专利名称：迟缓爱德华氏菌重组蛋白疫苗及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子疫苗学领域，具体的说是迟缓爱德华氏菌重组蛋白疫苗及其制备方法。
背景技术：
迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种革兰氏阴性病原菌,具有广泛的宿主范围，包括人类、鱼类、鸟类等。对水产养殖业而言，迟缓爱德华氏菌是一种重要的鱼类病原菌，已报道在多种海水和淡水鱼类中引起疫病发生，给产业造成了严重的经济损失。目前，韩国已有一种基于灭活全菌的商业化疫苗，但在我国，由于相关研究起步较晚，迄今尚无有效的迟缓爱德华氏菌疫苗可以应用于产业。因此，针对迟缓爱德华氏菌的疫苗研发在我国亟需开展。疫苗有多种不同的形式，其中一种是基于细菌免疫保护性蛋白的重组亚单位疫苗。这种疫苗通常在大肠杆菌中异源表达，通过一系列纯化过程获得重组的疫苗抗原蛋白。好的亚单位疫苗能够诱发高特异性免疫应答，因此是一种高效候选疫苗的选择形式。
发明内容
本发明目的在于提供迟缓爱德华氏菌疫苗及其制备方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种迟缓爱德华氏菌重组蛋白疫苗，重组蛋白疫苗为含有列表SEQ ID No. I的真核重组表达质粒；或含有列表SEQ ID No. 2的真核重组表达质粒。重组蛋白疫苗为含有列表SEQ ID No. I的真核重组表达质粒pE266 ;或含有列表SEQ ID No. 2的真核重组表达质粒pE377。迟缓爱德华氏菌重组蛋白疫苗的制备方法，所述重组质粒pE266，以迟缓爱德华氏菌TXl为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与载体pEASY-E2连接，连接液转化入大肠杆菌DH5，筛选转化子提取质粒，即为质粒PE266 ；所述重组质粒pE377的构建以迟缓爱德华氏菌TXl为模板，采用F2/R2为引物进行PCR扩增，PCR产物与载体pEASY-E2连接，连接液转化入大肠杆菌DH5，筛选转化子提取质粒，即为质粒PE377 ；所述引物为Fl :5’ -ATGGAGAATAATTTACTCGGCGA-3 J ；R1 5’ -Τ ΧΙΧ ΧΑΟΤΤ ΧΤΤΑΤΤ Χ ；F2 :5’ -ATGGCATCTGAAAAAACGATGG-3 ’ ；R2 5’ -ATGATTCCGCTCCACTAG-3’。 将质粒pE266或pE 377分别转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得转化子BL21/pE266和BL21/pE377 ;将BL21/pE266和BL21/pE377分别于含有Ap的LB液体培养基中过夜培养；取过夜后的培养液加入到LB液体培养基中，于37°C培养至0D_为O. 6，而后加入终浓度为ImM的IPTG并于37°C继续培养4_5h，然后在菌液中加入裂解液，室温摇动1_2小时；将菌液离心，回收上清；将上清液用凝胶柱回收，即分别得到具有序列表SEQ ID No. I或SEQ IDNo. 2中的氨基酸序列的真核重组表达质粒pE266或pE 377。
将上述得真核重组表达质粒分别在PBS中稀释至250ug/ml，而后将稀释液与佐剂等体积混合。所述佐剂为将体积比为2 :5的NaOH和Al2 (SO4) 3混合液悬浮于PBS中至O. 2mg/ml。所述NaOH浓度为质量比5% ;A12 (SO4) 3浓度为质量比5%。迟缓爱德华氏菌重组蛋白疫苗的应用，所述重组蛋白疫苗在制备具有预防和治疗迟缓爱德华氏菌疫苗制剂中的应用。本发明具有如下优点I.高保护性。本发明的两种疫苗对迟缓爱德华氏菌的免疫保护效率分别达81%和 85%。2.无需商业化佐剂。
图I为本发明实施例提供的纯化的E266 (A)和E377 (B)电泳图谱，其中，泳道1，分
子量标准。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法I.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress 2001)；3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。实施例I迟缓爱德华氏菌两种疫苗抗原为序列表SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2中的氨基酸序列所示(参见序列表I和2)。序列表SEQ ID No. IMENNLLGDGFKLPKGLTDYGAAAQSWNQYAEKNGLTPEQKQAGLDRLAK⑶LPEDTNITKAIVEGYQDGVMIAETffYLGPAASVRKVIGGGIIAEIANGSYQWFDLSQPGNGNKSWDWKSSTSAGITGILAPRRSIGQNVGIAMGSAFFTDGPDTGSIGGAAAGAWAGGLFGEYASGIVNSLTSKKVPGFIFNTTGSFSSEILGGYIKDAVNGTQLSSERNKEVGE(a)序列特征 长度226 类型氨基酸序列籲链型单链
拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质
(c)假设否(d)反义否(e)最初来源迟缓爱德华氏菌TXl(f)特异性名称E226
序列表SEQ ID No. 2ASEKTMDRPGNLIKENQQRAASDEVGRLFRMPITPDGTAVLSGEIGQQPIAIHNVEDANAGELVDSPINDAIAININRASQNNKNNAGAGSLTKEQDPMDSLSIRGVGSALAASGRVDALHHMARTMATSAVNDQIGQWLNRYGTARIQLNTDRDFSLAESALDffLLPLYDSQTLTLFTQQGFRNKDRRNIANIGIGTRFIHHEWMMGGNAFYDNDFTCDNKRVGLGAELWTDSFQLSANGYFRLTAffHQSRDRSDYNERPANGVDLRANGWLPAQPHLGGSLIYEHYFGDNVALFGKDHLQRNPYAITLGGSYTPFSLLTLEVKQRLGKQGNQDTQLGLHINYRLGADLPAQLDPAALVAARTIAKTRYDLVERNH(a)序列特征 长度377 类型氨基酸序列 链型单链 拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(C)假设否(d)反义否(e)最初来源迟缓爱德华氏菌TXl(f)特异性名称E377结构特征该蛋白含有一个DUF3442功能域，由氨基酸98至氨基酸377组成。实施例2迟缓爱德华氏菌疫苗表达载体的构建方法I)质粒PE226的构建以迟缓爱德华氏菌TXl为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR条件为94°C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s, 55°C 60s, 72°C 60s，30个循环后再在72 V延伸反应IOmin。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化后与载体pEASY_E2 (购自于“北京全式金生物技术有限公司”)于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5 α后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)的LB固体培养基上培养18小时，挑取一个转化子，提取质粒，即为质粒PE266。所述LB组成成分按重量百分比计I. O %蛋白胨，O. 5%酵母粉，1.0%氯化钠，97. 5%蒸馏水；所述菌株TXl保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 2330，分类命名为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda),保藏日期2008年I月9日。所述引物为Fl :5’ -ATGGAGAATAATTTACTCGGCGA-3’ 和 Rl 5’ -TTCCCCCACTTCCTTATTTCT-3’。
2)质粒pE377的构建质粒pE377的构建步骤同上述pE226的构建，其pE377的PCR引物为F2(5，-ATGGCATCTGAAAAAACGATGG-3，)和 R2(5，-ATGATTCCGCTCCACTAG-3，)。实施例3
疫苗蛋白的诱导表达和纯化1)E226疫苗蛋白的诱导表达和纯化将上述步骤I)的质粒pE226用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE 3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有Ap(100ug/ml)的LB固体培养基上培养18-24小时，挑取一个转化子，将其命名为BL21/ρΕ226。将BL21/ρΕ226于含有Ap(100ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取Iml过夜后的培养液，加入IOOml新鲜的含有Ap (100ug/ml)的LB液体培养基中，于37°C下转速200rpm摇动培养至OD6tltl为O. 6，加入终浓度为ImM的IPTG，37°C继续以转速160rpm摇动培养4_5h，而后以5000g，4°C离心lOmin，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1_2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4°C离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用His Trap HPColumns (购于美国GE Healthcare公司)回收纯化,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳,测定其分子量大小(参见图I)(电泳条件8v/cm电压下电泳25-30min,随后15v/cm电压下电泳2-2. 5h)。将纯化的蛋白经质谱分析，证实其为具有序列表SEQ ID Nol中的氨基酸序列的抗原蛋白。所述裂解液为终浓度的IOmM NaH2PO4UOmM Tris和8M尿素，pH 8.0。2)E377疫苗蛋白的诱导表达和纯化参见上述E266疫苗蛋白的诱导表达和纯化方式。实施例4E266和E377疫苗的应用步骤I)佐剂及疫苗混合液的制备。佐剂制备将5% (质量比)NaOH和5% (质量比)Al2 (SO4) 3以2 5体积比混合，将混合物以10，OOOg离心5分钟。将沉淀悬浮于PBS中至O. 2mg/ml。疫苗混合液制备将上述实施例3纯化的E266和E377在PBS中稀释至250ug/ml ；将稀释后的疫苗蛋白与佐剂等体积混合。佐剂对照液制备将PBS与佐剂等体积混合。所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl,O. 02 % KCl,O. 358 %Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2PO4,余量为水。步骤2)疫苗的免疫应用。将90条牙鲆(每条重约IOg)随机分为3组，每组30条。将这3组分别命名为Α，B和C组。将A组的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤I)的Ε226疫苗混合液，将B组的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤I)的Ε377疫苗混合液；将C组的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤I)的佐剂对照液。步骤3)迟缓爱德华氏菌悬液的制备。在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TXl至OD6c 为O. 8，然后离心(5000g，4°C )10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为4xl06cfu/ml。步骤4)疫苗免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后的第30天，用上述步骤3)的迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射步骤2)的3组鱼，每条鱼的注射量为lOOul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A组，5条；B组，4条；C组，27条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)RPS = 100x(l-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)
根据此公式算出E266和E 377的免疫保护效率分别为81 %和85%。因此，所得两种疫苗能够高效地保护牙鲆抵御迟缓爱德华氏菌侵染。
权利要求
1.一种迟缓爱德华氏菌重组蛋白疫苗，其特征在于重组蛋白疫苗为含有列表SEQ IDNo. I的真核重组表达质粒；或含有列表SEQ ID No. 2的真核重组表达质粒。
2.按权利要求I所述的迟缓爱德华氏菌重组蛋白疫苗，其特征在于重组蛋白疫苗为含有列表SEQ ID No. I的真核重组表达质粒pE266 ;或含有列表SEQ ID No. 2的真核重组表达质粒PE377。
3.—种权利要求I或2所述的迟缓爱德华氏菌重组蛋白疫苗的制备方法，其特征在于所述重组质粒PE266，以迟缓爱德华氏菌TXl为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物与载体PEASY-E2连接，连接液转化入大肠杆菌DH5，筛选转化子提取质粒，即为质粒 pE266 ； 所述重组质粒PE377的构建以迟缓爱德华氏菌TXl为模板，采用F2/R2为引物进行PCR扩增，PCR产物与载体pEASY-E2连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，筛选转化子提取质粒，即为质粒ΡΕ377 ； 所述引物为 Fl :5’ -ATGGAGAATAATTTACTCGGCGA-3’ ；R I 5’ -TTCCCCCACTTCCTTATTTCT-S’ ；F 2 :5’ -ATGGCATCTGAAAAAACGATGG-3’ ；R2 5’ -ATGATTCCGCTCCACTAG-3’。
4.按权利要求3所述的迟缓爱德华氏菌重组蛋白疫苗的制备方法，其特征在于将质粒pE266或pE377分别转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得转化子BL21/pE266和BL21/pE377 ;将BL21/pE266和BL21/pE377分别于含有Ap的LB液体培养基中过夜培养；取过夜后的培养液加入到LB液体培养基中，于37°C培养至0D_为O. 6，而后加入终浓度为ImM的IPTG并于37°C继续培养4-5h，然后在菌液中加入裂解液，室温摇动1-2小时；将菌液离心，回收上清；将上清液用凝胶柱回收，即分别得到具有序列表SEQ ID No. I或SEQ ID No. 2中的氨基酸序列的真核重组表达质粒PE266或pE377。
5.按权利要求4所述的迟缓爱德华氏菌重组蛋白疫苗的制备方法，其特征在于将上述得真核重组表达质粒分别在PBS中稀释至250ug/ml，而后将稀释液与佐剂等体积混合。
6.按权利要求5所述的迟缓爱德华氏菌重组蛋白疫苗的制备方法，其特征在于所述佐剂为将体积比为2 : 5的NaOH和Al2 (SO4) 3混合液悬浮于PBS中至O. 2mg/ml。
7.按权利要求6所述的迟缓爱德华氏菌重组蛋白疫苗的制备方法，其特征在于所述NaOH浓度为质量比5% ;A12 (SO4)3浓度为质量比5%。
8.—种权利要求I所述的迟缓爱德华氏菌重组蛋白疫苗的应用，其特征在于所述重组蛋白疫苗在制备具有预防和治疗迟缓爱德华氏菌疫苗制剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及分子疫苗学领域，具体的说是两种迟缓爱德华氏菌重组蛋白疫苗和制备方法。其疫苗抗原为由序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中的氨基酸序列所示。本发明的疫苗的应用不需商业佐剂，且皆能达到80％以上的免疫保护效应。
文档编号A61P31/04GK102614503SQ20121006516
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月13日 优先权日2012年3月13日
发明者孙云, 孙黎, 李墨非 申请人:中国科学院海洋研究所