一种寡糖分子疫苗的制备方法

专利名称：一种寡糖分子疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌性抗原的制备方法，具体涉及一种从细菌细胞壁多糖中提取具有免 疫原性寡糖的方法。
背景技术：
早在20多年前，世界上著名的鱼病预防专家埃利斯(Ellis， 1998)在他所书写的《鱼 类疫苗》 一书中郑重指出"由一种称为革兰氏阴性，无动力的细菌——产气单胞菌( Aeromonas)所致的疥疮病(Furunculosis)是沙门鱼最严重的疾病之一，在所公开发表的 某些疫苗的效应方面，尤其是那些灭活的全细胞或细胞外产物疫苗越来越引起人们的关注， 但未必令人兴奋。"原因是自1942年自鱼类疫苗祖先Duff开创疫苗以来，人们曾经历过组织 悬浆疫苗，灭活疫苗，减毒活菌苗，细菌表面结构蛋白质疫苗与脂多糖疫苗等不同阶段的探 索与尝试，其中大部分则处于模式形式而停留在实验室研究阶段。尽管在历史上传统疫苗曾 起到一定的作用，但总体来说，均存在着保护率低，具有毒性或异体反应性，在多数情况下 ，只对某一特定的血清型细菌起反应，而且疫苗用量大，往往需要二次免疫，同时，由于这 些疫苗多为蛋白质，蛋白衍生物或糖蛋白，包括重组疫苗在内，均需要在低温条件下保存， 极易受各种理化因素的影响而减效或失效，因此，在使用、运输、保存上带来许多不便。如 果为减毒活菌苗，还存在着复毒的危险。即从实际意义来说，在我国除草鱼出血病毒疫苗( 它是通过将病、死的鱼研碎，取之悬浆加热或福尔马林处理而成的灭活疫苗)夕卜，尚未有一 种有效的水产动物细菌疫苗在生产中应用。包括常见的，严重危害淡水养殖中的产气单胞菌 ，以及海水鱼类病害的罪魁祸首——弧菌属(Vibrio)病原菌。显然。传统上所用的一些产 气单胞菌疫苗，在种间存在着表面抗原的差异，针对某一种菌的免疫力并非对另一种菌感染 有预防作用，因此，较为理想的疫苗应是在同属不同种间，不同的血清型间具有共同的抗原 性，起到属内交叉保护作用——广谱疫苗。

发明内容
本发明的目的是提供一种寡糖分子疫苗的制备方法，该疫苗可预防多种同类属细菌引起 的疫病。
本发明的目的通过以下技术方案实现；
3(1) 大规模细菌培养
将单一个纯的菌落自固体培养基上转种于适当量的液体培养基中，再将其逐级转种至各 种大体积的液体培养基中，在适当的温度与时间进行培养；
(2) 收集细菌细胞
用低温高速离心将细菌从悬液中沉淀下来；
(3) 破裂细菌细胞
将细菌沉淀物，用EDTA将细胞破解，使胞浆内容物与胞壁分离；
(4) 提取细菌细胞壁脂多糖 首先用热水将苯酚结晶配成一定浓度，并将胞壁溶液稀释，与等量苯酚溶液
混合；隔水加热，间隔旋转震荡；然后置于冷环境中两小时，使水相与酚相分离，分别 收集水相与酚相脂多糖粗制品；
(5) 回收菌细胞壁脂多糖 两相脂多糖粗制品分别装在分子量2000道尔顿的透析袋内，先经流动自来水透析，然后
，再将之置于蒸馏水透析，其间不断更换蒸馏水，透析后的脂多糖粗制品浓縮回收；
(6) 去蛋白与核酸
剩余的少量蛋白质、核酸、脱氧核糖核酸，经蛋白酶、核酸酶、脱氧核糖核酸酶将之消 化；经反复低温超速离心，可使脂多糖的蛋白与核酸含减少至最低程度；
(7) 去除类脂A
用强酸、强碱溶液交替加热处理以及使用电化学方法使类脂A分子去除；
(8) 提取具有免疫原的寡糖分子 用现代分子生物学和免疫化学的方法，从多糖中分离出具有特异性高、抗原性强的寡糖
分子，再将其回收、浓縮、真空冷冻干燥。
寡糖分子疫苗的研制是基于革兰氏阴性细菌细胞壁核心多糖的寡糖部分，在同一属菌的 不同种中具有共同抗原成分，它既有种的特异性又有属的特异性的原理，这一点在以该寡糖 分子作为免疫原制备的单克隆抗体与分子生物学的免疫转印技术加以证实。本技术发明涉及 到几乎所有的致病性革兰氏阴性细菌，包括弧菌(Vibrio)、气单胞菌(Aeromonas)、沙 门氏菌(Salmonella)、埃希氏菌(Ecsherichia)、志贺氏杆菌(Shigella)、假气单胞 菌(Pseudomonas)、爱德华氏菌(Edwarseilla)、耶尔森氏菌(Yersinia)、空肠弯曲菌
(Campylobacter)、 屈挠杆菌(Flexibacter)、 军团菌(Legionella)、 奈瑟氏球菌( Neisseria)、巴斯德氏菌(Pastuerella)、博代氏杆菌(Bordetella)、变形杆菌(Prodeus)等。
其理论依据与实验发现在于用革兰氏阴性细菌的脂多糖(由"0"菌体多糖、核心多糖 与类脂A三个部分组成)作为免疫原致敏的小白鼠B淋巴细胞与同系小鼠的骨髓瘤细胞进行杂 交所产生的单克隆抗体，具有该属菌所属的种于属的特异性。其意义在于取自某一特定种细 菌的寡糖作为免疫原而产生的抗体，可与同属的其他任何种间细菌起反应，在实际应用起到 广泛交叉保护作用。体外中和试验与细胞吸附抑制试验均证明了该抗体能有效地中和细菌对 细胞的治病作用与细菌对易感细胞的吸附作用，这种免疫保护作用最后经动物试验得到进一 步的证实。
寡糖分子疫苗与其它任何传统上的疫苗不同表现在以下几个方面
1、 来自核心多糖，具有种与属特异性，在免疫保护上不受地方流行菌株或不同血清型 的影响。
2、 非致病性菌与致病性菌的核心多糖的寡糖具有的抗原特异性相同，因此，用非致病 性菌制备的疫苗可用于预防致病菌的感染，因而使之更加安全可靠。
3、 抗原性极为稳定不受外界与内在因素的影响而使之减效或失效，这与那些本质为 蛋白质或多肽的疫苗因运输或保存的关系而致使蛋白变性进而失去免疫原性成鲜明的对比。
4、 不像其它减毒、灭活或悬浆疫苗那样，有复毒、减毒不完全或过敏反应的危险。
5、 实用性广从剂型上说，可以制成注射剂、浸泡型、口服型、胶囊剂等剂型，还可 以于饲料掺在一起，或直接溶解到水中，让鱼浸泡其中。应用范围方面，包括海水鱼类的石 斑鱼、鲷鱼、舻鱼、沙门鱼、虹鳟鱼；淡水鱼类的甲鱼、桂花鱼、鳗鱼；甲壳类的螃蟹及观 赏鱼类的锦鲤、金鱼等。
6、 在其它动物的应用寡糖来自革兰氏阴性细菌，由该组细菌引起的疾病，寡糖疫苗 均能起到保护作用，如大肠杆菌、沙门氏菌所致的幼猪腹泻、鸡瘟等。
本发明寡糖疫苗的突出特点表现在以下几个方面
(一) 用量少、生效快、效果佳、维持时间长传统上疫苗的用量各有不同， 一般为毫 克水平，而本寡糖分子疫苗用量均在微克水平以下，免疫后7天可测出血清抗体水平，14天 后出现明显的保护作用，4周达到高峰； 一次免疫可维持一年以上。
(二) 无副作用，无毒性由于本身为寡糖成份，无蛋白质、核酸或脂类等有毒物质污 染，首先对动物无不良反应，也无残留物质对人类或其他动物产生影响。
(三) 保存、运输、使用方便在不需要任何特殊设备条件下，该产品可在室温中保存 五年或更长。加上该疫苗为高浓度、高纯度、重量轻、体积小的冻干品，并且包装精致，不
5因冷热或强烈撞击而破坏其化学结构或生物活性。在推广应用上易为用户所接受。
具体实施例方式
(一) 大规模细菌培养
所有细菌菌种为标准菌株，均来自美国模式菌种收藏所(American Type Culture Collection ATCC)。
由于寡糖来自于细菌细胞壁多糖，作为批量生产，每批至少需要50g湿重的细菌才足够 提取用。首先将单一个纯的菌落自固体培养基上转种于适当量的液体培养基中(以感染海水 鱼类的弧菌为例，需要海水营养培养基)，再将其逐级转种至各种大体积的液体培养基中， 经在适当的温度与时间(因不同细菌所要求的生长温度与时间不同)进行培养。
(二) 收集菌细胞
用低温高速离心(BECKMAN J2-HS低温高速离心机)的方法将细菌从悬液中沉淀下来。
(三) 破裂菌细胞
经用低温高速离心沉淀下来的细菌沉淀物，再用乙二胺四乙酸(EDTA)化学方法将细胞 破解，使到胞浆内容物与胞壁分离。
(四) 提取细菌细胞壁脂多糖
1、 苯酚-热水法
首先用热水将苯酚结晶配成一定浓度，并将细菌沉淀物稀释，然后与等量苯酚溶液混合
2、 加热处理法
隔水加热，间隔旋转震荡，可间歇采用超声粉碎法，以加速细菌细胞壁的裂解；
3、 冷处理法
经热处理与震荡后的混合物置于冷环境中两小时，使水相与酚相分离，分别收集水相与 酚相脂多糖粗制品。光滑型菌落与粗糙型菌落的细菌脂多糖分别存在于水相与酚相中。对那 些典型的粗糙型菌落细菌，可用氯仿提取脂多糖。
(五) 回收菌细胞壁脂多糖
1、 加强透析去酚法
两相脂多糖粗制品分别装在分子量2000道尔顿的透析袋内，先经流动自来水透析，然后 ，再将之置于蒸馏水透析，其间不断更换蒸馏水
2、 浓縮脂多糖粗制品
透析后的脂多糖粗制品体积相当大，从50g湿重的细菌所提取的500mg脂多糖粗制品的体积达1000-1500ml。该溶液可经热处理、冷凝聚、蒸发、真空等技术将大体积的水相脂多糖 粗制品浓縮回收，以便进一步的加工处理。
(六) 去蛋白与核酸
1、 蛋白酶、核酸酶处理法
苯酚、热处理后的脂多糖粗制品，大部分蛋白质、核酸已失去活性或被去除，剩余的少 量蛋白质、核酸、脱氧核糖核酸，可经蛋白酶、核酸酶、脱氧核糖核酸酶将之消化；
2、 低温超速离心法
在经反复低温超速离心(BECKMAN 0PTIMALE-80低温超速离心机)的条件下，可使脂多 糖的蛋白与核酸含量减少至最低程度。
(七) 去除类脂A
类脂A除它特有的内毒素的毒性基因外，本身不具有种或属的特异性，应将之加以清除 。用强酸、强碱溶液交替加热处理以及使用电化学方法可使类脂A分子去除。此时的脂多糖 已不再是一个完整的大分子组分，而是不含类脂A的多醣体。
(八) 提取具有免疫原的寡糖分子 用现代分子生物学和免疫化学的方法，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫吸附技术从多糖(
已去类脂A)中分离出具有特异性高、抗原性强的"核心多糖"中的寡糖分子，再将其回收 、浓縮、真空冷冻干燥，以便于保存、运输与使用。
(九) 寡糖分子疫苗的纯度、浓度及化学组分的测定与分析 该部分操作与分子生物学的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，光学的紫外分光光度
测量(波长与透光率、光密度)以及气相液相色谱分析有关。 (十)免疫效应与无毒性试验
按经典的疫苗测试方法，经动物接种该疫苗一定时间后，通过人工攻毒的方式加以证实 ，并通过方阵滴定测出最佳的有效疫苗剂量。而毒性试验包括体外的细胞病变与体内试验， 经反复多次试验无毒性反应，无副作用后方可推广与临床应用。
实施例一 实验室效果
1、小白鼠试验
纯系Balb/c，雌性，6-8周龄，体重15-20g，共80只，分五组，其中四个组分各分别接 受弧菌属四个不同种疫苗，如鳗弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、冷水弧菌寡糖分子疫苗腹腔内 注射0.2ml/只其中含寡糖0.25yg。另一组注射同量生理盐水作对照，在免疫28后，每只小 白鼠口服0.5ml含6.8Xl(/霍乱弧菌活菌液、6小时后，对照组动物出现竖毛、动作迟钝、大
7便稀烂，有81%在48小时内死亡，而接受免疫各组总共64只动物有迟钝，大便稀烂外，其余 均外观正常，全部存活。 2、鱼类实验
(1) 宠物金鱼取遗传均一，体重8-10g/尾，身长5-6cm的金鱼90尾，分为
五组，其中四个组分别接受嗜水气单胞菌、杀蛙气单胞菌、温和气单胞菌和鳗弧菌寡糖 分子疫苗尾腹腔内注射O. lml/尾其中含寡糖0. 125y g。其余的一组注射等量生理盐水做对照 。28天后，各自接受0.2ml含6.6X107嗜水气单胞菌腹腔内攻毒，对照组在注射活菌后首先 出现眼球，肌肉出血，继而脱鳞，75%在48小时内死亡，而试验组只有4尾有出血现象，但 100%能存活至二周。
(2) 彩虹鳟鱼自淡水孚化场，取遗传均一，体重25-30g/尾，身长10-12cm， 共60尾，分三组，二个试验组分别接收鳗弧菌、溶藻弧菌寡糖分子疫苗腹腔内注射
0. lml/尾其中含寡糖0.25yg。对照组注射等量生理盐水。28天后，每尾鱼接受O. 5ml含9X 107鳗弧菌活菌液腹腔内注射。鳗弧菌疫苗与溶藻弧菌疫苗组的存活率分别为90%和85%，而 未接受免疫组在攻毒后24小时出现明显的弧菌病(vibriosis) ， 80%在两周内死亡。
(3) 甲鱼将同来源、同批号、体重100-150g/只的甲鱼90只分成五个组，每 组18只。其中四个组分别接受嗜水气单胞菌、杀蛙气单胞菌、温和气单胞菌和鳗弧菌寡
糖分子疫苗腹腔内注射O. 2ml/只其中含寡糖0. 25 y g。其余的一组注射等量生理盐水做对照 。28天后，各自接受0.2ml含6.6Xl()7嗜水气单胞菌腹腔内攻毒。发现鳗弧菌寡糖疫苗免疫 和生理盐水对照组在24小时后全部出现不同程度的病征，48小时后该两组各有6只死亡，另 有6只处于濒死状态，72小时后总死亡数达31只。然而，接受嗜水气单胞菌、杀蛙气单胞菌 与温和气单胞菌三种寡糖疫苗免疫组，在72小时内，仅有4只有明显病征，其中两只在96小 时后死亡，其余的甲鱼均存活到两周。
(4) 石斑鱼类自然捕捞经观察一周的石斑鱼，体重20-30g/尾，身长10cm左
右，共350尾，分五个组。分别接受鳗弧菌、冷水弧菌、霍乱弧菌和溶藻弧菌寡糖分子 疫苗腹腔内注射0.2ml/尾，其中含寡糖疫苗0.25yg。对照组注射等量生理盐水。28天后用 0. 5ml含7. 6 X 107鳗弧菌活菌液腹腔内注射。24小时后对照组多数出现严重的弧菌病病征， 在两周后，只有30%存活。而尽管免疫各组也有不同程度的弧菌病发生，但其二周后的存活 率分别为鳗弧菌疫苗免疫组85%，冷水弧菌疫苗免疫组88%，霍乱弧菌疫苗免疫组81%和溶藻 弧菌疫苗免疫组78%。在病征上，非免疫组体表、翅、腮出血、溃烂，严重者可见椎骨外露 ，解剖可见内脏器官液化。对比之下，接受疫苗免疫组尽管也有少数鱼出现病变，但起病时间较晚，病状较轻微，有逐渐康复的倾向。
(5)甲壳类(锯缘青蟹)受疫苗免疫保护组与非免疫保护组接受鳗弧菌、溶
藻弧菌攻毒后72小时的存活率分别为83. 6%与25%， 一周后分别为66. 6%与0
经大量的实验室反复在多种动物、鱼类、甲壳类上进行研试证明，寡糖分子疫苗具有良 好的保护作用，无不良反应，且在同属不同种间具有广泛交叉保护反应。
实施例二田间使用效果
1、在预防甲鱼细菌性疾病的应用
在广东省海洋与水产厅的大力支持与汕尾市陆河县水产局的协助下，首先于1997年5月 至1998年6月在陆河县进行大量的大田试用。该县为广东省较早开展大规模人工温泉养殖甲 鱼的几个县之一。由于长年恒温，养殖年限长、土质、水质下降，日趋高密度集养，加之种 苗来源的多样性，导致细菌性传染病越来越重，其严重程度可在短暂的二、三周内毁掉上百 亩大小规模的养殖场。特别是在96-97年度，多数养殖场的甲鱼存活率普遍低于60%，相当部 分在40%左右，甚者"全军覆没"。可见，甲鱼产量低，质量差，加之市场价格不稳定，给 养殖业带来严重的经济损失。基于上述缘故，选择陆河县作为试验基地，进行反复多次大规 模的田间试验，过程如下
选择同一来源的种苗，体重介于50-150g之间试验前，连续严密观察一周以上(其甲 鱼苗自外地购入时5g左右，已在当地小池养2-3个月)，确认体健无病，再将之随机分组。 根据水池面积大小。决定放养甲鱼数量，原则上，6-8只/m2，水深度80cm，透明度约为20cm ，水温控制在28-3(TC之间。本试验设有一次和二次免疫组以及试验对照与天然对照组。免 疫方法为每只甲鱼腹腔内注射O. lml含O. 25y g寡糖分子疫苗。而二次免疫注射组在第一次免 疫注射一个月后，再重复一次。试验对照组用无菌生理盐水代替寡糖分子疫苗腹腔内注射同 量溶液。
在最初免疫的四个月内，除对照组有零星甲鱼发病以及少数死亡外，接受免疫注射的各 组均未发现病或死鱼。这可能与发病季节尚未来到有关。然而，四个月后，对照组的发病数 逐日增加，随之死亡数也增高，下表为各组不同时间存活率比较。
表l寡糖分子疫苗免疫后不同时间存活率比较(％)组别 免疫后月数
四 五 六 七至八
一次免疫 93 91 90 87
......:次免疫 96 94 93 91
试验对照 77 52 47 42
上述结果表明，在免疫注射八个月后，免疫保护率分别为87%与91%，而且可维持达一年 之久(见陆河县水产局汇报)。 一次免疫与二次免疫在保护率上没有明显差别；但免疫组与 对照组有显著差异。此后，该场曾一次性大面积应用该疫苗免疫注射12，000只来源不同，体 积偏小的甲鱼(30-50只)，自1997年5月使用，到1998年底收获上市，各池的存活率均在 80%以上，高者达85%;远远高于其他非免疫组平均50%的存活率水平。顺德一农户一次性 给24，000只甲鱼免疫注射该疫苗，尽管他并没有具体记录、分析，但从放养同等甲鱼数量鱼 池的绝对死亡数量来看，未接种疫苗组的死亡数为注射疫苗组的二倍或以上。
在病变观察与病理解剖上，当甲鱼受产气单胞菌感染时，各自鱼池捕捉一定数量的鱼作 观察比较，自然对照组的400只甲鱼中，有明显病变的为212 (53%)，试验对照组的421只中 有191只(45%)有明显病变，单一次免疫组的476只有90只(19%)有轻微病变，和二次免疫 组的514只有103 (20%)有可见病变。尽管一次或二次免疫组的甲鱼也有可见病变，但在病 变的严重程度上，对照组要比免疫组严重得多。前者在明显溃烂或穿孔(多发性)的情况下 ，5-7天内死亡，而免疫组，即使有病变，但多较轻微，大部分能生存下来。从外表观察所 见的病鱼，有脖子红肿、腐皮、溃疡、穿孔、出血、底板红肿、肝、肾肿大，可见斑点状， 腮腺出血，严重溃烂，进一步细菌学分离、培养和鉴定，确认为嗜水气单胞菌。取新鲜分离 的纯培养物，经无菌生理盐水稀释后，分别给小白鼠与金鱼腹腔内注射，24小时后，可见金 鱼注射部位周围首先出现典型的产气单胞菌所致的疖病、脱鳞、出血、渍烂等，在48小时内 死亡，而小白鼠出现竖毛、行动和反应迟钝等内毒素所致的一系列症状。
2、在预防锯缘青蟹弧菌病中的应用
试验基地位于珠海市南水镇，锯缘青蟹苗由珠海市南水镇种养殖珠海三角增殖护养海区 提供。平均体重50g，平均甲宽2.5cm，装于尼龙网箱浸泡海水中运输，健康状况基本良好。 放养前水体经生石灰75kg/亩消毒、投喂饲料为幼蛤，随着幼蟹的生长可改喂小杂鱼。 一般 每5-7天换一次水，以新旧各半对换。鳗弧菌、溶藻弧菌与创伤弧菌寡糖分子疫苗(简称弧菌混合疫苗)均为该发明技术的产品，并由发明人给予技术操作指导。
免疫方法大田试验的锯缘青蟹苗1000只，分批放在盛有10mg/L的弧菌混合疫苗尼龙袋 中(稀释疫苗用的溶液为海淡比l: 1)，冲氧浸泡作用30min，放置海田养殖。另设有六个 组，每组20-30只，分别由六个笼子组成，即不同疫苗浓度A、 B组；不同免疫浸泡时间C、 D 组；加疫苗但不加压充氧E组和加压充氧但不加疫苗F (非免疫)组对照。另外，同期购进而 未加任何处理的蟹苗为天然对照。
加压充氧浸泡免疫法(充氧压力1.5磅/m3):
A、 不同疫苗浓度组，A和B组分别为含弧菌混合疫苗10mg和20mg/L，将各组蟹苗与相应 浓度疫苗混合，盛于充氧尼龙袋中，加压作用30min，然后放到相应的笼子里。
B、 不同免疫浸泡时间C和D组分别为含弧菌混合疫苗浓度为10mg/L浸泡作用20和30min不 等。经加压充氧浸泡免疫后的各组蟹苗放养于各自的笼子里。
C、 由专人负责该项工作，包括喂养、管理、标本收集、病情、死亡记录及试验报告。 试验结果表明，寡糖分子疫苗通过浸泡免疫对幼蟹提供相当明显的保护作用(见表2)
。在接受免疫的1130只平均体重50g的幼蟹中，经过8周的养殖观察比较，直至上市，免疫组 的生存率为99%，而对照组与天然对照组，包括同一养殖区其他养殖户的比较，其养殖成活 率普遍低于30%，与文献报导相符。在扩大试验中， 一共浸泡免疫平均体重5-50g不等的幼蟹 S800只，放养在二个面积分别为3-4亩的海田里。收获时总存活率65%。本应用以探讨的方式 介绍寡糖分子疫苗浸泡免疫操作方法，免疫保护效果，体液免疫水平检测，对攻毒的反应， 病变的发生、发展与结局，病原菌的分离、培养和鉴定以及病理分析等研究结果。
蟹的生长情况免疫试验8周过程中，免疫组的螃蟹摄食、活动活跃、体表色泽光滑， 体重增长快，相反，非免疫组体表粗糙，体表色素沉着，摄食能力差，生长缓慢。
表2各试验对照存活率比较
分组A10mg/L B20mg/LC20' D30'EF Omg/L
处理30'10mg/L不充氧压力充氧压力
存活20Z20 20/2020/20 20Z2019Z2023/30
活率％100 100100 1009577
存活率比较大田试验、不同浸泡时间、不同浓度的免疫组螃蟹一共1130只，除8只于 免疫后一周死外，其余1122只存活至试验结束，存活率达99%。而其他所有对照组的总死亡 率高达70%。
11病蟹的基本表现首先为摄食反应迟钝、活动障碍，继而出现关节红肿，趾、足脱落而 死亡，漂浮于水面。
病理解剖体液为黄脓色，肉质、结构破坏、鳌足骨髓空洞形成、液化，严重者可累及甲冗。
体液免疫检测分别抽取免疫与非免疫组螃蟹鳌足髓液体与鳗弧菌、溶藻弧菌悬液进行 玻片凝集反应，两者的凝集效价分别为l: 16和1: 4。
攻毒试验浸泡免疫组与非免疫组螃蟹各12只，每组再分为两个小组，即每小组6只。 各自接受新鲜传代的2XLD50鳗弧菌、溶藻弧菌(5. 5X106/ml与2. 7X106/ml)浸泡10min作 为攻毒试验，并另设空白对照。每天早晚观察结果，连续7天。非免疫组浸泡攻毒后24、 48 、72、 96小时的存活率分别为83. 6%， 50%， 25%，和0%。而免疫组攻毒后24、 48、 72、 96、 120、 144小时的存活率分别为100%、 91.6%、 83.6%、 83.6%、 66.6%、 66.6%。
病变的发展结局螃蟹受弧菌感染后，其表现与鱼类不同，没有脱鳞、糜烂、出血、肌 肉坏死等症状，而是关节红肿，趾、足脱落，接着死亡。此时，如打开甲壳可见体内实质部 分液化、恶臭。
病原菌的分离和鉴定自濒死的螃蟹体内或鳌足髓液中取样，接种于海水琼脂平板或弧 菌鉴别培养基TCBS上，经25。C培养18小时，可见直径2mm，表面光滑、边缘整齐、凸起的菌 落。在TCBS上为橙黄色。初步说明分离菌属于弧菌，进一步的FITC-免疫荧光单克隆抗体检 测被鉴定为鳗弧菌。
病理分析根据病理解剖所见，病死蟹体内有大量黄色脓液，肉质、结构破坏，可认为 弧菌短期内过度生长、繁殖，产生大量内、外毒素，如类脂多糖、溶血素等。这些毒素可使 蟹基底组织结构破坏、液化、空洞形成，最后导致死亡。
3、在石斑鱼中的应用
在鱼苗接受免疫注射后的二周内，各组鱼均有红鳍、红尾、红嘴、脱鳞现象，每天可发 现l-2尾死鱼，而且符合弧菌病的表现。此后，两组受免疫的鱼绝对死亡数开始下降，趋向 稳定，而两个对照组的发病数量不断增加，病情逐日加重，死亡数依然不断增长。其结果详 细记录如下
(1)免疫试验组甲(IOOO尾)
经免疫注射后一个月，存活率95% (950/1000)，两个月为94. 7% (947/1000)，三个月 为94. 5% (945/1000)，四个月为94. 1% (941/1000)，五个月为93. 7% (937/1000)和六个 月后为93. 5% (935/1000)。(2) 免疫试验乙(500尾)
经免疫注射后一个月，存活率94. 4% (472/500)，两个月为92. 6% (463/500)，三个月 为91.8% (459/500)，四个月为90. 2% (451/500)，五个月为88% (440/500)和六个月后为 86.4% (432/500)。
(3) 对照组(试验对照组及天然对照组，共500尾) 两个对照组的存活率很相近，但明显低于试验组。六个月后，其存活率不足25.2% (
126/500)，而一至五个月的存活率分别为63. 6% (318/500) ， 54.2% (271/500) ， 41.6% ( 208/500) ， 31.2% (156/500)和28. 2% (141/500)。
病变与病理观察在检査各组病鱼中发现，对照组一旦发病，病情往往比较严重，从脱 鳞、渍疡、肌肉腐烂以及骨质破坏，多在数天内死亡。而注射疫苗组即使发病，其发病过程 比较慢，病情相对较轻，大多在急性发病后逐渐得到恢复，而极少有烂身、烂骨头的情况。 取不同发病阶段病鱼行病理解剖，可见内脏充血、出血，血性腹水。组织坏死，肝、肾等重 要器官严重损害。
1权利要求
1.一种寡糖分子疫苗的制备方法，包括以下步骤(1)大规模细菌培养将单一个纯的菌落自固体培养基上转种于适当量的液体培养基中，再将其逐级转种至各种大体积的液体培养基中，在适当的温度与时间进行培养；(2)收集细菌细胞用低温高速离心将细菌从悬液中沉淀下来；(3)破裂细菌细胞将细菌沉淀物，用EDTA将细胞破解，使胞浆内容物与胞壁分离；(4)提取细菌细胞壁脂多糖首先用热水将苯酚结晶配成一定浓度，并将胞壁溶液稀释，与等量苯酚溶液混合；隔水加热，间隔旋转震荡；然后置于冷环境中两小时，使水相与酚相分离，分别收集水相与酚相脂多糖粗制品；(5)回收菌细胞壁脂多糖两相脂多糖粗制品分别装在分子量2000道尔顿的透析袋内，先经流动自来水透析，然后，再将之置于蒸馏水透析，其间不断更换蒸馏水，透析后的脂多糖粗制品浓缩回收；(6)去蛋白与核酸剩余的少量蛋白质、核酸、脱氧核糖核酸，经蛋白酶、核酸酶、脱氧核糖核酸酶将之消化；经反复低温超速离心，可使脂多糖的蛋白与核酸含减少至最低程度；(7)去除类脂A用强酸、强碱溶液交替加热处理以及使用电化学方法使类脂A分子去除；(8)提取具有免疫原的寡糖分子用现代分子生物学和免疫化学的方法，从多糖中分离出具有特异性高、抗原性强的寡糖分子，再将其回收、浓缩、真空冷冻干燥。
全文摘要
本发明涉及一种从细菌细胞壁多糖中提取具有免疫原性寡糖的方法，具体包括以下步骤大规模细菌培养，收集细菌细胞，破裂细菌细胞，提取细菌细胞壁脂多糖，回收菌细胞壁脂多糖，去蛋白与核酸，去除类脂A，提取具有免疫原的寡糖分子。该寡糖疫苗具有种与属特异性，在免疫保护上不受地方流行菌株或不同血清型的影响，安全可靠，抗原性极为稳定，用量少、生效快、效果佳、维持时间长、实用性广等优点。
文档编号C12R1/185GK101596313SQ200910304328
公开日2009年12月9日 申请日期2009年7月14日 优先权日2009年7月14日
发明者陈德胜 申请人:李子定