专利名称：鱼类的盾纤虫病预防治疗疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及对盾纤虫病(scuticociliatosis)的预防或治疗有效的疫苗。
背景技术：
盾纤虫病是一种鱼类寄生虫病，在日本于1990年首次确认在牙鲆(t，^ )中发病。日本2004年的养殖牙鲆产值为约93亿日元。这其中有约20%来自爱媛县，而该县的鱼类病指导中心报告的牙鲆鱼病诊断件数中，盾纤虫病的诊断率一年间高至15 20%左右，据推测，该病的死亡率为30 70%。对牙鲆养殖业而言，该病已经成为重要的鱼类病， 但现状是，针对该病的治疗、预防方法尚未建立，甚至有从业者因发生该病而不得不放弃牙鲆养殖业。此后，不仅在日本国内，在韩国也确认有牙鲆养殖场发生该病。因此，该病是牙鲆养殖现场最希望进行研究的感染症。目前为止，已经报告作为该病的原因的盾纤毛虫是海洋尾丝虫⑴ronema marinum)，而此后又从患盾纤虫病的牙鲆中分离出了各种种类的盾纤毛虫。
近年来，发明人的小组进行了形态学上和基因上的鉴定，结果明确了舌齿鲈嗜污虫(Philasterides dicentrarchi,P. Dicentrarchi) (i亥学名与贪食可密虫(Miamiensis avidus)是同义词)是该病的主要原因(非专利文献1)。进一步，发明人的小组通过使用舌齿鲈嗜污虫进行的实验感染，确认了该虫对牙鲆的高病原性(非专利文献2)。
为了驱除包括该舌齿鲈嗜污虫在内的盾纤毛虫，试验了各种治疗方法。例如，利用福尔马林等的浸渍已确认有杀虫效果(非专利文献幻，而利用含过氧化氢的药浴的治疗方法也已确认有效果(专利文献1)，但是，对于舌齿鲈嗜污虫的情况，其为内部寄生性，会侵入宿主鱼类的脑内，因而还不能说取得了充分的效果。
在这种情况下，有报告报道了该虫的福尔马林灭活疫苗对盾纤虫病是有效的(专利文献2、非专利文献4和幻，以及利用缺少特定金属的淡水浴的预防-治疗方法(专利文献3) ο 现有技术文献 专利文献 专利文献1 专利第3882939号说明书 专利文献2 国际公开第W02008/084125号公报 专利文献3 特开2006-306834号公报 非专利文献 非专利文献1 平成16年度日本魚病学会大会講演要旨集，65页，2004年 非专利文献 2 :Diseases of Aquatic 0rganisms、73 卷，227 234 页，2007 年 非专利文献3 愛媛県水産試験埸研究報告，第6号，65 70页，1997年 非专利文献4 平成17年度日本魚病学会大会講演要旨集，A-29，37页，2005年 非专利文献5 Journal of Fish Pathology,(韩国)，19 卷，2 号，173 181 页， 2006 年
发明内容
发明所要解决的问题 然而，即使是被认为对盾纤虫病有效的传统疫苗，其效果也不能说是充分的，希望开发有效性更高的疫苗。特别是，在本发明中，发明人的小组明确了舌齿鲈嗜污虫存在3种血清型，采用单一的疫苗无法预防其它血清型的该虫的感染。因而，本发明的目的是对于盾纤虫病、特别是死亡率高的舌齿鲈嗜污虫的感染能够有效地进行预防、治疗的疫苗。
解决问题的方法 发明人进行了深入研究，结果发现将由3种不同血清型的该虫获得的疫苗组合而得到的本发明的混合疫苗能够飞跃式地提高针对舌齿鲈嗜污虫的有效性，即使是针对单一疫苗无法预防的该虫的感染，也能够发挥有效的预防、治疗，从而完成了本发明的混合疫田ο 本发明涉及 [1]以(1)舌齿鲈嗜污虫(舌齿鲈嗜污虫)Iyo I株与显示相同血清型的株的灭活物、(2)与舌齿鲈嗜污虫Nakajima株显示相同血清型的株的灭活物、以及(3)与舌齿鲈嗜污虫Mie0301株显示相同血清型的株的灭活物作为有效成分的用于盾纤虫病的预防或治疗的混合疫苗； [2] [1]所述的混合疫苗，其中，与舌齿鲈嗜污虫Iyo I株显示相同血清型的株是选自Iyo I株、JF05To株、RF05To株以及SK05Kyo株中的株; [3]盾纤虫病的预防或治疗方法，其包括将[1]或[2]所述的混合疫苗以有效量施用于有必要进行盾纤虫病的预防或治疗的对象； [4] (1)与舌齿鲈嗜污虫Iyo I株显示相同血清型的株、(2)与舌齿鲈嗜污虫 Nakajima株显示相同血清型的株、以及(3)与舌齿鲈嗜污虫Mie0301株显示相同血清型的株在制造用于盾纤虫病的预防或治疗的混合疫苗中的用途； [5] [1]或[2]所述的混合疫苗的制造方法，其包括将(1)与舌齿鲈嗜污虫Iyo I 株显示相同血清型的株、(2)与舌齿鲈嗜污虫Nakajima株显示相同血清型的株、以及(3)与舌齿鲈嗜污虫Mie0301株显示相同血清型的株f、各自单独或两种以上组合进行灭活的步骤，以及将所得灭活物混合的步骤。
发明的效果 本发明是一种针对包括死亡率高的舌齿鲈嗜污虫感染在内的盾纤虫病的预防、治疗有效性高的疫苗。更具体地，根据本发明，能够提供一种安全的鱼类用疫苗，该鱼类用疫苗即使施用于以食品为前提饲养的养殖鱼类，也不会出现问题。本发明的灭活疫苗，能够以简便且低成本的步骤制造，因为在获取其抗原的过程中能够容易地大量生产舌齿鲈嗜污虫，且灭活方法简单。而且，制造出来的疫苗能够诱导针对起因于舌齿鲈嗜污虫的盾纤虫病的感染防御能力。因此，其能够对养殖产业及相关产业中的生产性和品质提升、以及养殖中环境卫生的改善做出很大贡献。
[图1]该图显示了使用IyoI株(泳道1)、JF05To株(泳道2)、RF05To株(泳道 3)、SK05Kyo 株(泳道 4)、Nakajima 株(泳道 5)、Mie0301 株(泳道 6)和抗 Iyo I 株、 SK05Kyo株、Nakajima株、Mie0301株血清进行的Westren印迹的结果。图中的A、B、C、D分别为抗Iyo I株、SK(^Kyo株、Nakajima株、Mie0301株血清的反应情况。而且，图1最左侧的泳道显示分子量标记。
[图2]该图表示出了利用IyoI株(4. 03 X IO4细胞/鱼)对接种3种混合疫苗后的牙鲆进行的攻击试验的天数累计死亡率变化。■表示3种混合疫苗接种区， 表示MEM 对照区。
[图3]该图表示出了利用Nakajima株(4.03 X IO4细胞/鱼)对接种3种混合疫苗后的牙鲆进行的攻击试验的天数累计死亡率变化。■表示3种混合疫苗接种区， 表示 MEM对照区。
[图4]该图表示出了利用Mie0301株(4.03X IO5细胞/鱼)对接种3种混合疫苗后的牙鲆进行攻击试验的天数累计死亡率变化。■表示3种混合疫苗接种区， 表示MEM 对照区。
[图5]该图表示出了利用IyoI株(6. 12X IO5细胞/鱼)对接种Iyo I.Nakajima 和Mie0301中的各单一疫苗后的牙鲆进行攻击试验的天数累计死亡率变化。·、■、▲、〇 分别表示Iyo I株、Nakajima株、Mie株、MEM对照区。
[图6]该图表示出了利用Nakajima株(6·12X IO5细胞/鱼)对接种Iyo I、 Nakajima和Mie0301中的各单一疫苗后的牙鲆进行攻击试验的天数累计死亡率变化。·、 _、灰、〇分别表示Iyo I株、Nakajima株、Mie株、MEM对照区。
[图7]该图表示出了利用Mie株(6.12X IO5细胞/鱼)对接种Iyo I.Nakajima 和Mie0301中的各单一疫苗后的牙鲆进行攻击试验的天数累计死亡率变化。·、■、▲、〇 分别表示Iyo I株、Nakajima株、Mie株、MEM对照区。
[图8]该图表示出了利用IyoI株(3. 06 X IO5细胞/鱼)对接种3种混合疫苗后的牙鲆进行攻击试验的天数累计死亡率变化。 表示3种混合疫苗接种区，■表示MEM 对照区。
发明的
具体实施例方式本发明中使用的各株的灭活物、即灭活疫苗可以按照常规方法来制备，例如可以如下地制备。对舌齿鲈嗜污虫(以下称作该虫)喂食鱼类细胞系化细胞CHSE-214(ATCC No. CRL-1681 ；从北海道大学大学院水产科学研究院海洋应用生命科学部门吉水永守教授处获得)，于20°C静置培养5天。鱼类细胞系化细胞CHSE-214使用CHSE-214细胞用培养基[添加了 10%胎牛血清的Eagle，s MEM (Minimum Essential Medium)培养基(日水制药制造制品编码05900)用碳酸氢钠调整至pH7. 3]于20°C培养至单层。通过离心分离收集这样培养得到的该虫，添加灭活剂、例如福尔马林、戊二醛、β -丙内酯等进行灭活。例如， 在使用福尔马林的例子中，添加35%福尔马林液使得终浓度为0. 3%，在4°C的温度下灭活过夜。但是，在灭活会损害抗原性的情况下，要使灭活条件缓和。可以列举出例如减少灭活剂的量、添加PH缓冲剂、降低灭活温度等。
作为这里使用的原生动物，使用(1)与舌齿鲈嗜污虫Iyo I株显示相同血清型的株、(2)与Nakajima株显示相同血清型的株、以及(3)与Mie0301株显示相同血清型的株、 即相互间显示不同血清型的3种株。作为与Iyo I株显示相同血清型的株，可以使用例如JF05To 株、RFOSI1O 株、SK05Kyo 株。
这些株是发明人的小组分离、鉴定的，其详细情况如表1所示。
[表 1]
权利要求
1.用于盾纤虫病的预防或治疗的混合疫苗，其以(1)与舌齿鲈嗜污虫(Philasteridesdicentrarchi) Iyo I株显示相同血清型的株的灭活物、(2)与舌齿鲈嗜污虫Nakajima株显示相同血清型的株的灭活物、和(3)与舌齿鲈嗜污虫Mie0301株显示相同血清型的株的灭活物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的混合疫苗，其中，与舌齿鲈嗜污虫IyoI株显示相同血清型的株是选自Iyo I株、JF05To株、RF05To株和SK05Kyo株中的株。
3.盾纤虫病的预防或治疗方法，其包括向有必要进行盾纤虫病的预防或治疗的对象，以有效量施用权利要求1或2所述的混合疫苗。
4.(1)与舌齿鲈嗜污虫Iyo I株显示相同血清型的株、(2)与舌齿鲈嗜污虫Nakajima株显示相同血清型的株、和(3)与舌齿鲈嗜污虫Mie0301株显示相同血清型的株在制造用于盾纤虫病的预防或治疗的混合疫苗中的用途。
5.权利要求1或2所述的混合疫苗的制造方法，其包括将(1)与舌齿鲈嗜污虫Iyo I株显示相同血清型的株、(2)与舌齿鲈嗜污虫Nakajima株显示相同血清型的株、和(3)与舌齿鲈嗜污虫Mie0301株显示相同血清型的株各自单独或两种以上组合进行灭活的步骤；和将所得的灭活物混合的步骤。
全文摘要
本发明提供对盾纤虫病、特别是死亡率高的舌齿鲈嗜污虫具有感染防御的有效的预防、治疗疫苗。所述疫苗以(1)与舌齿鲈嗜污虫Iyo I株显示相同血清型的株的灭活物，(2)与舌齿鲈嗜污虫Nakajima株显示相同血清型的株的灭活物以及，(3)与舌齿鲈嗜污虫Mie0301株显示相同血清型的株的灭活物作为有效成分。
文档编号A61K39/00GK102186498SQ20098014107
公开日2011年9月14日 申请日期2009年10月16日 优先权日2008年10月16日
发明者北村真一, 宋准荣 申请人:国立大学法人爱媛大学, 明治制果株式会社