专利名称：一种蛋白印记膜再生液的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白印记膜再生液的制备方法，属于生物检测技术领域。
背景技术：
蛋白印迹是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，其基本 原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色 的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。具体试验 方法为经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素膜 或聚偏氟乙烯膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类 型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反 应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离 的特异性目的基因表达的蛋白成分。在蛋白印记中完成了一抗二抗结合和后续的化学发光检测后，有时还需要检测其 它蛋白进行比较。蛋白印迹膜再生液中的特殊成份可解离膜上抗原与抗体的结合，但不影 响转移到膜上的蛋白，随后，可以使用不同的抗体进行下一轮蛋白印记实验，检测其它蛋 白。当需要进行多次蛋白检测时，采用本方法与重新电泳、转膜相比，不仅节省样品、材料和 时间还可以消除重新上样带来的误差，增强试验的可比性。传统分子克隆上介绍的蛋白印记膜再生方法对抗原洗脱强度过大，常常会导致转 移到固相载体例如硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯膜)上的蛋白信号的减弱。并且含有刺激性 强的化学物质巯基乙醇，操作不慎会对操作人员造成危害。而且传统的配方需要操作时间 较长。
发明内容
本发明的目的是提出一种蛋白印记膜再生液的制备方法，以适用于蛋白印记经过 化学发光检测的硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯膜的重复利用，使得同一张硝酸纤维素膜或聚 偏氟乙烯膜可以采用不同种类的抗体进行下一轮蛋白印记检测。本发明提出的蛋白印记膜再生液的制备方法，包括以下步骤(1)将甘氨酸和十二烷基磺酸钠分别称量，并配制成水溶液，使甘氨酸的摩尔浓度 为20毫摩尔/升，十二烷基磺酸钠的质量百分比浓度为；(2)用盐酸调节上述水溶液的PH值为2。本发明提出的蛋白印记膜再生液的制备方法，其优点是1、在蛋白印记中完成了一抗二抗结合和后续的化学发光检测后，有时还需要检测 其它蛋白进行比较。本发明方法制备的蛋白印记膜再生液中的特殊成分可以解离膜上抗原 和抗体的结合，避免对转移到膜上的抗原蛋白产生影响，使得同一张膜可以采用不同种类 的抗体进行下一轮蛋白印记检测。2、用本发明方法制备的蛋白印记膜再生液的效力强，能高效特异地解离抗原与抗体的结合，但对结合到膜上的蛋白作用温和，几乎不会影响膜上的蛋白。3、本发明方法制备的蛋白印记膜再生液中不含有β-巯基乙醇，无毒无味，对实验操作者没有毒害。4、本发明方法制备的蛋白印记膜再生液使用方法简单，(什么操作)操作快速，比 传统的方法简便快捷。5、本发明方法制备的蛋白印记膜再生液储存方便，可以室温保存。
具体实施例方式本发明提出的蛋白印记膜再生液的制备方法，包括以下步骤(1)将甘氨酸和十二烷基磺酸钠分别称量，并配制成水溶液，使甘氨酸的摩尔浓度 为25毫摩尔/升，十二烷基磺酸钠的质量百分比浓度为；(2)用盐酸调节上述水溶液的ρΗ值至2。以下是本发明方法的实施例实施例1 配制1升蛋白印记膜再生液的方法(1)分别称量1. 5克甘氨酸和10克十二烷基磺酸钠；(2)加入一定体积的超纯水，完全溶解；(3)用盐酸调节ρΗ值至2 ；(4)补加超纯水定容至1升。实施例2 配制10升蛋白印记膜再生液的方法(1)用天平分别称量15克甘氨酸和100克十二烷基磺酸钠；(2)加入一定体积的超纯水，完全溶解；(3)用盐酸调节ρΗ值至2 ；(4)加超纯水定容至10升。以下介绍本发明方法制备的蛋白印记膜再生液的使用方法1、将蛋白印记实验中经过化学发光法检测的硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯膜充分 浸入本发明方法制备的蛋白印记膜再生液中，室温孵育15-30分钟并摇动。注意优化孵育时间和温度可以获得较佳的结果，通常，高亲和力的抗体将会需要 更长的洗膜时间如30分钟以上，在37度孵育会获得较好效果。2、取出硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯膜，用磷酸盐缓冲液冲洗膜一次，然后摇动洗 涤5-10分钟。3、检测抗体是否去除的方法如下(1)检测是否完全去除辣根过氧化物酶标记二抗将硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯 膜置于新的蛋白印记膜再生液中，洗膜，X光胶片曝光并显影，如果胶片上没有显示条带，说 明二抗已经成功地从抗原或者一抗上去除；(2)检测是否完全去除一抗将硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯膜孵育在辣根过氧化 物酶标记的二抗中，用洗涤缓冲液洗涤，X光胶片曝光并显影，胶片上没有显示条带，说明一 抗已经去除。
4、如果步骤3检测到条带，则需重复步骤2，再次洗涤5-15分钟。注意许多抗原抗体系统需要增加温度或者延长时间才能完全去除。优化洗膜时 间和温度来确保完全去除抗体而不破坏抗原。5、在确定硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯膜上抗体已经完全洗掉后 ，重新封闭，即可 以进行下一轮蛋白印记实验。
权利要求
一种蛋白印记膜再生液的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)将甘氨酸和十二烷基磺酸钠分别称量，并配制成水溶液，使甘氨酸的摩尔浓度为20毫摩尔/升，十二烷基磺酸钠的质量百分比浓度为1％；(2)用盐酸调节上述水溶液的pH值为2。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白印记膜再生液的制备方法，属于生物检测技术领域。首先将甘氨酸和十二烷基磺酸钠分别称量，并配制成水溶液，使甘氨酸的摩尔浓度为20毫摩尔/升，十二烷基磺酸钠的质量百分比浓度为1％；用盐酸调节上述水溶液的pH值为2。用本发明方法制备的蛋白印记膜再生液的效力强，能高效特异地解离抗原与抗体的结合，但对结合到膜上的蛋白作用温和；再生液中不含有β-巯基乙醇，无毒无味，对实验操作者没有毒害；使用方法简单，操作快速；储存方便，可以室温保存。
文档编号G01N33/68GK101833008SQ201010129820
公开日2010年9月15日 申请日期2010年3月19日 优先权日2010年3月19日
发明者俞萍, 孙克非, 李晓晨, 龙晶 申请人:天根生化科技(北京)有限公司