牙鲆f3代生长快纯系构建方法
【专利说明】牙鲆F3代生长快纯系构建方法
[0001] 一、技术领域：本技术属于海洋生物技术领域，是一种选择、诱导和培育牙鲆优良 纯系的育种方法。 二、
【背景技术】：
[0002] 牙鲜（Paralichthys olivaceus)是分布在我国沿海的主要经济鱼类，是天然捕 捞、工厂化、池塘和网箱养殖的主要对象，年产量达到26477. 5t，占鲆鲽类产量的30% (上 海海洋大学，杨正勇，2009)，在鲆鲽鱼类产量中占有较大的比重。但是随着牙鲆养殖产业的 迅速扩大，牙鲆种质出现了诸多问题，如：生长速度慢、各种病害频繁发生（如：纤毛虫病、 淋巴囊肿病、鳗弧菌病、白化病等）、养殖周期长、养殖效率低，严重影响了牙鲆苗种大面积 养殖推广和产业化的发展。因此利用牙鲆不同地理群体及人工筛选的育种核心群体进行牙 鲆选择育种，构建具有优良生长和抗逆性状的牙鲆优良纯系，进而培育牙鲆优良品种，对于 牙鲆种质恢复、提高养殖产品质量和经济效益、推动我国鲆鲽鱼类养殖产业化发展具有重 要意义。在牙鲆养殖新品种的研宄方面，Kanako Fuji等筛选培育出一个能够抗病淋巴囊肿 病的养殖群体（Faculty of Marine Science,Tokyo University of Marine Science and Technology，Kanako Fuji et al，Aquaculture，2006)。近年来本课题组收集和建立了大量 的牙鲆育种核心群体，建立了大量的牙鲆家系，而且筛选出具有生长快、成活率高等优良性 状的牙鲆家系（中国水产科学研宄院黄海水产研宄所，田永胜等，水产学报，2009 ;海洋学 报，2011)，2010年培育出我国牙鲆杂交新品种"鲆优1号"（全国水产技术推广总站，2011)。 牙鲆优良纯系构建对于继续培育具有生长快、抗逆力强等不同优良性状的牙鲆新品种具有 重要的作用，但牙鲆优良纯系构建是一项综合和复杂的技术，目前在国内外还未见报道。 三、
【发明内容】
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[0003] 主要包括如下几个方面：1、牙鲆Fl代生长快家系的建立和筛选，2、牙鲆F2代生长 快优良家系的建立和筛选，3、牙鲆F3代有丝分裂纯系的诱导建立，4、牙鲆F3代减数雌核发 育纯系的诱导建立，5、牙鲆纯系的遗传检测。
[0004] 1、牙鲆Fl代生长快家系的建立和筛选
[0005] 利用牙鲆抗鳗弧菌病群体（RS)、日本牙鲆群体（JS)和黄海牙鲆群体（YS)在繁殖季 节进行人工定向交配，交配方式为：RS(NS?、RS办RS$、RS办YS?、JS办RS$、JS(?xJS?、YS办RS$、 YS(?xJS$。建立牙鲆家系，家系在生长到平均日龄至90、524d左右，对每个家系的体长、体重进行 了测量，利用单因素方差分析及Student-Newman-Keuls (SM)法对不同家系生长性状进行多重比 较，分析家系间的生长差异。同时计算绝对增重率（AG%，g. (T) = (W2-W1) At2I1)，通过增重率 比较筛选出生长快的家系F0750。
[0006] 2、牙鲆F2代生长快优良家系的建立和筛选
[0007] 将筛选获得的F0750、韩国牙鲆群体(KS)、日本牙鲆群体（JS)、牙鲆抗鳗弧菌病群体（RS) 培育到性成熟，在繁殖季节进行定向人工繁殖交配，繁殖方式为KS?^F0750?、IS々<KS?、RS(>KS?、 F0750(?xF0750$、KScJxRS?,建立了牙鲆家系，在家系生长到164天和340天时测量其体￡利用单 因素方差分析及Student-Newman-Keuls (SNK)法对不同家系体重进行多重比较，分析家系间的生长 差异。利用绝对增重率(AGi;，g· (T) = (W2-W1)/(t2-g公式，对每个家系生长绝对增重率进行计算， 依据绝对增重率对所有家系的生长速度进行了排序，筛选出生长最快家系F09119
[0008] 3、牙鲆F3代有丝分裂纯系的诱导建立
[0009] 预先采集成熟的鲈鱼精子，利用MPRS+20%DM0S溶液以体积比I : 1的比例稀 释鲈鱼精子，采用2. Oml冷冻管在液氮中冷冻保存，建立鲈鱼精子冷冻库，MPRS溶液的各 成分浓度为：NaCl 60. 35mM，NaH2PO4L 8mM ;NaHC03 3mM，KCl 5. 23mM，CaCl2. 2H20 I. 13mM， MgCl2. 6H20 I. 13mM，D-Glucose 55. 55mM。DMSO 为市售二甲基亚砜。
[0010] 将H)9119培育至性成熟，利用人工挤压腹部的方式获得其成熟的未受精卵。随 之利用37°C水浴解冻鲈鱼精子，利用MPRS稀释液将精子以I : 10的比例稀释，在直径为 IOcm的培养皿中加入1ml稀释精液铺平，在40000 μ J/cm2强度紫外线下照射，使其遗传物 质失活，加入牙鲆卵中进行干法授精，受精卵与精液比为100 : 0.4。在水温17°C下，受精 后58min，利用静水压机将压力调整到590kg/cm2,静水压处理时间为6min，诱导受精卵进行 有丝分裂雌核发育，获得纯系F1346。
[0011] 4、牙鲆F3代减数雌核发育系的诱导建立
[0012] 将优良家系H)9119培育至性成熟，利用人工挤压腹部法采集未受精卵。随之利用 37°C水浴解冻鲈鱼精子，利用MPRS稀释液将精子以I : 10的比例稀释，在直径为IOcm的 培养皿中加入1ml稀释精液铺平，在40000 μ J/cm2强度紫外线下照射，使其遗传物质失活， 加入牙鲆卵中进行干法授精，受精卵与精液比为100 : 0.4,授精3min后浸入2-4°C海水中 冷休克处理45min，使其染色体加倍，然后将卵放入17°C海水孵化，获得牙鲆减数雌核发育 系F1324。至此完成了牙鲆优良纯系的构建，使优良家系的基因进一步纯化，达到建立优良 纯系的目的。
[0013] 5、牙鲆纯系的遗传检测
[0014] 将牙鲆纯系F1346、F1324培育到10-15cm，分别随机选取30尾个体剪 取尾鳍条，利用酚氯仿法提取DNA，选择牙鲆遗传连锁图谱21号连锁群上的微卫 星标记 scaffold288_1492 做为引物，引物序列 F :AGTGGATTAGCGTGGTGGATAC，R : AGATCAGTGTGGTCAAGGTGG ;通过PCR对其DNA扩增，8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测牙鲆 纯系的基因型。 四、
【附图说明】
[0015] 图1和图2分别为牙鲆生长快家系R)9119的减数雌核家系（F1324)和卵裂雌核家 系（F1346)后代基因型电泳图，利用微卫星标记（scaffold288_1492)检测后代个体都为 纯合子，后代中分别有16个AA基因型和14个BB基因型。图3为R)9119近交家系（F1313) 后代基因型电泳图，父母本基因型为AC和BC，30个子代中2个AB型，10个AC型，12个BC 型，5个为CC型。 五、
【具体实施方式】
[0016] 1、牙鲆Fl代生长快家系建立和筛选
[0017] 利用牙鲆抗鳗弧菌病群体（RS)、日本牙鲆群体（JS)和黄海牙鲆群体（YS)在繁殖季 节进行人工定向交配，交配方式为：RScNS$、RS办RS?、RS办YS?、】S(^RS?、JScNS?、财xYS?、YS办RS?、 YSc^xJS?,建立了家系59个。
[0018] 建立牙鲆家系在生长到平均日龄至90、524d左右，对每个家系的体重进行了测 量，利用单因素方差分析及Student-Newman-Keuls(SNK)法对不同家系生长性状进行多重 比较，分析家系间的生长差异。利用绝对增重率（AGR w，g. Cf1) = (W2-W1Va^t1),对每个家 系生长90d至524d绝对增重率进行了计算，平均日龄按286(1计算（表1)，依据绝 对增重对所有家系的生长速度进行了排序，筛选出F0750家系生长最快。
[0019] 表1.牙鲆Fl代家系平均体重及绝对增重率比较
[0022] 注：*在生长方面具有显著性差异（P < 0· 05)
[0023] 2、牙鲆F2代生长快优良家系的建立和筛选
[0024] 将筛选获得的R)750、韩国牙鲆群体（KS)、日本牙鲆群体（JS)、牙鲆抗鳗弧菌 病群体（RS)培育到性成熟，在繁殖季节进行定向人工繁殖交配，方式如表2,建立了 22个牙鲆家系，在家系生长到164天和340天时测量其体重，利用单因素方差分析及 Student-Ne