专利名称：一种非致病性迟缓爱德华氏菌的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学和微生物学领域，具体的说是一种非致病性迟缓爱德华氏菌的
应用。
背景技术：
迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种重要的养殖水产生物病原菌，能 够感染多种海水和淡水鱼类，包括牙鲆、大菱鲆、罗非鱼、真鲷、鳗鱼等，每年给水产养殖业 造成巨大的经济损失。另外，除了鱼类外，迟缓爱德华氏菌还能感染人类和陆栖动物，在人 类中造成急性胃肠炎、伤口感染、败血病等；因而该菌是一种典型的人/畜/鱼共患性病原 菌。对于迟缓爱德华氏菌病的防治，目前除了一种灭活疫苗最近在韩国应用外，世界上尚无 其它商业化疫苗。发明人课题组以及其他研究人员曾报道几种在实验室范围内有效的迟缓 爱德华氏菌疫苗，但这些疫苗都是来自于致病性迟缓爱德华氏菌，基于非致病性的迟缓爱 德华氏菌疫苗尚未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种非致病性迟缓爱德华氏菌的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 —种非致病性迟缓爱德华氏菌的应用所述非致病性迟缓爱德华氏菌对致病性迟 缓爱德华氏菌感染具有免疫保护效应；所述非致病性迟缓爱德华氏菌为迟缓爱德华氏菌 15947。 所述对致病性迟缓爱德华氏菌感染具有免疫保护效应的为非致病性迟缓爱德华 氏菌的菌悬液。所述非致病性迟缓爱德华氏菌的菌悬液为将非致病性迟缓爱德华氏菌在LB 培养基中于28°C，以160rpm摇动培养至0D6。。为0. 8-l，离心收集菌体，即为非致病性迟缓 爱德华氏菌的菌悬液。所述离心收集的菌体悬浮于PBS中至终浓度为4xl()8cfu/ml。所述 非致病性迟缓爱德华氏菌的菌悬液腹腔注射于鱼类，注射量为100ul。
本发明具有如下优点 1.高保护率。本发明的疫苗对致病性迟缓爱德华氏菌侵染的相对免疫保护效率可 达100%。 2.应用简单。本发明的疫苗制备过程简单，只需常规的细菌培养，不涉及任何其它 处理。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而
非以任何形式对本发明进行限制。 实施例l 非致病性迟缓爱德华氏菌对致病性迟缓爱德华氏菌感染具有免疫保护效应。所述非致病性迟缓爱德华氏菌为迟缓爱德华氏菌15947 (Tan YP， Lin Q， Wang XH， JoshiS， Hew C， Leung KY. Comparative proteomic analysis of extracellular proteinsofEdwardsiella tarda. Infect Immun 2002;70:6475-80.)。非致病性毒力检测表明，用15947和其它典型的致病性迟缓爱德华氏菌感染蓝曼龙(Trichogastertrichopterus)( —种鱼)，15947的半致死量(LD50)是典型致病性迟缓爱德华氏菌的50-500倍，由此将15947划分为非致病性迟缓爱德华氏菌。 对致病性迟缓爱德华氏菌感染具有免疫保护效应的为非致病性迟缓爱德华氏菌的菌悬液。具体为将迟缓爱德华氏菌15947(购于美国AmericanType Culture Collection,编号ATCC 15947)在LB液体培养基中过夜培养；取O. 1ml过夜后的培养液，将其加入10ml新鲜的LB液体培养基中，于28t:转速160rpm摇动培养至0D6。。为0. 8_1，而后将细菌培养液离心(5000g，4°C， 10min)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为4xl08cfu/ml，即为非致病性迟缓爱德华氏菌的菌悬液。 所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，97. 5%蒸馏水；所述PBS组成成分按重量百分比计0.8% NaCl，O. 02% KCl，O. 358 %Na2HP04. 12H20，0. 024% NaH2P04。 免疫注射将44条牙鉀(每条重约10g)随机分为2组，每组22条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别腹腔注射lOOul上述非致病性迟缓爱德华氏菌的菌悬液。将B组的每条鱼分别腹腔注射100ulPBS。 20天后，再次将A组的每条鱼分别腹腔注射lOOul上述非致病性迟缓爱德华氏菌的菌悬液，将B组的每条鱼分别腹腔注射lOOul PBS。
致病性迟缓爱德华氏菌悬液的制备在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TXl至0D6。。为0.6，然后离心(5000g，4°C )10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为4xl07cfu/ml，即为致病性迟缓爱德华氏菌悬液。 所述迟缓爱德华氏菌TXl保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 2330。 疫苗的免疫保护效应检测在免疫注射第一次注射后的第35天，用上述的致病性迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射上述A和B组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A组，O条；B组，18条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS): RPS = lOOx(l-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)由此得出迟缓爱德华氏菌15947，非致病性迟缓爱德华氏菌针对致病性迟缓爱德华氏菌感染的免疫保护效率为100%。
权利要求
一种非致病性迟缓爱德华氏菌的应用，其特征在于所述非致病性迟缓爱德华氏菌对致病性迟缓爱德华氏菌感染具有免疫保护效应；所述非致病性迟缓爱德华氏菌为迟缓爱德华氏菌15947。
2. 按权利要求1所述的非致病性迟缓爱德华氏菌的应用，其特征在于所述对致病性 迟缓爱德华氏菌感染具有免疫保护效应的为非致病性迟缓爱德华氏菌的菌悬液。
3. 按权利要求1所述的非致病性迟缓爱德华氏菌的应用，其特征在于所述非致病性迟缓爱德华氏菌的菌悬液为将非致病性迟缓爱德华氏菌在LB培养基中于28°C，以160rpm 摇动培养至0D6。。为0. 8-l，离心收集菌体，即为非致病性迟缓爱德华氏菌的菌悬液。
4. 按权利要求3所述的非致病性迟缓爱德华氏菌的应用，其特征在于所述离心收集 的菌体悬浮于PBS中至终浓度为4xl08cfu/ml。
5. 按权利要求1所述的非致病性迟缓爱德华氏菌的应用，其特征在于所述非致病性 迟缓爱德华氏菌的菌悬液腹腔注射于鱼类，注射量为lOOul。
全文摘要
本发明涉及免疫学和微生物学领域，具体的说是一种非致病性迟缓爱德华氏菌的应用。所述非致病性迟缓爱德华氏菌对致病性迟缓爱德华氏菌感染具有免疫保护效应。本发明所得非致病性迟缓爱德华氏菌对致病性迟缓爱德华氏菌有高保护作用，其制备及免疫操作简单，无需任何处理过程。
文档编号A61P31/00GK101721692SQ20091023054
公开日2010年6月9日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者孙黎, 程爽 申请人:中国科学院海洋研究所