜鱗鱼类可耐受的临界高温水平(critical thermalmaximum，CTM)，统计分析各群体/家系的CTM值，CTM高者为耐高温群体/家系;CTM水平无统计学差异，即为相同耐高温能力的群体/家系。2.按权利要求1所述的快速筛选鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的方法，其特征在于:选取待筛选的鲆鲽鱼类群体/家系，从每个家系中随机选取体色正常的健康个体，以荧光标记颜色一标记部位组合方式对家系进行标记后，将所有群体/家系均分混养，暂养驯化3?5d，期间保持水温恒定，连续充氧，待用。3.按权利要求1或2所述的快速筛选鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的方法，其特征在于:待筛选群体/家系个体荧光标记后，其培养水温以0.5-1 °C/h的速率逐渐升高，在此期间，观察鱼的游泳状态变化，记录其丧失翻身能力时的温度，即为鲆鲽鱼类可耐受的临界高温水平CTM，记录此时的温度水平(CTM)，并将鱼捞出转移至常温海水中以恢复正常；比较各群体/家系的CTM值;CTM高者为耐高温群体/家系;CTM水平无统计学差异，即为相同耐高温能力的群体/家系。4.按权利要求3所述的快速筛选鲆鲽鱼类耐高温群体/家系的方法，其特征在于:所述观察鱼的游泳状态变化采取轻搅水体，鱼的反应明显较小时，利用工具小心将其翻身，以Imin内鱼体不能恢复至正常身体状态为标准，升温初期观察频率低，后期逐渐加大。
【文档编号】A01K61/00GK106069897SQ201610422052
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月13日 公开号201610422052.7, CN 106069897 A, CN 106069897A, CN 201610422052, CN-A-106069897, CN106069897 A, CN106069897A, CN201610422052, CN201610422052.7
【发明人】路允良, 吴志昊, 宋宗诚, 尤锋
【申请人】中国科学院海洋研究所, 威海圣航水产科技有限公司