DNA改组后的细菌外膜蛋白ompAs-19及其作为免疫调节剂的应用
【技术领域】
[00011本发明涉及DNA改组技术领域，具体涉及DNA改组后的细菌外膜蛋白ompAs-19及其 作为免疫调节剂的应用。
【背景技术】
[0002] 在水产动物养殖中，往往使用各种化学药物和抗生素来控制有关疾病，但长期用 药，不仅导致病原菌的抗药性越来越明显，而且使药物残留的危害也日益显现，严重地影 响水产品安全，所以通过疫苗进行免疫预防更受到高度重视。目前我国水产养殖业的主要 病原菌是弧菌和迟钝爱德华氏菌，而目前无针对多种细菌的多价高效疫苗，因此，研制以具 有免疫保护作用的高效多价疫苗具有广阔的应用前景。
[0003] 研究已经发现细菌外膜蛋白OmpA具有良好的免疫原性，不仅可以刺激体液免疫， 而且对细胞免疫亦有刺激作用。但是外膜蛋白OmpA仅仅对同种细菌具有良好的免疫调节功 能，对其他细菌的免疫调节功能较低。如溶藻弧菌OmpA针对溶藻弧菌感染时保护率达到 87.5%，而副溶血弧菌OmpA对溶藻弧菌感染时保护率仅为35.6%;副溶血弧菌和迟缓爱德华 氏菌的OmpA在针对自身细菌感染时保护率仅为40%左右。我国养殖鱼类个体偏小，从经济效 率和实际操作来考虑，也难以对常见病原菌逐一进行疫苗免疫。
[0004] DNA改组技术可以在分子水平上对基因进行体外有性重组，由此改变单个基因或 基因家族原有的核苷酸序列，创造新基因并赋予表达产物新功能，推动了生物工程的诸多 领域突飞猛进地向前发展。但目前尚无用该技术获得多效多价疫苗的研制的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种DNA改组后的细菌外膜 蛋白 ompAs-19。
[0006] 本发明的另一个目的是提供DNA改组后的细菌外膜蛋白ompAs-19作为免疫调节剂 的应用。
[0007] 为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的： DNA改组后的细菌外膜蛋白ompAs-19,编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0008] DNA改组后的细菌外膜蛋白ompAs-19,其氨基酸序列如如SEQ ID N0:2所示。
[0009] SEQ ID NO:2所述的DNA改组后的细菌外膜蛋白ompAs-19在制备动物免疫调节剂 中的应用。
[0010] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 本发明首次采用DNA改组技术结合免疫学研究，以溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华 氏菌以及大肠杆菌的外膜蛋白OmpA为研究对象，通过DNA改组技术获得改组OmpA基因，进一 步构建了原核表达的改组OmpA质粒库;通过SDS-PAGE鉴定获得43个能正确表达的改组OmpA 基因；将所有这些改组OmpA基因构建真核表达的改组OmpA质粒库，即DNA疫苗;最后用斑马 鱼作为模式动物深入研究其免疫保护性。免疫和攻毒实验结果表明19号改组OmpA基因 (ompAs-19)对溶藻弧菌具有较高的免疫保护作用，其相对免疫保护率(RPS)为100%。此外， 还显示出对迟缓爱德华氏菌的交叉免疫原性，其免疫保护率(RPS)达到85.71%。这些结果说 明19号改组OmpA( ompAs-19)可作为疫苗组分。
【附图说明】
[0011 ] 图1为6个Ompa基因用DNAman软件进行序列比对分析结果。
[0012] 图2为OmpA基因的PCR扩增图谱；1: DNA分子量标准，2,3:E.coli ompA的2个片段， 4,5:ETAE_1267的2个片段，6:VP0764,7 :VA0764,8:vpall86，9:VPA1186。
[0013] 图3为OmpA基因改组电泳图谱;A:膜板基因的DNasel酶切;B:无引物PCR扩增产物； C:用特异的VA 0764引物PCR扩增，M:DNA分子量标准。
[0014] 图4为改组OmpA基因原核表达质粒库的筛选，A:PCR扩增，M: DNA分子量标准；B: 改组OmpA原核表达质粒库表达，M:蛋白质分子标准；VA: V. Alginolyticus;l~43:ompAs 表达；C:改组OmpA表达的Western-blotting鉴定。 图5为改组OmpA真核质粒的双酶切电泳图谱，M: DNA分子量标准。
[0015] 图6为改组OmpA基因 DNA疫苗的主动免疫保护评估，A，DNA疫苗免疫后斑马鱼体液 Western-blotting. 1，免疫VA0764; 2，免疫载体pcDNA3.1; 3-12，免疫改组0嫩疫苗· B和C，改组DNA疫苗对溶藻弧菌和迟缓爱德华氏菌的主动免疫保护作用评估**p〈 0.01。 [0016] 图7为改组ompAs-19 (上面)与VA0764(下面)基因序列对比结果。
[0017] 图8为改组ompAs-19 (上面)与VA0764(下面)氨基酸序列对比结果。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例 只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特 殊说明，均为常规方法;所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂 和材料。
[0019] 实施例1 细菌外膜蛋白OmpA基因改组模板:选取6个细菌外膜蛋白OmpA基因作为改组对象，其分 别来源于溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌和大肠杆菌等4种细菌。这6个OmpA基因分 别是溶藻弧菌0764(￥40764)、1186(￥。&1186)、副溶血弧菌0764(￥?0764)、1186(￥?41186)、 迟缓愛德华氏菌〇mpA(ETAE_l267)、大肠杆菌ompA(E . col iompA)，基因长度在960bp~ 1056bp之间。对这6个OmpA基因用DNAman软件进行序列比对分析，发现其同源性为65.59%， 结果见图1，可用于进行基因改组研究。
[0020]实施例2细菌外膜蛋白OmpA改组基因的获得 改组模板的PCR扩增:根据NCBI已经公布的6个OmpA基因序列设计引物，引物序列见表 1。通过分析6个OmpA基因序列，发迟缓爱德华氏菌ompA(ETAE_1267)760 bp处和大肠杆菌 〇mpA(E.c〇li〇mpA )745bp处都存在一个BamHI酶切位点。因后面使用的原核表达载体要使 用这个酶切位点，所以这两个基因以BamHI酶切位点为分界点，各自设计两对引物，将 E. co 1 i ompA和ETAE_1267基因分别扩增出为两个片段。
[0021] 表1用于改组ompA模板扩增的引物序列
E.coli ompA-Ι是从 1 ~745 bp，E.coli ompA-2是从746~1041 bp，E. tardaompA -1 是从 1 ~760 bp，E. tardaompA _2是从761 ~1056 bp〇
[0022] 以已经构建好的6种OmpA重组质粒为模板，以各自引物扩增出各自全长OmpA基因， 得到了相应的8个基因片段，长度与预期一致，结果见图2。
[0023] 改组OmpA基因的获得：回收PCR产物，等量混合8个OmpA基因片段，然后用DNasel进 行消化，结果见图3A。从图中可以看出，DNasel将OmpA混合片段酶切成大约50~100bp的小 片段DNA。然后以回收的小片段DNA(50bp~100bp)为模板，先不加引物进行PCR扩增，得到了 弥散型条带（图3B)，再以无引物PCR获得的产物为模板，加入溶藻弧菌外膜蛋白OmpA基因 (VA0764)特定引物（上游引物：5 ' -GCCGGATCCATGAAAAAACTAGCAGCGG-3 '，下游引物：5 ' -GGGCTCGAGTTATTGCTGAACTTGG-3 '，下划线所示为酶切位点，上游引物引入BamH I位点，下 游引物引入XhoI位点），继续进行PCR扩增，结果见图3C。由图中看出，通过弧菌特异引物PCR 得到了大约1000 bp的特异性条带，表明得到了OmpA改组基因，命名为ompAs。
[0024] 实施例3改组OmpA基因的原核质粒库构建 将获得的OmpA改组基因 （ompAs )产物回收后，用BamHI和Xho I进行双酶切，并用同样的 内切酶对原核表达载体pET32a也进行双酶切，连接后转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞 中，涂布于含60微克/毫升Amp抗生素的LB平板上，获得1542个重组子。
[0025] 快速法筛选阳